养殖红鳍东方鲀可追溯性信息模型的构建

以养殖红鳍东方鲀Takifugu rubripes为例,通过对案例进行实地调查,系统地分析了中国现有河豚鱼的供应链安全管理状况。首先,沿着供应链开展每个环节的操作要点分析,并对现有的信息记录现状进行了归纳总结;然后,根据对产业链的实地调查结果,结合河豚鱼食品安全的特殊性,确定了与全链可追溯性密切相关的11个关键环节;最后,通过借鉴欧盟水产品可追溯体系管理模式,结合中国国情,围绕要规范的11个关键环节,制订了对每个环节可追溯性管理规范的必要信息细则模式。本研究中所建立的养殖红鳍东方鲀可追溯性信息模型,对于规范中国河豚鱼供应链的安全管理机制具有重要的实践指导意义。     

红鳍东方鲀微卫星DNA多态性初步分析

用红鳍东方(Takifugu rubripes)微卫星标记对两个不同群体红鳍东方的DNA多态性进行分析。经20对引物的扩增,得到每个个体的微卫星片段,其中16对引物能扩增出较好的谱带。用2%的琼脂糖凝胶电泳检测微卫星标记的PCR扩增产物,并对扩增结果进行了统计分析。计算得到两个群体的平均等位基因数分别为1.875 0和2.437 5;多态信息含量(PIC)平均值分别为0.275 1和0.379 4;平均杂合度观测值分别为0.025和0.200。统计结果初步表明两个不同群体平均杂合度较低,遗传多态性不高。     

红鳍东方鲀IgM重组表达与多克隆抗体制备

红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）是我国重要的海水养殖经济鱼类,探究红鳍东方鲀IgM的结构与功能对其病害防治与免疫系统的研究均有重要意义。本研究克隆获取了红鳍东方鲀IgM的重（H）链恒定（C）区序列,序列大小为1326bp,编码442个氨基酸,将获得的IgM序列连接至pET28a表达载体上,利用大肠杆菌BL21进行体外重组表达,SDS-PAGE结果显示：重组蛋白红鳍东方鲀IgM（TrIgM）大小约为62kDa,重组表达的IgM主要以包涵体形式表达。通过体外复性获得可溶性TrIgM蛋白, 将制备的TrIgM蛋白免疫BALB/c小鼠,获得了TrIgM鼠抗血清,Western blot检测结果表明：制备的鼠抗血清可以与重组TrIgM蛋白和红鳍东方鲀天然血清中的IgM的重链蛋白特异性结合。本研究中制备的抗血清可作为检测红鳍东方鲀IgM的特异性抗体,为红鳍东方鲀相关免疫检测提供基础。     

饥饿对红鳍东方鲀免疫细胞功能的影响

对红鳍东方鲀Fugu rubripes进行正常投喂和饥饿处理(10、20、30、40 d)后,测定红鳍东方鲀外周血中白细胞数量以及脾脏中淋巴细胞的转化率和巨噬细胞的吞噬率。结果表明:饥饿后红鳍东方鲀外周血中白细胞的数量明显高于正常投喂组,且在饥饿20 d时白细胞的数量达到最大值;饥饿后脾脏中淋巴细胞的增殖转化能力与转化率比正常投喂组高,饥饿10 d时达到最大值,随着饥饿时间的延长,淋巴细胞的转化率逐渐降低;饥饿后脾脏中巨噬细胞的吞噬活性与吞噬率均高于正常投喂组,且在饥饿20 d时达到最大值。     

红鳍东方鲀微卫星DNA多态性初步分析

用红鳍东方(Takifugu rubripes)微卫星标记对两个不同群体红鳍东方的DNA多态性进行分析。经20对引物的扩增,得到每个个体的微卫星片段,其中16对引物能扩增出较好的谱带。用2%的琼脂糖凝胶电泳检测微卫星标记的PCR扩增产物,并对扩增结果进行了统计分析。计算得到两个群体的平均等位基因数分别为1.875 0和2.437 5;多态信息含量(PIC)平均值分别为0.275 1和0.379 4;平均杂合度观测值分别为0.025和0.200。统计结果初步表明两个不同群体平均杂合度较低,遗传多态性不高。     

红鳍东方鲀与杂交鲀的性腺转录组比较分析

为分析红鳍东方鲀与杂交鲀(菊黄东方鲀♀×红鳍东方鲀♂)性腺发育的分子机制,该研究应用Illumina高通量测序技术对二者的卵巢和精巢组织进行转录组测序与生物信息学分析。结果表明:通过分析与筛选共得到差异表达基因(DEGs)4 157个(卵巢组织)和8 260个(精巢组织)。其中卵巢组织样本(O₂vsO₁)中表达上调的差异基因有1 912个,表达下调的有2 245个;精巢组织样本(T₂vsT₁)中表达上调的差异基因有4 234个,表达下调的有4 026个。通过GO功能注释与KEGG富集分析,在卵巢组织样本中(O₂vsO₁),差异表达基因主要归纳为93个功能类别与153条代谢通路;在精巢组织中(T₂vsT₁),差异表达基因可以主要归纳为73个功能类别与154条代谢通路,其中神经活性配体-受体相互作用过程、丝裂原活化蛋白激酶通路和钙信号通路的富集程度最高。该研究结果丰富了红鳍东方鲀与杂交鲀的转录组信息,为后续相关研究提...     

不同家系红鳍东方鲀形态差异研究

采用聚类分析、主成分分析和判别分析3种多元分析方法,结合传统形态学测定和框架测定,对红鳍东方鲀4个家系进行形态差异比较。主成分分析提取了9个主成分,累计贡献率为69.945%。通过对8个贡献率较大的形态变量进行逐步判别分析,建立了4个家系的判别公式,综合判别率为64.8%;聚类分析结果表明,家系3与家系4形态差异最小,可取其一。3种多元分析结果表明,红鳍东方鲀4个家系群体在形态上已经产生一定程度的差异,可以选取家系1、家系2、家系3进行进一步的选育。     

红鳍东方鲀鳍细胞系的建立及生长特性研究

为研究红鳍东方鲀Takifugu rubripes鳍细胞系对该鱼病毒病诊断和治疗的影响,采用组织块培养法启动红鳍东方鲀鳍组织细胞的原代培养,用胰蛋白酶消化法进行传代培养,目前红鳍东方鲀鳍细胞传至40代,为成纤维细胞样细胞,原代培养和早期传代培养使用的培养基为添加了20%胎牛血清的DMEM/F12高糖培养基,添加的生长因子分别为终浓度为10 ng/m L的人碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)、终浓度为20 ng/m L的Ⅰ型胰岛素样生长因子和终浓度为20μg/m L的硫酸软骨素,30代以后使用含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基,将细胞于25℃、5%CO2恒温培养箱中培养。结果表明:生长曲线显示,细胞在0～2d内处于潜伏期,2～4 d时进入对数期,4～5 d时进入平台期,5 d后开始转入衰退期;红鳍东方鲀鳍细胞系的倍增时间为50. 24 h;细胞经超低温保存60 d,解冻复苏后测定其存活率为80%;经微卫星位点扩增,凝胶电泳后的条带证实细胞系来源于红鳍东方鲀。研究表明,红鳍东方鲀鳍细胞系的建立丰富了鱼类细胞系的种类,也为红鳍东方鲀病毒病的研究及疫苗制备等提供了数据资料。     

3个线粒体基因在红鳍东方鲀和暗纹东方鲀中的比较分析

由于形态学无法更精准地鉴别部分红鳍东方鲀和暗纹东方鲀,因此需要通过分子手段鉴别此类无法直观辨认的东方鲀。该研究以15尾红鳍东方鲀和30尾暗纹东方鲀为材料,使用NCBI上红鳍东方鲀和暗纹东方鲀的线粒体全基因组中3个基因COⅠ、COⅡ、COⅢ保守区域通过Primer 5.0进行引物设计。将45个样品在摸索得到的最适条件下进行扩增并测序,对测序结果进行检验,分析种间差异并进行碱基组成性分析,得出COⅠ上有9个SNPs,COⅡ上有4个SNPs,COⅢ有10个SNPs,使用MEGA-X进行进化树分析得出,该研究所设计的引物可以有效地鉴别2种东方鲀。     

红鳍东方鲀鱼卵孵化和育苗试验

红鳍东方鲀（Fugurubripes）属鲀形目（Telraodontiformes），东方鲀属（Fugu），以日本沿海为主要分布中心[成庆泰等，1975]，在我国沿海自然数量较少，日渐罕见[雷霁霖等，1992]。由于与假睛东方鲀（Fugupseudommus）的形态、习性、种间关系相近等常混杂在一起，种群数量小，亲鱼来源越来越困难。同时对日本出口常引起鱼种纠纷。鉴于此，我们承担了农业部下达的“九五”引种课题，1996年5月24日从日本引进了红鳍东方鲀受精卵10000粒，5月26日抵达青岛小麦岛试验基地，并在该基地进行了人工孵化和幼鱼培育。1材料与方法1．1小麦岛试验基…     

利用微卫星标记指导红鳍东方鲀亲本选配

为制定红鳍东方鲀家系配组方案提供可行性指导,利用微卫星标记辅助红鳍东方鲀Takifugu rubripes家系的建立,选择34个微卫星标记对红鳍东方鲀两个群体进行遗传评估。结果表明:A群体的平均等位基因数(Na)和Nei基因多样性指数(He)分别为6.647 0和0.711 5,B群体的相应值分别为4.647 1和0.646 1,且两个群体之间的遗传差异达到显著性水平(P0.05);群体间的遗传分化系数(GST)为0.050 7,基因流(Nm)为4.679 6,表明红鳍东方鲀群体间存在低程度的遗传分化和一定程度的基因交流;分子方差分析(AMOVA)表明,遗传变异主要存在于群体内,所占比例为78.49%,而群体之间仅占21.51%;根据群体间Nei氏遗传距离构建UPGMA系统树,群体内个体之间的遗传距离为0.11~0.82,依据遗传距离的远近将全部个体分成多个分支,不同分支内含有数个个体;各项遗传参数表明,试验群体具备一定程度的遗传变异,不同个体之间拥有相对较远的亲缘关系,可以根据个体之间遗传距离制定育种计划,建立家系进行选育研究。研究表明,利用微卫星标记信息构建红鳍东方鲀家系的方法是切实可行的。     

基于供应链的奶牛养殖环节信息追溯研究

养殖环节是乳制品供应链的源头,为了促进乳制品行业的健康发展,对养殖环节进行信息追溯对整个乳制品追溯体系的建立起到至关重要的作用。在分析整条乳制品供应链的基础上,对其中的奶牛养殖环节进行详细分析,从中提取出追溯系统所需要记录的信息,并设计出乳制品供应链的信息追溯过程图和系统功能图,同时立足于企业的实际需求,从供应链的角度袁提出基于DHI系统、Alpro系统和ERP系统的追溯模式。     

红鳍东方鲀SREBP-1基因的电子克隆及生物信息学分析

利用斑马鱼的SREBP-1 的氨基酸序列NP_001098599.1 为探针,对红鳍东方鲀基因组数据库进行BLAST 分析,获得红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）的固醇调节元件结合蛋白-1 （Sterol regulatory element bindingprotein-1,SREBP-1）的cDNA 序列及相应的氨基酸序列。采用生物信息学方法对其基本理化性质、蛋白质结构及功能结构域进行分析。结果发现红鳍东方鲀SREBP-1 基因的开放阅读框全长3 330 bp,共编码1 109 个氨基酸;红鳍东方鲀SREBP-1 的氨基酸序列与黄斑蓝子鱼、大西洋鲑、斑马鱼、人、牛及原鸡的同源性分别为81%、73%、72%、55%、55%、54%和54%;系统进化分析结果表明,红鳍东方鲀SREBP-1 与黄斑蓝子鱼的进化关系最为密切,亲缘关系最近;红鳍东方鲀SREBP-1 蛋白中α-螺旋较多,该蛋白质氨基端包含1 个bHLH-zip 的结构。     

红鳍东方鲀SREBP-1基因的电子克隆及生物信息学分析

利用斑马鱼的SREBP-1的氨基酸序列NP_001098599.1为探针,对红鳍东方鲀基因组数据库进行BLAST分析,获得红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)的固醇调节元件结合蛋白-1 (Sterol regulatory element binding protein-1,SREBP-1)的cDNA序列及相应的氨基酸序列.采用生物信息学方法对其基本理化性质、蛋白质结构及功能结构域进行分析.结果发现红鳍东方纯SREBP-1基因的开放阅读框全长3 330 bp,共编码1 109个氨基酸;红鳍东方鲀SREBP-1的氨基酸序列与黄斑蓝子鱼、大西洋鲑、斑马鱼、人、牛及原鸡的同源性分别为81％、73％、72％、55％ 、55％、54％和54％;系统进化分析结果表明,红鳍东方纯SREBP-1与黄斑蓝子鱼的进化关系最为密切,亲缘关系最近;红鳍东方鲀SREBP-1蛋白中α-螺旋较多,该蛋白质氨基端包含1个bHLH-zip的结构.     

河豚4SNc-Tudor蛋白的鉴定及生物信息分析

［目的］对河豚4SNc Tudor蛋白（SN4TDR）进行序列与结构相关的生物信息分析,为认识该蛋白结构与功能提供借鉴。［方法］应用双向电泳及基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱（MALDI TOF MS）技术,从河豚肝脏总蛋白中鉴定到河豚的4SNc Tudor结构域蛋白。并对其进行生物信息学分析。［结果］首次从河豚肝脏总蛋白中鉴定到河豚的4SNc Tudor结构域蛋白SN4TDR。河豚SN4TDR定位于细胞质,无信号肽,为非分泌蛋白,有多个磷酸化位点。蛋白SN4TDR存在α 螺旋、β 折叠和无规则卷曲结构,有一个可能形成跨膜结构的片段。并用同源建模的方法,预测了河豚SN4TDR的三维结构模型。［结论］分析河豚SN4TDR基因及蛋白结构,有助于进一步研究该蛋白及其基因的分子和生物学功能。     

红鳍东方鲀防御素db-1基因的原核表达分析

采用原核表达方法高效表达红鳍东方鲀Takifugu rubripes防御素db-1基因,并获得该基因的重组表达产物。通过RT-PCR扩增获得红鳍东方鲀防御素db-1基因成熟肽编码序列,将其连入pET32a+载体,构建原核表达载体pET32a-m DB-1,然后将其转入至大肠杆菌表达菌株Rosetta(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导目的基因表达,通过SDS-PAGE和Western Blotting检测该蛋白,并利用Ni-NTA亲和层析纯化该蛋白,最后以Anti-Mus defensin Beta2抗体为探针的Elisa反应鉴定该蛋白。结果表明:红鳍东方鲀db-1基因在大肠杆菌中高效表达,并纯化得到了这种重组防御素融合蛋白。本研究中提供了一种简单、高效获取重组防御素蛋白的方法,可为其应用和生产提供支持。     

冷休克诱导红鳍东方鲀雄核发育单倍体的条件优化

为探索无需卵子失活仅用冷休克方法诱导雄核发育单倍体,以红鳍东方鲀Takifugu rubripes为研究对象,试验选用L_9(3~4)设计,进行3因素3水平的正交试验,处理温度设为0、2、4℃,处理持续时间设为30、45、60 min,处理起始时间设为2、5、8 min,共9个试验组,并对其后代采用单个胚胎染色体计数法进行染色体数目统计及微卫星分析。结果表明:冷休克诱导得到的单倍体率最高为第7试验组和第9试验组,分别为受精后8 min在4℃下处理30 min和受精后5 min在4℃下处理60 min,单倍体率分别为86.7%和80.0%;根据正交试验直观分析结果,得出冷休克诱导红鳍东方鲀雄核发育单倍体的3因素最优组合为处理温度4℃、处理持续时间60 min、处理起始时间8 min;影响冷休克诱导单倍体的3因素主次顺序为处理温度处理起始时间处理持续时间;微卫星分析结果表明,单倍体携带的遗传基因全部为父本的遗传基因。研究表明,仅用冷休克方法可以成功诱导红鳍东方鲀雄核发育单倍体,雄核发育单倍体率高达86.7%,为进一步研究诱导红鳍东方鲀雄核发育二倍体奠定了基础。     

红鳍东方鲀仔鱼期摄食与生长的研究

在水温 ( 1 6± 1 )℃条件下 ,红鳍东方 (Takifugurubripes)仔鱼孵出后 4d开始摄食 ,此时其卵黄囊体积由初孵时的 0 636mm3减少到 0 375mm3;1 2d时 ,卵黄完全耗尽。最高初次摄食率出现在卵黄耗尽时 ,可达 1 0 0 % ;仔鱼能维持 9d高达 90 %以上的初次摄食率。初次摄食强度最大值也出现在 1 2d。饥饿不可逆点 (PNR)出现在 1 5～ 1 6d。在内营养期日平均增长率为 0 2 1 7mm/d ;在PNR前的摄食期 ,饥饿仔鱼的日平均生长率为 0 0 1 7mm/d ;而摄食仔鱼的日平均生长率为 0 0 95mm/d ;PNR后至死亡前 ,饥饿仔鱼呈负增长 ,而摄食仔鱼的日平均生长率达 0 41 0mm/d。     

非离子氨对红鳍东方鲀的急性毒性研究

采用半静水生物测试法,研究pH值为7.5～7.7,溶氧7 mg/L,盐度32,温度(24.3±2)℃条件下非离子氨对红鳍东方鲀的急性毒性。试验鱼体质量为(8.5±0.5)g。急性试验设定氨氮浓度梯度为0、56.99、64.89、73.84、84.10、95.74、109.00mg/L,对应的非离子氨浓度分别为0、0.95、1.08、1.23、1.40、1.59、1.81 mg/L。结果表明:在急性试验中,氨氮对红鳍东方鲀产生了毒性,暴露24、48、72、96 h LC50分别为97.61、87.22、78.62、72.38 mg/L,安全浓度为7.24 mg/L。非离子氨对红鳍东方鲀的24、48、72、96 h LC50分别为1.62、1.45、1.31、1.20 mg/L,安全浓度为0.12 mg/L。