农杆菌介导海岛棉胚性愈伤组织遗传转化影响因素分析

以3个栽培海岛棉品种新海30、新海24、新海16诱导而来的胚性愈伤组织为受体材料,分析了3种农杆菌菌株EHA105、LBA4404、GV3101和3种已构建质粒pCAMBIA1301、pCAMBIA1304、pBI121对已建立的农杆菌介导海岛棉外源基因转化体系的影响。研究结果表明,菌种和质粒对转化率有极其显著的影响,而两者之间的互作关系也比较显著。最终得到农杆菌介导转化海岛棉胚性愈伤组织的最佳菌种和质粒是GV3101和pBI121。     

农杆菌介导玉米幼胚愈伤组织遗传转化体系的优化

以玉米骨干自交系‘郑58’的幼胚为材料,用农杆菌介导法对诱导培养出的胚性愈伤组织进行三价植物表达载体的遗传转化,同时对影响转化效率的主要因素进行研究.结果表明,当浸染液和共培养培养基中乙酰丁香酮(AS)的浓度为150mg·L-1时,抗性愈伤组织获得率显著提高17.39%;在菌液浓度D600为0.3、浸染时间为20min、共培养时间为60h、共培养温度为22℃、共培养培养基pH为5.4以及头孢霉素浓度为400mg·L-1的试验体系下,有利于提高玉米抗性愈伤组织的获得率,其获得率最高可达17.26%.     

农杆菌介导的茄子愈伤组织遗传转化研究

以茄子愈伤组织为材料,在优化愈伤组织成苗培养基的基础上,采用正交试验,进行农杆菌介导的茄子愈伤组织遗传转化研究.结果显示,在MS+6-BA(1 mg·L-1)+IAA(0.2 mg·L-1)+KT(1.5 mg·L-1)的培养基上茄子的愈伤组织诱导成苗率最高.结果表明,影响茄子愈伤组织转化的主要因素是预培养时间,其次是侵染时间,再次是共培养时间,并且预培养9 d.侵染20 min,共培养1 d时转化率最高.分子检测表明,11株阳性植株中有7株成功扩出bar基因序列,说明这7株为转基因植株,转基因植株占阳性植株的比率为63.6%.     

农杆菌介导的番茄遗传转化体系优化

以番茄自交系AC++和番茄母本材料1448的子叶为外植体,采用农杆菌介导的方式接种于含有不同浓度玉米素(ZT)、吲哚-3-乙酸(IAA)和硝酸银(AgNO_3)的MS培养基上,以筛选适合番茄自交系AC++和1448的最佳遗传转化体系。结果显示,诱导愈伤组织及不定芽分化的最适培养基为MS+2.0 mg/L ZT+0.5 mg/L IAA+3 mg/L AgNO_3;诱导生根的最适培养基为1/2 MS+0.3 mg/L IAA。     

农杆菌介导的橡胶草遗传转化体系的建立

以橡胶草为试验材料,利用农杆菌介导法进行遗传转化研究。结果表明:50mg/L的卡那霉素(Kan)对橡胶草的抗性芽具有很好地筛选效果,生根筛选时,Kan的适宜质量浓度为35mg/L;最佳抑菌抗生素为羧苄青霉素(cb),适宜质量浓度为500mg/L,获得35株抗性试管苗,通过GUS染色及分子生物学检测,最终获得6株转基因植株,转化率为17.1%。可见,获得的橡胶草转基因植株,为橡胶草后续的遗传转化研究奠定了基础。     

农杆菌介导的高效水稻遗传转化体系的研究

以水稻基因组测序品种日本晴为研究材料,对根癌农杆菌介导的水稻转化系统进行了优化。结果表明,对水稻种子采用2.5%次氯酸钠灭菌30 min的处理,愈伤组织的诱导率最高;获得的胚性愈伤组织经过6-7 d的继代培养后再转化,转化效率最高;感染时,发杆菌浓度OD600值为0.145-0.190时,转化效率较高;将抗性愈伤组织进行7 d的暗培养将大大提高分化效率。对获得的大量转化体进行初步分析,GUS表达率达到30%。     

农杆菌介导的水稻高效遗传转化体系的建立

选用５个水稻品种（０２４２８,武育粳２号,台北３０９,Ｍｉｌｌｉｎ和明恢６３）,通过农杆菌介导的转化方法,从前４个水稻品种中获得了来自３０９个独立抗性愈伤的的６３５棵再生植株,包括４２２株ＰＳＡＧ１２－ＩＰＴ转基因植株和２１２株ＰＳＡＧ１２＿ＧＵＳ转基因植株,经组织化学检测和ＰＣＲ分析,获得的４２２株ＰＳＡＧ１２－ＩＰＴ转基因樾株和２１２株ＰＳＡＧ１２－ＧＳ转基因植株,经组织化学芳觳夂停校茫曳治觯     

农杆菌介导的玉米愈伤组织遗传转化影响因子和植株再生条件

以HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料的幼胚诱导的胚性愈伤为转化受体,利用农杆菌介导转化的方法,将抗粗缩病RNA干扰基因导入玉米愈伤组织,并对影响转化的因素进行研究,以优化遗传转化体系。结果表明:继代3次的4种玉米材料的抗性愈伤率最高,且不同品种间存在差异,HiⅡ的抗性愈伤率最高,为31.25%,其次为HiⅡB(26.56%)、HiⅡA(24.45%),H99的抗性愈伤率最低,仅为10.26%;预培养6 d的愈伤组织适于转化,其中HiⅡ的抗性愈伤率最高,为27.70%;结果还表明,菌液浓度D600 nm=0.5~0.6是最佳的转化条件。通过优化后的条件对得到的抗性愈伤用除草剂进行筛选,HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99材料分别得到10、5、4、3块抗性愈伤组织;标记基因为bar基因,通过PCR检测分别得到5、2、2、1块阳性愈伤组织,再进一步用bar基因试纸条检测,分别得到4、1、2、1株阳性植株。     

农杆菌介导花生胚小叶遗传转化体系的优化研究

花生是我国重要的油料作物和经济作物,但较低的遗传转化效率阻碍了花生基因工程的发展。因此,建立高效的花生转化体系是目前的研究热点之一。基于教育部华北作物种质资源研究与利用重点实验室建立的花生胚小叶高效再生体系,本研究对农杆菌介导的遗传转化过程中菌液浓度、侵染时间及共培养时间对抗性丛生芽效率的影响进行探讨,旨在优化遗传转化条件,提高花生转基因的遗传转化效率。结果表明,3个因素均对抗丛生芽诱导率有显著影响,其诱导效应是共培养时间>侵染时间>菌液OD值。根据研究得到农杆菌介导花生胚小叶转化的最佳条件是菌液OD值0.5、侵染时间25min、共培养时间3d。     

利用农杆菌侵染花柱头法进行海岛棉遗传转化

[目的]探索一种更为高效、简便的海岛棉遗传转化技术,为海岛棉转基因育种提供技术支持。[方法]采用农杆菌侵染花柱头法,在不同时间侵染对4个海岛棉品种进行遗传转化,分析其对海岛棉的成铃率,田间卡那霉素抗性率及PCR阳性株率的影响。[结果]农杆菌侵染花柱头法的平均成铃率为12.60%,田间卡那霉素检测的平均抗性率为9.87%,PCR鉴定的平均阳性株率为1.72%。花后12 h进行转化,成铃率、抗性率和阳性株率均最高,分别为20.25%、11.68%和2.59%。[结论]在花后12 h利用农杆菌侵染花柱头法进行海岛棉遗传转化,转化效率最高。     

新疆海岛棉胚性愈伤组织培养体系

【目的】 研究新疆海岛棉不同材料愈伤组织培养体系,筛选再生能力强的海岛棉材料,为新疆海岛棉基因工程育种提供参考。【方法】 以105份新疆海岛棉为材料,利用改良后的MS培养基对下胚轴共培养,在2,4-D诱导培养基中诱导分化产生愈伤组织,浸染农杆菌介导的红色荧光蛋白,验证转化效果。【结果】 海岛棉材料愈伤组织的增殖速率与其基因型有关,改良后的MS共培养基、2,4-D诱导培养基可有效用于新疆海岛棉共培养和胚性愈伤组织增殖;愈伤组织增殖的适宜培养时间为4个月,时间过长不利于其增殖;愈伤增殖速度与转化率呈正相关,增殖快的材料其红色荧光蛋白的转化率较高;筛选出2份增殖快且转化率好的海岛棉材料。【结论】 建立了新疆海岛棉胚性愈伤组织培养体系与鉴定方法,筛选出9份愈伤增殖好、且能够有效转化的海岛棉材料。     

海岛棉一个成花素类似基因的克隆和生物信息学分析

[目的]海岛棉成花素类似基因的克隆及生物信息学分析.[方法]利用RT - PCR技术,从海岛棉中克隆成花素FLOWERING LOCUST(FT)的同源基因,并进行生物信息学分析.[结果]从新海14号花后15 d纤维中,克隆到一个棉花成花素类似基因FLOWERING LOCUS T- LIKE1,命名为GbFTL1.该基因的开放阅读框为525 bp,编码174个氨基酸.蛋白比对表明bFTL1和AtFT的相似性为79.3;,和陆地棉GhFTL1的相似性为99.4;,GbFTL1第37位氨基酸为Asn(N),而GhFTL1第37位氨基酸为Ser(S).GbFTL1含有FT蛋白亚家族两个关键的氨基酸残基及14个保守氨基酸,系统进化树分析表明GbFTL1属于FT亚家族成员.[结论]GbFTL1基因可能为海岛棉中促进开花的基因之一.     

海岛棉GbCO基因的克隆和表达分析

[目的]海岛棉GbCO基因的克隆和表达分析.[方法]利用RT-PCR技术,从海岛棉中克隆CONSTANS(CO)的同源基因,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析基因的组织表达.[结果]从新海14号花后9d的纤维中克隆得到了一个棉花CO蛋白基因,命名为GbCO.GbCO cDNA的ORF为1 008 bp,编码335个氨基酸.序列分析表明GbCO和GhCO的相似性只有78.2;,棉花CO蛋白同蓖麻RcCO、苹果MaCO等亲缘关系较为接近.qRT-PCR结果表明,GbCO基因在棉花的根、茎、叶、花瓣等组织中均有表达,但在叶片中的表达相对较高.并且CbCO在棉花胚珠及纤维发育的起始和伸长阶段都有表达,在开花前1d和开花后5d的胚珠中表达量很高.GbCO基因的表达受到光周期的调节,在夜间表达量高于白天.[结论]GbCO基因可能在陆地棉的开花发育中起着重要的作用.     

盐胁迫对海岛棉种子活力的影响

【目的】 研究不同基因型海岛棉萌发期的耐盐特性,分析盐胁迫下海岛棉种子活力指标的变化规律,为培育耐盐海岛棉品种提供支持。【方法】 以35份海岛棉种子作为材料,以NaCl溶液(150 mmol/L)模拟盐胁迫条件,统计分析发芽势、发芽率、根长、下胚轴长、苗鲜重、苗干重6项指标。【结果】 (1)盐胁迫条件下,海岛棉种子各指标受影响程度不同,其中下胚轴受影响程度最大,苗干重受影响最小;(2)与对照样本比较,其中发芽势、发芽率、根长、下胚轴长、苗鲜重5项指标最大值、最小值、平均数均低于对照,苗干重的最大值、最小值、平均值则高于对照。【结论】 35份海岛棉种子分为3类:第Ⅰ类属于高耐盐品种,第Ⅱ类属于中等耐盐品种,第Ⅲ类属于低耐盐品种。     

以GFP为报告基因优化农杆菌介导海岛棉转基因体系的研究

为了进一步建立优化的根癌农杆菌介导海岛棉外源基因转化体系,提高海岛棉外源基因转化率。以生理状态基本一致的海岛棉新海30号的胚性愈伤组织为受体材料,以绿色荧光蛋白基因（GFP）为报告基因,将浸染时间和共培养时间作为试验要素,筛选适宜的浸染时间和共培养时间。结果表明,根癌农杆菌介导的海岛棉外源基因转化体系的最佳浸泡时间为15 min,共培养时间为24 h。     

南疆陆地棉与海岛棉光合-光响应及叶绿素荧光特性分析

以南疆棉区主栽的陆地棉品种中棉所35号及海岛棉品种新海21号为供试材料,测定了吐絮期倒1叶、倒2叶光合生理生态参数对不同光照强度(PPFD 0~3 200μmolphotonsm-2s-1)的响应和叶绿素荧光参数。结果表明光合-光响应曲线符合非直角双曲线函数,陆地棉的最大光合速率Amax、暗呼吸速率Rd、光补偿点LCP、光饱和点LSP高于海岛棉,而表观量子效率AQY低于海岛棉;随着光合有效辐射通量密度PPFD的增加,蒸腾速率Tr与气孔导度Gs直线上升。在PPFD低于1 000photonsm-2s-1的范围内,Pn、Pn/Ci、WUE呈上升的趋势,超过该值之后开始缓慢下降;而Ci随PPFD的增加,先急剧下降再缓慢上升。这些说明在约全日照1/2左右光强以下时,随着PPFD的增加,光强对CO2、H2O气体交换、叶肉细胞光合能力及水分利用效率均有促进作用,超过一定光强之后,光合作用出现光饱和现象,WUE、叶肉细胞的光合能力也呈下降趋势。叶绿素荧光参数,陆地棉除了初始荧光Fo较大以外,PSⅡ原初光能转换效率Fv/Fm、PSⅡ的潜在活性Fv/Fo、非循环电子传递速率ETR都比海岛棉要低,而PSⅡ实际的光化学反应量子效率ΦPSⅡ、光化学猝灭系数qP、非光化学猝灭系数NPQ在两品种之间无显著差异。总体来说,在吐絮期陆地棉对高光强光能的利用能力强于海岛棉,而对低光强光能的利用能力弱于海岛棉,棉花不同叶位对光能的利用能力也存在着差异,并因品种的不同而不同。     

海岛棉GbHCT10基因的克隆与表达分析

[目的]研究海岛棉(Gossypium barbadense)GbHCT10基因在棉纤维发育中的作用.[方法]以海岛棉品种新海21号纤维发育第5 d的样本作为材料,根据海岛棉GbHCT10基因序列设计一对引物,利用RT-PCR技术从中克隆GbHCT10核苷酸序列.利用生物信息学方法分析GbHCT10基因序列.[结果]采...     

Genetic Dissection of Net Effects Between Yield and Its Components in Sea Island Cotton (Gossypium barbadense L.)

The number of bolls,individual boll weight,and lint percentage are three important yield components of lint yield of cotton.In the present study,nine parents,twenty F1,and twenty F2 crosses of intraspecific hybrids of sea island cotton (Gossypium barbadense L.) were grown at Tarim University,Alar,Xinjiang,China,in 2000 and 2001.Lint yield and its three component traits were measured and analyzed by an extended conditional mixed linear model approach.Lint percentage made the largest contribution to additive,additive x environment,and dominance x environment variations for lint yield.The contribution ratios of number of bolls,individual boll weight,and combined contribution of these two traits to additive x environment and dominance x environment variations for lint yield were not statistically significant.Lint yield of different parents could be affected differently by lint percentage.Lint yield of some parents was closely correlated with lint percentage,whereas for other parents,the behavior of individual boll weight and number of bolls played much more important roles on lint yield than that of lint percentage.It was shown by the conditional and conventional predicted additive x environment interaction effects of parents that the environment condition could influence different parents with varied effects.     

农杆菌介导的海岛棉茎尖再生体系及其遗传转化影响因子的研究

采用根癌农杆菌LBA4404和EHA105介导,对海岛棉的茎尖再生体系及其转化影响因子进行了研究。茎尖培养与棉花体细胞胚胎发生相比,不同基因型的茎尖再生频率差异不明显;在9种不同的激素组合中,以6-BA0.5 mg/L NAA0.1 mg/L与1/2MSB5 IBA 0.1 mg/L对茎尖的再生效果较好;获得较高转化频率的海岛棉培养条件为:海岛苗茎尖在OD600值为0.6~0.8农杆菌菌液中感染20~30 min,共培养3 d后进行转接,在含有不同激素和抗生素的各类培养基中进行抑菌和筛选继代培养,选择压以50~150 mg/L梯度进行;农杆菌以EHA105菌株的转化效果较好;抗性苗用SDS-CTAB法提取其总DNA,进行PCR扩增检测,有7株PCR检测呈阳性反应。由此,初步证明外源抗虫基因已经进入到再生植株的细胞核中。