新的抗草甘膦转基因棉花获得的初报

抗除草剂棉花的培育具有重要的农业生产利用价值。以常规棉花材料为受体,对转化受体的愈伤和幼苗进行草甘膦抗性浓度梯度的筛选试验;在此基础上,利用自主知识产权的草甘膦基因进行多抗草甘膦转化试验,获得了具有草甘膦抗性的棉花再生植株。PCR检测结果表明,该基因已被成功转入棉花受体基因组中。该研究结果可为后续抗草甘膦棉花的选育研究提供必要的新种质资源。     

农杆菌介导的2mG_2-epsps基因转化玉米自交系18-599R幼胚的研究

【目的】对农杆菌介导的抗草甘膦新基因2 mG2-epsps转化玉米18-599R幼胚的体系进行优化,以获得具有明显草甘膦抗性的转基因植株。【方法】以玉米18-599R幼胚为受体,采用农杆菌介导法,对转化时的预处理条件、菌液浓度×浸染时间、草甘膦筛选浓度设置处理,以优化转化体系;并用PCR、实时荧光定量PCR和喷洒草甘膦鉴定外源基因在转基因植株中的表达情况。【结果】热激处理对抗性愈伤率没有明显的提高作用,离心处理会降低抗性愈伤率;菌液浓度为OD600=0.6,浸染时间为10 min时,平均抗性愈伤率最高,为37.33%;草甘膦浓度为2.0mmol/L是比较理想的筛选浓度;实验共得到46株再生植株,5株PCR检测呈阳性,阳性率为10.87%;实时荧光定量PCR表明外源基因在T2代植株的根、茎、叶中均有表达;对T2代转基因植株喷洒1.5g/L的草甘膦,表现出耐受性。【结论】实验成功将2 mG2-epsps导入18-599R基因组,并获得了明显的草甘膦抗性。     

农杆菌介导的抗草甘膦基因(sxglr-11)的玉米遗传转化

利用根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将抗草甘膦基因(sxglr-11)导入优良玉米再生系HiII,共转化幼胚1 673个,分化出再生苗67株,其中,28株移栽成活,经PCR检测13株为阳性植株,阳性率为46.4%。采用草甘膦浓度梯度筛选,确定了未转基因的对照植株的致死浓度范围为1%～2%。利用2%的草甘膦对T0转基因植株6～8叶龄苗的叶片进行涂抹,结果表明,阳性植株均具有草甘膦抗性。T1植株经2%草甘膦抗性筛选,转基因植株表现出3∶1的孟德尔分离方式。     

草甘膦为筛选标记的水稻高效遗传转化体系的建立

【目的】建立以日本晴愈伤组织为受体、草甘膦抗性基因CP4为选择标记基因的高效水稻遗传转化体系。【方法】以粳稻日本晴的成熟胚为试验材料,通过农杆菌介导法,将含有草甘膦抗性基因CP4的P1300载体转化日本晴的愈伤组织,分别用质量浓度为10、20和40 mg/L的草甘膦进行3轮抗性筛选,诱导分化和再生成苗;利用1 000 mg/L草甘膦对移栽成活的阳性苗进行抗性鉴定。【结果】获得145株转基因幼苗,PCR检测阳性株为128株,阳性率达88.27%;经过3轮抗性筛选后,转基因幼苗的阳性率提高;移栽成活的99株阳性苗中,65株表现为抗性,抗性率为65.66%。【结论】成功建立了以草甘膦为筛选标记的水稻转基因体系,该体系为水稻育种提供了材料,并对以抗草甘膦基因作为筛选标记的水稻转基因和一些基因功能验证提供了技术支持。     

转G10aroA棉花株系的获得及分子生物学鉴定

【目的】培育具有抗草甘膦除草剂的棉花材料具有极其重要的意义。利用农杆菌介导法在棉花中转入编码EPSPS酶的抗草甘膦除草剂基因G10aroA,通过体细胞愈伤诱导组织培养技术获得能够稳定遗传的转基因棉花株系材料。【方法】首先,利用不同草甘膦抗性筛选条件比较分析不同棉花受体材料的愈伤诱导效率;其次,以R15材料作为受体,利用含有G10aroA的农杆菌侵染下胚轴切段,在进行体细胞愈伤诱导的组织培养过程中通过草甘膦抗性筛选获得棉花再生植株,对获得的棉花再生植株进行纯合繁育。在此基础上,利用PCR扩增检测证实外源G10aroA在转基因植株中能够稳定遗传;利用RT-PCR分析其外源基因在转基因植株不同组织中的转录水平进行研究、并进一步利用Western-blot对转基因植株中外源蛋白的表达进行分析。【结果】在优化的草甘膦筛选条件下,以草甘膦浓度为2.5 mmol•L-1的抗性条件进行棉花愈伤诱导筛选并获得棉花再生植株;利用特异引物进行PCR检测结果表明,在检测的全部再生植株中,扩增得到1.8 kb预期大小目标条带的阳性株系32株,其中,收获的27个株系的外源目标基因能够在T0、T1转基因植株中稳定遗传;对G10aroA在转基因株系L12、L14的不同组织中的转录表达进行定量RT-PCR分析表明,外源G10aroA在转基因棉花植株的不同组织中表达具有差异,相对表达量高低依次为茎、苞叶、叶和花;另外,蛋白检测结果进一步表明,该外源基因能够在转基因株系L7、L12和L14中植株中正常表达为预期46 kD的EPSPS蛋白。【结论】通过农杆菌介导法转化外源抗草甘膦基因G10aroA,在草甘膦抗性条件下进行棉花体细胞诱导的组织培养,成功获得转外源G10aroA的棉花再生株系,并通过分子生物学方法研究证实外源G10aroA能够在T0、T1转基因株系中稳定遗传、转录以及表达。     

玉米胚性愈伤组织的遗传转化及耐草甘膦植株再生

以优良玉米自交系X2211的幼胚胚性愈伤组织为受体材料,采用农杆菌介导法将来自微生物荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)G2菌株的抗除草剂基因2mG2-epsps转入玉米愈伤组织细胞,转化后的细胞经草甘膦筛选,获得抗性愈伤组织并再生植株282株,成活86株,经特异PCR检测表明其中26株植株转入了2mG2-epsps基因,喷施0.125%除草剂试验检测表明,转基因植株具有良好的耐除草剂特性,为抗除草剂玉米新品种选育提供了较好的亲本材料。     

微弹轰击小麦幼胚愈伤组织的影响因素研究

【目的】优化小麦基因枪转化技术体系,为提高小麦基因枪转化效率提供参考。【方法】以小偃22为材料,采用基因枪法分析小麦幼胚愈伤组织诱导时间、微弹轰击金粉用量及筛选分化培养基类型对基因枪遗传转化频率的影响,并对转化植株进行了检测。【结果】在相同条件下,小麦幼胚经过9d的愈伤组织诱导时再生植株率最高,达到4.24%;同一条件下,金粉用量为60μg/枪的再生植株率最高,达到3.90%;使用1/2MS培养基添加NAA1.0mg/L和KT 1.0mg/L进行转化细胞筛选与分化的效果最好,再生植株率为3.72%;对转化抗性再生植株的特异PCR检测表明,目的基因已整合到小麦染色体组中。【结论】小麦幼胚通过9d的愈伤组织诱导,基因枪轰击金粉用量为60μg/枪,使用筛选分化培养基1/2MS+KT 1.0mg/L+NAA 1.0mg/L+双丙氨膦2.0mg/L+蔗糖30g/L+Ag 5.0g/L进行转化细胞的筛选与分化,可获得较高的抗性再生植株率。     

农杆菌介导的优良玉米自交系遗传转化体系的建立

以杂交育种中广泛使用的优良玉米自交系340,4112为材料，用带有质粒pGBIL04(actin.Bt.35S.bar)的根癌农杆菌LBA4404转化其幼胚及其初始愈伤组织，经PPT抗性筛选后分化再生植株，PCR分子检测初步证明Bt基因已整合到再生植株基因组中，转化率为1.68%-4.44%。本实验利用转化受体的抗性筛选频率对转化体系进行了优化，结果表明：比较适宜的感染液浓度为OD600=0.5；预培养有利于幼胚转化，预培养时间以刚刚诱导出新鲜稳定的初始愈伤为宜。适当降低共培养温度到22℃可以提高农杆菌介导的玉米遗传转化的筛选频率和PCR阳性率。     

根癌农杆菌介导的水稻两用不育系培矮64S遗传转化体系的建立

以水稻两用不育系培矮64S成熟胚为外植体,以不同组合培养基为诱导和继代培养基,建立了适合水稻培矮64S转化的高效再生体系,并通过农杆菌EHA105介导,将大肠杆菌C1基因转入培矮64S,获得再生植株.结果表明.J0N1D3为合适的愈伤组织诱导培养基,诱导率达56.44%;通过潮霉素筛选后,获得的抗性愈伤组织分化率为73.08%,经分化,获得133株再生植株;随机挑选67株再生植株经PER检测,其中46株检测到目的条带,阳性检出率占68.66%;对PCR阳性植株进行荧光定量实时PCR分析,结果表明C1基因能在转基因植株中表达.通过对T1代PCR分析,得到目的条带,表明C1基因能在转基因后代稳定遗传.     

高效农杆菌介导的紫花苜蓿遗传转化体系的建立

以农艺性状优良的紫花苜蓿品种“德宝”为转化受体,通过对外植体选择、bialaphos筛选浓度、预培养与共培养时间等因素进行优化,成功建立了高效苜蓿组织培养再生体系和农杆菌介导的遗传转化体系。试验结果表明,子叶作为外植体愈伤组织诱导频率最高,可达97%;bialaphos作为筛选标记,获得转化愈伤组织与转基因植株的最佳筛选浓度为2.5 mg/L;子叶在农杆菌浸染前的预培养对于对于抗性愈伤组织产生频率甚为关键,可由低于5%(未经过预培养)提高至30%以上(预培养3 d);子叶与农杆菌的共培养时间以3 d为最佳。按最佳条件转化共计获得100余株T0代抗性株系。PCR检测其中30个抗性株系,全部表现为阳性。对抗性植株和野生型植株叶片喷施5‰除草剂Basta溶液,阳性植株全部表现为除草剂抗性,进一步证实了建立的紫花苜蓿转化体系是高效、可靠的。     

菘蓝秋季光合特性

比较了15个不同居群菘蓝的光合色素含量、净光合速率差异及6个重点不同居群菘蓝净光合速率对光强的响应特性、7个典型居群的光合日变化.结果表明,叶缘无齿四倍体居群、叶缘具齿四倍体居群、叶片被蜡居群、甘蓝型居群光合色素含量较高,山东居群、山西居群、四川居群光合色素含量较低;甘蓝型菘蓝净光合速率(Pn)最高为23.27 μmol/(m2·s).四倍体净光合速率均高于二倍体.7个重点居群中四倍体类型菘蓝的光饱和点和补偿点相对于二倍体类型都较高,其中四倍体最高分别为2 375.00 μmol/(m2·s)、536.61 μmol/(m2·s),二倍体最高为2 100.00 μmol/(m2·s)和505.16 μmol/(m2·s).菘蓝的光合日变化曲线为双峰曲线,有明显午休现象.     

菘蓝对小菜蛾幼虫的取食和生长的影响

目的:研究来源于四川、山东、浙江的菘蓝和甘蓝型菘蓝叶片对小菜蛾的取食和生长的影响,旨在为研究菘蓝的抗虫育种和抗虫机制提供理论依据。方法:采用叶碟法测试菘蓝叶片对小菜蛾的触杀活性。结果:小菜蛾取食菘蓝叶片后生长、发育明显受到抑制,推迟或不能化蛹,而对照组小菜蛾正常生长、发育直至化蛹。结论:菘蓝叶片中含有影响小菜蛾取食和抑制其生长发育的物质。     

板蓝根对人工感染鸡大肠杆菌病的疗效观察

试验以鸡大肠杆菌为研究对象,通过试管二倍稀释法和平皿法相结合,测定了板蓝根的最小抑菌浓度为1∶4;通过人工感染鸡大肠杆菌病后以板蓝根来治疗,结果1∶4浓度可以起到90%以上的保护。结果表明:板蓝根可以有效的治疗鸡大肠杆菌病。     

菘蓝生殖方式的初步研究

对十字花科菘蓝属植物菘蓝的生殖方式进行观察,观察结果表明:(1)菘蓝花两性,四强雄蕊,花粉较多,主要靠昆虫传粉;(2)P/O(花粉/胚珠)值为9 426~28 280,属于异交繁育系统,其传粉过程观察、自异交试验及花粉在柱头上萌发的显微观察结果也证明菘蓝主要以异花传粉的方式进行交配;(3)菘蓝花期自交结实率只有7.8%,具有较强自交不亲和性,自交不亲和的作用部位是柱头表面,属于孢子体自交不亲和型。     

大青叶营养成分分析

[目的]为开发利用大青叶植物资源提供科学依据。[方法]分析大青叶中各营养成分的含量。[结果]结果表明,大青叶含有丰富的矿质元素、维生素和多种营养成分,至少含有17种氨基酸,其中7种为人体必需的氨基酸。总糖含量、谷氨酸含量、VB2含量和K含量较高。[结论]开发利用大青叶将会产生较大的经济效益和社会效益。     

菘蓝干物质积累及氮磷钾吸收、分配动态变化规律研究

为了探讨菘蓝干物质累积和氮、磷、钾吸收与分配的特点,通过田间小区试验和采样分析,研究了菘蓝不同生育期植株的干物质和氮、磷、钾累积量。结果表明,菘蓝干物质的累积量随生长进程不断增加,呈"S"曲线型;近60%干物质累积在菘蓝生长60 d时形成;在120~150 d,菘蓝出现第二个生长高峰期,干物质占总累积量的31.72%;一年生菘蓝只进行营养生长,物质积累与分配只在叶与根这两个器官间进行,并且干物质分配主要以叶部为主,其分配率占50%以上。在整个生育期,菘蓝对N的吸收累积量最大,K_2O次之,P_2O_5最小,N、P_2O_5、K_2O吸收比例约为7.78∶1∶3.20,并且随着菘蓝生长期的延长,叶部氮磷累积总量及分配比例均在不断增加;而对于菘蓝根部来说,虽然氮磷累积总量在不断增加,但是所占总累积量比例却有所降低;钾在叶、根部累积及分配规律则与氮磷相反。     

表油菜素内酯对水分胁迫下菘蓝相关指标的影响

目的:研究水分胁迫下表油菜素内酯(EBR)对菘蓝相关酶活性和生理指标的影响,为提高菘蓝的抗涝能力提供方法。方法:采用盆栽试验,测定水分胁迫下,不同浓度EBR(0.01、0.050、.10、0.501、.00 mg/L)处理下的菘蓝的抗氧化保护酶(SOD、POD、CAT、APX)、乙醇脱氢酶(ADH)、硝酸还原酶(NR)活性和脯氨酸(Pro)、可溶性蛋白、丙二醛(MDA)的含量。结果:当EBR浓度为0.100、.50 mg/L时,菘蓝的黄叶数最少,随着EBR浓度的增加,抗氧化酶、ADH、NR活性先增后降,Pro、可溶性蛋白含量也呈相同变化趋势,MDA含量变化则与之相反。结论:适宜浓度的EBR能显著提高菘蓝的抗氧化能力,减少水分胁迫造成的伤害。     

河西走廊栽培菘蓝农艺性状、药材产量和质量对播期的响应

为确定河西走廊菘蓝高产优质栽培的最佳播期。2014 年在甘肃省民乐县开展了菘蓝的分期播种试验,对不同播期菘蓝农艺性状,药材产量和品质及其差异性进行了分析。结果表明,随播期延后,菘蓝出苗期和全生长期均显著缩短,抽薹率显著降低,5 月22 日较4 月12 日播种出苗天数缩短15 天,生长期缩短42 天,抽薹率下降30%;出苗率却随播期延后而显著增加,4 月12 日播种出苗率最低[(40.57±0.56)%],5 月2 日以后播种出苗率均在95%以上;4 月22 日播种板蓝根产量(5000.25 kg/hm2)和(R,S)-告依春含量[(0.083±0.0012)%]均达最高水平,5 月2 日播种大青叶产量最高(2034.37 kg/hm2),但播期对板蓝根药材含水量、浸出物和灰分影响不显著。河西走廊菘蓝的最佳播期以4 月下旬至5 月上旬为宜,早播和晚播均不利于药材产量的增加和品质的提高。     

不同产地来源菘蓝根生物量、蛋白质和多糖含量比较

将北京、河南、山西、内蒙古包头、内蒙古赤峰5个不同产地的菘蓝和河北的四倍体菘蓝引种到江苏省灌南地区,以江苏灌南菘蓝为对照,分析不同来源材料的生物量、蛋白含量和多糖含量,并以生物量、蛋白含量和多糖含量为指标比较各地材料引种到江苏连云港地区的适应性.结果表明:河北的四倍体菘蓝根的生物量、蛋白含量和多糖含量均最高,且具备较好的生物性状和较好的适应性,是苏北地区最佳的引种材料;河南的材料也是较适宜的二倍体引种材料.     

菘蓝根腐病菌毒素最适浓度的筛选及其对菘蓝幼苗可溶性蛋白的影响

［目的］为深入研究菘蓝对根腐病的抗性机制提供理论依据。［方法］采用不同浓度菘蓝根腐病菌毒素处理菘蓝幼苗，筛选最适处理浓度；对最适浓度毒素处理过的菘蓝幼苗的外部形态进行鉴定，并测定其可溶性蛋白的含量。［结果］稀释10、20倍毒素处理过的菘蓝幼苗在试验期间全部萎蔫死亡，稀释40、50倍毒素处理过的菘蓝幼苗在试验期间大部分无病变现象，稀释30倍毒素处理过的菘蓝幼苗病变现象明显，处理72 h后50%幼苗萎蔫死亡。经稀释30倍毒素处理的菘蓝幼苗可溶性蛋白的谱带大体相同，但也出现了个别特异性条带；经毒素处理的样品蛋白条带数多于对照，且染色较深。［结论］菘蓝根腐病菌毒素的筛选压力以稀释30倍最好。