犬源大肠杆菌分离株对四环素类药物耐药性的检测

用微量肉汤倍比稀释法测定四环素类等抗菌药物对53株犬源大肠杆菌分离株的最小抑菌浓度(MIC),用PCR和DNA测序方法检测犬源大肠杆菌中四环素耐药基因(tet基因),了解tet基因的流行情况、分析试验菌对四环素类药物的耐药机制。结果表明:25%的分离菌呈多重耐药现象,最多对8种药物耐药。分离菌对四环素类中的土霉素、四环素、多西环素耐药率高,耐药率介于69.8%~86.1%。基因检测结果显示,犬源大肠杆菌中共检测到5种tet基因,分别为tet A、tet B、tet C、tet G、tet L基因,都属于外排泵基因,未检测到核糖体保护基因。其中tet G基因的检出率最高,共检出39株(检出率达70%),有40个菌株同时检出2种或2种以上tet基因,有3株同时检测到4种tet基因,仅有4株未检测到任何tet基因。研究表明:犬源大肠杆菌对常用抗菌药物的耐药情况十分严重,tet基因的携带率高,主动外排是犬源大肠杆菌对四环素类耐药的主要机制。     

犬源大肠杆菌分离株对四环素类药物耐药性的检测

用微量肉汤倍比稀释法测定四环素类等抗菌药物对53株犬源大肠杆菌分离株的最小抑菌浓度(MIC),用PCR和DNA测序方法检测犬源大肠杆菌中四环素耐药基因(tet基因),了解tet基因的流行情况、分析试验菌对四环素类药物的耐药机制。结果表明:25%的分离菌呈多重耐药现象,最多对8种药物耐药。分离菌对四环素类中的土霉素、四环素、多西环素耐药率高,耐药率介于69.8%⁸6.1%。基因检测结果显示,犬源大肠杆菌中共检测到5种tet基因,分别为tet A、tet B、tet C、tet G、tet L基因,都属于外排泵基因,未检测到核糖体保护基因。其中tet G基因的检出率最高,共检出39株(检出率达70%),有40个菌株同时检出2种或2种以上tet基因,有3株同时检测到4种tet基因,仅有4株未检测到任何tet基因。研究表明:犬源大肠杆菌对常用抗菌药物的耐药情况十分严重,tet基因的携带率高,主动外排是犬源大肠杆菌对四环素类耐药的主要机制。     

多重PCR检测猪源大肠杆菌毒素基因

根据猪源大肠杆菌产生的4种主要毒素(STa、STb、LT、SLT-2e)基因序列，设计4对聚合酶链式反应(PCR)引物，建立多重PCR方法。该方法能快速地检测和鉴定产肠毒素大肠杆菌(ETEC)和产志贺样毒素大肠杆菌(SLTEC)菌株，准确地了解所检测菌株产生肠毒素和志贺样毒素的情况。对215株猪源病原性大肠杆菌进行检测，其中STa为52．56％，STb为26．51％，STa STb为8．84％，STa STb SLT-2e为6．51％。这表明多重PCR可为猪源大肠杆菌毒素基因的检测提供一种更加快速、经济、易行的技术。     

携带四环素耐药基因的鸭源大肠杆菌质粒不相容群分析

目的:用PCR方法测定22株携带四环素耐药基因鸭大肠杆菌所含质粒的不相容群。方法:设计18对引物,分为5个多重PCR体系和3个单一PCR体系,用来检测识别FIA、FIB、FIC、HI1、HI2、I1、L/M、N、P、W、T、A/C、K、B/O、X、Y、F和FⅡ复制子。结果:22株鸭大肠杆菌中,分别有7、4、9、2、6、2、3、7株和19株属于IncI1、IncN、IncFIB、IncY、IncP、IncFIC、IncA/C、In-cK和IncFⅡ。试验菌株所含质粒大部分属于IncFⅡ,占86.4%,属于1、2、3、4、5个不相容群组合的分别为13.6%、31.8%、31.8%、18.2%和4.5%。     

广西地区仔猪致病性大肠杆菌的菌毛基因多重PCR检测及质粒DNA指纹图谱分析

对广西地区56株仔猪致病性大肠杆菌进行菌毛基因的多重PCR检测及质粒DNA指纹图谱分析。多重PCR检测结果证实该方法可用于各大肠杆菌野生菌株的检测,且适用于仔猪大肠杆菌性腹泻病的快速诊断和流行病学调查。质粒DNA指纹图谱分析发现这56个菌株质粒的获得率为100%,来源相同的菌株具有相同或相似的质粒图谱,来源不同的菌株的质粒图谱一般不同。所有菌株都含有1条大小相同的质粒带,表明广西流行的猪大肠杆菌性腹泻病主要是由携带相同质粒的大肠杆菌引起。试验结果表明,质粒DNA指纹图谱法可作为大肠埃希氏菌分型的分子生物学方法。     

鸭源大肠杆菌β-内酰胺类耐药基因的检测

为了解鸭源大肠杆菌对β-内酰胺类抗生素的耐药性情况,以及β-内酰胺酶类耐药基因的携带情况,从贵州省三穗县部分规模鸭场的患鸭内脏器官中分离的大肠杆菌中随机选取15株,采用药敏纸片法对其进行8种β-内酰胺类药物敏感试验,采用PCR方法对SHV型、CTX-M型、TEM型β-内酰胺酶类耐药基因进行检测,并对耐药基因序列与GenBank中的相关序列进行比对.结果显示,15株鸭源大肠杆菌对8种β-内酰胺类抗生素均存在严重耐药,耐药率高达100％.TEM型和CTX-M型耐药基因均有检出,检出率分别为46.7％和100％,而SHV型耐药基因未检出,其中有7株细菌同时带有两种耐药基因.耐药基因序列比对结果显示,所测菌株序列与数据库中相应耐药基因序列相似性均高达90％以上.     

鸡源致病性大肠杆菌对四环素类抗生素耐药性及耐药基因检测

为更好地了解鸡源致病性大肠杆菌对四环素类抗生素的耐药性及耐药基因分布,从陕西省部分规模化养鸡场的病、死鸡中经分离鉴定得到158株致病性大肠杆菌。采用K-B药敏纸片法检测致病性大肠杆菌分离株对4种四环素类药物的药敏性,PCR方法检测3种四环素类耐药基因,用DNAStar软件对获得的耐药基因序列与GenBank中的相关序列进行比对。结果显示,鸡源致病性E.coli分离株对四环素、金霉素、土霉素以及多西环素的耐药率分别为88.6%、77.2%、87.3%、50.6%,3重以上耐药菌株占78.5%。四环素类耐药基因tetA、tetB的检出率分别为81.4%、20.7%,未检测到tetC基因。结果表明,鸡源致病性E.coli对四环素类抗生素普遍具有耐药性,且以多重耐药为主;耐药基因tetA的检出率与其耐药性呈正相关。     

山西省鸡源性大肠杆菌多重耐药性分析

近年来,随着抗生素药物的广泛、持续应用,导致大肠杆菌出现不同程度的多重耐药性,对养殖行业造成了一定的损失。从山西省各地采集到的大肠杆菌菌株中,筛选出30株具备多重耐药性的菌种作为研究对象,通过对其药敏结果的分析,再结合相关耐药基因Acr A,qnr A及TEM,对近年来山西省大肠杆菌病进行了分子水平的流行病学分析,可为今后生产实践中更好的防控奠定基础。     

鸡源大肠杆菌四环素耐药基因检测

用肉汤稀释法测定32株鸡源大肠杆菌对四环素等8种抗菌药物的敏感性,用PCR方法检测5种四环素耐药基因(tet基因),并用ERIC-PCR方法分析试验菌株间的克隆关系。结果显示:32株大肠杆菌对四环素、多西环素的耐药率分别为84%、75%,tetA和tetB阳性率分别为78%和25%。总tet基因阳性率为90.6%,与对四环素、多西环素的耐药率基本一致。携带1种或2种tet基因的临床分离菌,不仅对四环素类药物耐药,还对头孢噻肟、环丙沙星、新霉素和氟苯尼考耐药,呈现多重耐药的特点。试验菌共分为A~O 15个ERIC型,tetA和tetB几乎均匀分布于不同ERIC型菌株中,表明其在试验菌株间水平扩散。     

鸡源大肠杆菌四环素耐药基因检测

用肉汤稀释法测定32株鸡源大肠杆菌对四环素等8种抗菌药物的敏感性,用PCR方法检测5种四环素耐药基因(tet基因),并用ERIC-PCR方法分析试验菌株间的克隆关系。结果显示:32株大肠杆菌对四环素、多西环素的耐药率分别为84%、75%,tetA和tetB阳性率分别为78%和25%。总tet基因阳性率为90.6%,与对四环素、多西环素的耐药率基本一致。携带1种或2种tet基因的临床分离菌,不仅对四环素类药物耐药,还对头孢噻肟、环丙沙星、新霉素和氟苯尼考耐药,呈现多重耐药的特点。试验菌共分为A^O 15个ERIC型,tetA和tetB几乎均匀分布于不同ERIC型菌株中,表明其在试验菌株间水平扩散。     

三种常见食源性致病菌的多重PCR快速检测

为建立对3种食源性致病菌—大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)的快速、敏感、特异的多重PCR诊断检验方法,本研究设计了上述3种菌的特异性PCR引物,通过单一、双重及三重PCR反应检测,并对人工感染的饮料和面包2种食品进行验证.结果表明,3种食源性致病菌的单一、双重和三重PCR均成功扩增出目的片断,没有非特异性扩增.人工感染食品的PCR检测也获得了目的菌的特异性片段,并且结果稳定.本研究所建立的多重PCR反应系统具有较好的特异性和灵敏性,为食品中常见致病菌的检测提供了一种快速、简便、可靠的方法,具有重要的理论意义及实践意义.     

三株鸡源大肠杆菌iss基因的检测

采用鸡胚致死对HL11、HL32、SD27鸡源大肠杆菌(Escherichia coli)的致病性进行测定,并检测其血清抗性及iss基因序列。结果表明,3株大肠杆菌为致病性、血清补体敏感菌株,iss基因序列与已知禽大肠杆菌iss基因序列同源性为99.0%~99.7%。     

多重PCR方法同时检测3种转基因作物外源基因

根据目前转基因作物常见的外源基因,选择出现几率较高的Ca MV 35S、NOS、CP4-epsps 3个基因,引物分别参照国家相关标准中的特异性序列,建立可同时特异性地检测3种外源基因的多重PCR检测体系。同时,对反应条件进行优化并测试其特异性和灵敏度。已知样品检测证明,此多重PCR体系具有良好的可靠性。利用此体系在对康定县境内出售大米、玉米样品检测中未检测相关基因。     

A Multiplex PCR Assay for the Detection of Pathogenic Genes of EPEC, ETEC and EIEC

A multiplex polymerase chain reaction (PCR) was developed to detect three pathogenic genes of en-teropathogenic, enterotocigenic and enteroinvasive Escherichia coli.. In this study three different sets of oligonu-cleotide primer were simultaneously used, and in this way, specific fragments of 880, 600, 150 bp for EPEC eaeA, EIEC ipaH and ETEC ST genes were amplified, respectively. The best condition of the multiplex PCR was: after an initial heat denaturation step at 95℃ for 5 min, followed by 30 cycles of denaturation at 94℃ for 40 s, primer annealing at 51.3 ℃ for 40 s and extension at 72 ℃ for 1 min, final extension at 72 ℃ for 10 min. The detection limit of the eaeA, ipaH and ST primers was 38.7423, 3.60519, 29.9448 ng·mL-1 (4.3×104, 1.5×103, 2.6×104 CFU·mL-1), respectively. It may be a good way for the detection and identification of Diarrhea-causing E. coli. .     

Detection of Herbicide-tolerant Canola by Multiplex PCR

[Objective]This study aimed to establish a multiplex PCR detection method of herbicide-tolerant canola.[Method] An endogenous reference gene(CruA) and three exogenous genes(T-CaMV 35 S, P-CaMV 35 S and pat) were selected for multiplex PCR. Specific primers were designed based on national standards or related literature. The annealing temperature, ratio of primer concentration and sensitivity of the established multiplex PCR system were optimized. The optimal multiplex PCR system was verified with known samples. [Result] The experimental results showed that the optimal annealing temperature of multiplex PCR was 58 ℃; the optimal ratio of primer concentration(μmol/L) was T-CaMV 35S: CruA: P-CaMV 35S: pat=0.1: 0.2: 0.2: 0.2;the detection sensitivity of the established multiplex PCR method was 0.3 ng. The amplified bands of known samples were completely consistent with the molecular characteristics. [Conclusion] This study provided a rapid, accurate and effective multiplex PCR technique for detection of herbicide-tolerant canola.     

猪圆环病毒多重PCR检测方法的建立

为建立PCV1和PCV2混合感染快速检测的PCR方法,根据GenBank已发表PCV1和PCV2全基因组序列,设计合成4条引物,通过PCV1和PCV2阳性质粒的构建、反应条件的优化、敏感性试验和特异性试验,建立了PCV多重PCR检测方法,可扩增出PCV1和PCV2长度分别为726 bp和433 bp特异性目的基因片段。结果显示,建立的PCV多重PCR可检测到5×101个拷贝的PCV1和PCV2目的基因,HCV、PRV、PPV核酸扩增均为阴性,具有良好的特异性和敏感性。并初步应用建立的方法对42份采自四川省部分地区的样品进行检测,结果表明,PCV1阳性率为33.3%,PCV2阳性率为45.2%,其中PCV1和PCV2混合感染阳性率为16.6%。     

一种可同步检测3种外源基因的多重PCR方法

为建立一种可同步检测3种外源基因的多重PCR方法,试验选择较常见的T-CaMV 35S,P-CaMV 35S和pat这3个基因作为多重PCR检测对象,对多重PCR体系中引物浓度配比和引物退火温度进行优化。结果表明,多重PCR适宜的引物终浓度(μmol/L)配比T-CaMV 35S∶P-CaMV 35S∶pat为0.2∶0.2∶0.2以及适宜的引物退火温度为56℃;采用优化后的反应体系对多重PCR体系灵敏度进行测试,结果显示,方法灵敏度为0.5 ng;通过利用建立的多重PCR方法对已知样品进行检测,结果表明,试验建立的多重PCR体系具有良好的可靠性。     

Development of a Multiplex PCR for Diagnosis of Staphylococcus aureus,Escherichia coli and Bacillus cereus from Cows with Endometritis

Staphylococcus aureus,Escherichia coli and Bacillus cereus are the major agents of cow endometritis in dairy cows.A multiplex PCR (SEB-mPCR) was established based on the conserved genes of S.aureus,E.coli and B.cereus,and the detection limits were 103,102 and 103 CFU mL-1,respectively.SEB-mPCR could not amplify genomic DNA of pathogenic bacteria of other common bovine diseases.A total of 309 vaginal discharge samples from cows with endometritis were tested by SEB-mPCR.Of the samples,23.95％ had the three kinds of bacteria detected,17.15％ had S.aureu and E.coli,9.39％ had E.coli and B.cereus,and 9.71％ had S.aureus and B.cereus.The rates of infections with S.aureus,E.coli and B.cereus were 11.35,16.18 and 9.06％,respectively.Therefore,SEB-mPCR has a potential as a diagnosis tool for endometritis in dairy cows.     

鸭坦布苏病毒囊膜 E蛋白的原核表达

利用 RT-PCR 方法扩增鸭坦布苏病毒分离株（WR 株）全长 E 蛋白基因,克隆到 pEASY-T3载体中,经Bam HI和XhoI酶切后将目的片段连接入pET-32a载体,构建原核表达重组质粒pET-E。表达质粒转化入感受态细胞 BL21（DE3）后,经IPTG 诱导后表达出鸭坦布苏病毒 E 蛋白,并以包涵体的形式存在,Western-blotting试验呈阳性,表明 E蛋白有很好的反应原性。