新城疫病毒F48E8株核衣壳蛋白基因的克隆及其酶切分析

根据已发表的新城疫病毒（ＮＤＶ）核衣壳蛋白（ＮＰ）基因序列,设计合成１对长度为３２ｍｅｒ的引物。ＲＴ－ＰＣＲ扩增ＮＤＶＦ４８Ｅ８株、Ｕｌｓｔｅｒ株、ＬａＳｏｔａ株的ＮＰ基因,产物经琼脂糖凝胶电泳分析,均呈现１条长１．５ｋｂ左右的特异性带。将Ｆ４８Ｅ８株扩增产物克隆入ｐＵＣ１８载体,经限制性内切酶分析证实为ＮＰ基因。     

鸵鸟源新城疫病毒TN株F基因的克隆与序列分析

应用PCR技术对1株鸵鸟源新城疫病毒TN株融合蛋白基因(F基因)进行扩增,将其克隆到pMD18-T载体后进行序列测定,并与国内外NDV毒株对应序列进行比较分析.结果表明,TN株F基因的长度为1 662 bp,可编码553个氨基酸,其裂解位点的氨基酸序列为112G-R-Q-G-R-L117,为1株新城疫弱毒株;与贵州省其他禽源(包括肉鸡、蛋鸡、越南斗鸡、七彩山鸡和鸽子等)毒株间的核苷酸同源性为84.0%～89.6%,氨基酸同源性为87.5%～92.1%;与国内外NDV代表株(Lasota株、B1株、F48E9株、CH2000株和TW2000株)的核苷酸同源性为84.4%～98.6%,氨基酸同源性为88.3%～98.0%.经系统发生树分析,TN株与NDV弱毒株Lasota株和B1株在同一分支上,属于基因II型NDV.     

新城疫病毒鹌鹑分离株融合蛋白基因的克隆与序列分析

本研究以一株从自然发生新城疫病死的鹌鹑中所分离到的新城疫病毒（QNDV／89）为研究对象,用反转录一聚合酶链式反应（RT-PCR）对QNDV／89株的F全基因进行分段扩增、定向克隆到pUC119载体后,采用Sanger’s双脱氧末端终止法测定其核苷酸序列,并推导出相应氨基酸序列。QNDV／89株F基因全长1662bp,单一的开放阅读框编码553个氨基酸的多肽,其裂解位点的氨基酸序列为112R-R-Q-R-R-F117,是NDV强毒株所特有的序列结构,这与其生物学特性及致病性实验结果是相一致的。序列分析结果表明,QNDV／89株与F48E9株的核苷酸同源率高达99.22％,氨基酸的同源率为98.37％;而与弱毒株LaSota的核苷酸同源率为88.93％,氨基酸的同源率为90.42％。本研究首次报道了流行于我国鹌鹑中的新城疫强毒融合蛋白基因序列,并与其它新城疫病毒进行了同源性比较,证明QNDV／89株核苷酸的变异引起了其蛋白质二级结构的部分改变。     

新城疫病毒分离株F基因的克隆与序列分析

应用RT-PCR分别扩增出新城疫病毒(NDV)青海株(QH3)、黑龙江株(HLJ)和甘肃株(A4)的融合蛋白(F)基因的全长核苷酸,再克隆到pMD18-T载体中.经酶切和质粒PCR鉴定,获得阳性重组质粒后,进行序列测定并推导出其氨基酸序列,同时进行分析和比较.序列分析结果表明,所获得的3个分离株F基因完整的开放阅读框长度为1 662 bp,共编码F蛋白的553个氨基酸;3个毒株之间的核苷酸序列同源性为88.0%～90.6%;与常用疫苗株之间核苷酸序列同源性只有85.3%～91.6%.三者F基因的裂解位点均为112R-R-Q-K/R-R-F117,符合强毒株裂解区氨基酸组成的特征.以1 bp～374 bp的核苷酸序列绘制系统发育树分析表明,QH3株NDV为基因Ⅷ型,A4株NDV为基因Ⅵ型,HLJ株NDV为基因Ⅸ型.     

新城疫病毒广西分离株F基因的克隆和序列分析

根据GenBank中登录的新城疫病毒(NDV)F基因序列设计了2对引物，对从广西分离的10株NDV毒株的F基因进行了分段扩增和序列测定，其基因序列全长均为1662bp，编码553个氨基酸，均有6个潜在的糖基化位点。将其F基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列与已发表的10株NDV参考株的F基因序列进行了比较。结果表明，核苷酸序列的同源性为82．6％～98．1％，氨基酸的同源性为87．7％～98．7％。这10株NDV广西分离株在裂解位点的氨基酸序列(^112R—R—Q—K／R—R—F^117)与NDV强毒株特征相符合。系统发育树、酶切位点分析和基因分型结果表明，10株NDV广西分离株中GX1／00、GX2／00、GX4／00、GX6／02、GX7／02、GX9／03、GX10／03和GX11／03为基因Ⅶd亚型，GX3／00和GX5／00为基因Ⅲ型。     

新城疫病毒广东分离株F基因的克隆与序列分析

为研究新城疫病毒(NDV)基因变异情况,用RT-PCR扩增了9个广东分离株的F基因cDNA片段,并将其分别克隆到pGEM-Teasy载体中。序列分析结果表明,上述分离株F基因长度为1 662 bp,编码553个氨基酸,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为95.1%~99.2%和96.0%~99.8%;但与LaSota、Roakin、F48E9及B1等常见疫苗株的氨基酸同源性仅为87.6%~92.2%。9个NDV分离株F蛋白裂解位点的氨基酸序列为112R-R-Q/R-K-R-F-I-G119,与平均致死鸡胚时间(MDT)、脑内接种指数(ICPI)等病毒致病力测定结果相符,均属于基因Ⅶ型NDV。     

NDV 江苏分离株F基因的克隆与序列分析

为比较NDV江苏分离株的遗传变异特征,应用RT-PCR扩增出新城疫病毒（NDV）江苏徐州株（JSXZ）、江苏宿州株（JSSZ）、江苏连云港株（JSLYG）和江苏淮安株（JSHA）的融合蛋白F基因的全长核苷酸,将其分别克隆至pMD18-T载体中。将获得的阳性重组质粒进行序列测定后,推导出其氨基酸序列,进行分析和比较。结果表明,所获得的4个分离株F基因完整的开放阅读框长度为1662bp,共编码F蛋白的553个氨基酸;4个毒株与常用疫苗株之间核苷酸序列同源性只有69．3％～80．8％。JSXZ株和JSSZ株F基因的裂解位点为112-RRQK／RRF-117,符合强毒株裂解区氨基酸组成的特征。以lbp～374bp的核苷酸序列绘制系统发育树分析表明,JSXZ和JSSZ株NDV为基因Ⅷ型,JSLYG和JSHA株NDV为基因Ⅸ型。     

新城疫病毒F48E9株融合蛋白基因核苷酸序列分析

通过反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增出新城疫病毒国内标准强毒株Ｆ４８Ｅ９的融合蛋白基因的ｃＤ－ＮＡ。经双粘端定向克隆到ｐＵＣ１９的多克隆位点中,采用Ｓａｎｇｅｒ’ｓ双脱氧末端终止法测定ｃＤＮＡ片段的核苷酸序列,并推导出其氨基酸序列。Ｆ基因全长为１６６２个ｂｐ,单一的开放阅读框编码５５３个氨基酸的多肽。Ｆ蛋白的疏水构型有三个强疏水区;其裂解位点的氨基酸序列为１１２Ｒ－Ｒ－Ｑ－Ｒ－１１６Ｒ－１１７Ｆ;Ｆ蛋白上共有１２个Ｃｙｓ残基位点和五个潜在糖基化位点。     

禽脑脊髓炎病毒河南株VPO基因的克隆与序列分析

为进一步认识AEV的基因结构及功能,为基因工程苗的研制,以及分子流行病学研究提供理论基础,本研究根据已发表的AEV序列设计一对引物,利用反转录———聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,在体外从AEVHN株感染的SPF鸡胚病变组织中扩增出VPO基因,经纯化后将VPO基因克隆到质粒pGEM-T-Easy上,构建成含有VPO基因的重组质粒pGEM-T-VPO,然后通过转化感受态大肠杆菌,经蓝白斑筛选,挑出阳性克隆,提取质粒做PCR和酶切鉴定。进一步序列分析表明,该基因长726bp,编码242个氨基酸,与AEVBZ株和HB株的核苷酸和氨基酸同源性分别为:99.2%、98.3%和94.8%、95.4%,同源性较高,说明VPO基因较为保守。     

朱鹮新城疫病毒陕西分离株F基因的克隆与序列分析

新城疫病毒(NDV)的F蛋白与病毒的致病性和免疫应答密切相关。为了了解朱鹮源NDV陕西分离株的变异情况及进化地位,采用RT-PCR方法对NDV陕西分离株F基因的主要功能区片段进行了扩增,并进行了序列测定及遗传进化树构建。序列分析表明,该分离株扩增片段的长度为535 bp,与预期扩增片段长度大小一致。其F基因裂解位点的氨基酸组成与NDV强毒株的特征性结构(112R-R-Q-K-R-F117)一致。系统进化树分析表明,该NDV分离毒株为基因Ⅶ型,与近年来报道的我国家禽流行的NDV基因型一致。     

新城疫病毒SDWF2003株F基因的克隆与分子特征分析

将新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）SDWF2003株经10日龄SPF鸡胚增殖后,提取病毒基因组RNA,并以此为模板,RT-PCR扩增获得与F基因预期大小一致的DNA片段,亚克隆到pMD18-T载体并酶切鉴定正确后进行测序。软件分析显示：基因全长1662bp,编码553个氨基酸,裂解住点为^112R-R-Q-K-R-F^117,是典型强毒株氨基酸序列结构;此分离毒株属于基因Ⅶ型,该型F蛋白第101位、第121位特征性氨基酸残基分别是K（赖氨酸）和V（缬氨酸）,而本研究分离病毒F蛋白第101位、第121位分别是Q（谷氨酰胺）和V（缬氨酸）;同源性比较,与LaSota、F48E9、Ch99核苷酸同源性分别为84．4％、87．1％、98．9％,氨基酸同源性分别为88．3％、91．7％、98．4％。     

新城疫病毒V4株主要基因的克隆与序列分析

设计4对引物，利用RT—PCR技术分别扩增出新城疫病毒（NDV）V4株长约4.2、4.1、4.1、3.5kb的4个互相重叠的核苷酸片段，并分别进行了克隆和序列测定。将这4个片段的核苷酸序列拼接后，得到长为15 061 bp的核苷酸序列。该序列包含有NDVv4株结构基因NP的全部编码区和5’端非编码序列，结构基因P、M、F、HN及L基因的全部编码区和非编码区序列，各结构基因之间的间隔序列以及基因组5’端部分尾巴序列（108bp）。序列比较分析表明，NDVv4株F蛋白裂解位点序列为^112GKQGRL^117，HN基因编码616个氨基酸，符合无毒株的特征；NDVv4株同基因组长度为15 192 bp的毒株一样，在基因组的1647～1648bp间比基因组长为15192bp的毒株少了6个碱基。     

RT-PCR法快速鉴别新城疫强弱毒株的试验

通过对大量不同毒力NDV F基因核苷酸序列的分析，根据强弱毒株F0裂解位点的序列差异设计合成了三对引物，建立了快速诊断新城疫并能鉴别其强弱毒株的反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法，整个试验过程可在5h内完成。试验表明，该方法具有快速特异和操作简便的特点，不仅适用于对鸡胚毒的检测，而且适用于对病鸡组织匀浆液的检测，是新城疫鉴别诊断和流行病学调查的颇具潜力的分子诊断方法。     

新城疫病毒F、NP、M和HN基因在昆虫细胞内的共表达

为构建杆状病毒转移载体，通过PCR的方法将F48E9株新城疫病毒F基因上的StuⅠ位点和NP基因上的XbaⅠ位点进行突变，扩增出全长的F、NP以及F48E9株新城疫病毒M和HN基因片段，将其克隆到pMD18-T载体，再将F、NP、M和HN基因依次亚克隆到杆状病毒转移载体pAeAB4上，F基因和M基因均在p10启动子的操控之下，NP基因和HN基因构建到两个polyhedrin启动子下游，构建重组杆状病毒转移载体pAeAB4-F-NP-M-HN。pAeAB4-F-NP-M-HN与线性化的杆状病毒DNA共转染昆虫细胞Sf9，获得重组杆状病毒rBae-F-NP-M-HN。重组杆状病毒感染Sf9细胞，72h后收集细胞和培养上清。Western blot分析显示：M、NP、F和HN蛋白在培养上清中得到了共表达，大小与预期结果一致；感染细胞内只检测到了HN蛋白的表达。这表明M、NP、F和HN蛋白在昆虫细胞内共表达可以自我装配成病毒样颗粒，并且以出芽的方式释放到培养基中。该重组杆状病毒的获得为研究新城疫病毒各结构蛋白之间的相互作用和确定病毒粒子出芽的驱动力等方面奠定了基础。     

新城疫病毒贵州不同鸡源分离株F基因的克隆与序列分析

应用PCR技术扩增NDV贵州不同鸡源分离株,包括肉鸡源P1株与BY株、蛋鸡源H2株与FW株、七彩山鸡源N98株和越南斗鸡源DQ株的F蛋白基因,将该基因片段分别进行克隆和测序,并与国内外NDV参考株的对应序列进行比较分析。结果表明:6株NDV贵州不同鸡源分离株的F基因长度均为1 662 bp,编码553个氨基酸;分离株间核苷酸同源性为86.9%~99.7%,氨基酸同源性为91.0%~99.3%;与国内外NDV代表株(LaSota株、B1株、F48E9株、CH2000株和TW 2000株)的核苷酸同源性为84.0%~98.9%,氨基酸同源性为87.2%~98.6%;经系统发育进化树分析,DQ株、N98株、P1株和H2株为基因VIId型,而BY株和FW株为基因IX型。这些结果提示贵州省不同鸡群间存在相同NDV毒株感染的可能性,不同年份间NDV毒株发生基因型改变,而近年来贵州省流行的ND疫情主要是由NDV基因VII型引起。     

一株新疆野鸟源新城疫病毒的分离鉴定、F基因克隆及遗传进化分析

为了解新疆野鸟新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）感染情况,分析其分子特征和基因变异特点,防止新城疫的暴发和蔓延,本试验用9日龄SPF鸡胚进行病毒的分离传代,HA、HI试验和RT-PCR方法对位于"东非-西亚迁徙线"福海县的野鸟进行了NDV检测,分离到1株野鸟源NDV,并命名为NDV/Pintail/CH（XJ）/01/2016。结果表明,该NDV分离株F基因ORF长1 662 bp,编码553个氨基酸,F基因碱性裂解位点序列为¹¹²G-R-Q-G-R-L¹¹⁷,符合弱毒株特征;遗传进化分析显示,NDV/Pintail/CH（XJ）/01/2016与乌克兰鸽源分离株Doneck/3/968、比利时鸭源分离株Simeonovgrad核苷酸同源性均为99.7%,属于NDV ClassⅡ基因Ⅱ型。而上述3株病毒均与疫苗毒La Sota具有较高同源性（99.5%~99.8%）。本研究结果为家禽NDV外流进入自然环境提供了论据。     

Isolation and Identification,F Gene Cloning and Evolutionary Analysis of Newcastle Disease Virus Isolated from Wild Birds in Xinjiang

In order to understand inflection of Newcastle disease virus (NDV) of Xinjiang wild birds, through analysis of molecular characteristics and genetic variation, to prevent the outbreak and spread of Newcastle disease, isolation of the virus was performed in 9 days old specific pathogen free (SPF) chicken embryos, detected the wild birds in Fuhai county which was located in the migration line of East Africa-West Asia by HA, HI test and RT-PCR method. And then 1 strain of NDV from wild birds was isolated, named as NDV/Pintail/CH(XJ)/01/2016. As the result, ORF of F gene from the NDV isolate was 1 662 bp, encoding 553 amino acids. The motif of the cleavage site was ¹¹²G-R-Q-G-R-L¹¹⁷, which was consistent with the characteristics of avirulent NDV strains. The phylogenetic analysis showed that NDV/Pintail/CH(XJ)/01/2016 nucleotide sequence homologies of F gene between reference strain Doneck/3/968 and mule Simeonovgrad strain homology were high and reached 99.7%, it belonged to genotype Ⅱ of Class Ⅱ NDV. All of the three viruses had high homology to the vaccine strain La Sota,which were 99.5% to 99.8%. According to this research conclusion we provided evidence that poultry NDV outflowed into the natural environment.