马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒株LTR启动子功能的研究

为了证明我国马传染性贫血病毒（ＥＩＡＶ）驴白细胞弱毒株的长末端重复序列（ＬＴＲ）是否能够启动基因的表达,我们将该ＬＴＲ克隆于含ＣＡＴ基因的载体中,获得重组质粒ｐＣＡＴ－ＬＴＲ,用ｐＣＡＴ－ＬＴＲ分别转染驴胎皮肤细胞（ＦＤＤ）、胶质母细胞瘤（ＴＪ－９０５）细胞、驴白细胞及接种ＥＩＡＶ弱毒的ＦＤＤ及驴白细胞,结果以ＥＩＡＶ弱毒的ＬＴＲ为启动子,ＣＡＴ在这几种细胞中均获得了不同程度的表达,证实了我国ＥＩＡＶ弱毒株的ＬＴＲ在ＦＤＤ、ＴＪ－９０５及驴白细胞中确实具有一定的启动子功能,并能被反式激活表达,为进一步研究ＥＩＡＶ弱毒复制及表达调控奠定了基础。     

马传染性贫血病毒弱毒株LTR的克隆及序列分析

从马传染性贫血病毒（ＥＩＡＶ）弱毒株感染的驴胎皮肤（ＦＤＤ）细胞中提取前病毒ＤＮＡ,以其为模板,通过ＰＣＲ扩增出ＥＩＡＶ弱毒株的ＬＴＲ,并将其克隆到载体质粒ｐＵＣ１９中。经酶切分析,ＰＣＲ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交筛选、鉴定,获得含有ＥＩＡＶ弱毒株ＬＴＲ片段的重组质粒ｐＬＴＲ。对该质粒的序列分析发现,在中国ＥＩＡＶ弱毒株ＬＴＲ的Ｕ３区含有４个与细胞转录因子结合的位点,其中有３个ＰＵ．１位点和１个ＡＰ－１位点,Ｕ３区还存在１个ＴＡＴＡＴＡＡ启动子序列;Ｒ区长为８１ｂｐ,含有１个帽位点ＧＧ和１个Ｐｏｌｙ（Ａ）信号序列ＡＡＴＡＡＡ;在帽位点下游是１个病毒Ｔａｔ蛋白结合位点,即ＴＡＲ位点;Ｕ５区长为３９ｂｐ。中国ＥＩＡＶ弱毒株ＬＴＲ序列与国外发表的其他毒株序列相比,在ＬＴＲ的一些调控部位有变异发生,中国ＥＩＡＶ弱毒株与美国ＥＩＡＶ原型株（Ｗｙｏｍｉｎｇ株）ＬＴＲ区核苷酸序列有１８．７２％的差异。     

马传染性贫血病毒第19、26代驴胎皮肤细胞弱毒前病毒DNA全基因序列分析

不同代次马传染性贫血驴胎皮肤细胞弱毒(Fetal donkey dermal virus,FDDV)的免疫保护效果各不相同,只有第10～15代驴胎皮肤细胞弱毒具有良好的免疫保护效果,可作为疫苗使用,继续传代则疫苗的保护率下降。为确定有、无免疫保护效果的FDDV在基因水平上的差异,本实验对无免疫保护效果的第19、26代驴胎皮肤细胞弱毒前病毒DNA进行了全基因序列测定,并与已测序的疫苗毒株进行序列比较。第19代和第26代FDDV全基因核苷酸序列同源性高达99.5%,与疫苗毒株全基因核苷酸序列的同源性分别为96.9%、96.7%。LTR是EIAV在细胞传代中变异最显著的区域,第19、26代FDDV的LTR与疫苗毒的LTR同源性仅为89.6%、89.3%。马传贫病毒的gag基因高度保守,第19、26代FDDV与疫苗毒株的gag基因推导氨基酸序列仅有2个氨基酸不同。第19、26代FDDV与疫苗毒株的pol基因、env基因的推导氨基酸序列的同源性分别为98.9%、98.8%、93.7%、93.6%。由序列比较结果可以推断,第19代、第26代FDDV不具有免疫保护效果的主要原因可能是由于LTR和env基因的变异,导致病毒复制能力下降或免疫原性丧失,不能诱导机体产生良好的免疫反应。     

马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株致弱过程中不同代次病毒LTR的进化分析

为揭示马传染性贫血病毒(EIAV)弱毒疫苗的减毒机理,本研究对EIAV弱毒疫苗株在体外驴白细胞传代过程中不同代次毒株的长末端重复序列(LTR)进行扩增和分析。结果显示:随着病毒在体外传代次数的增加,各病毒株遗传多样性逐渐增加,并与致弱前亲本株EIAVDV117的遗传距离逐渐增大;EIAV在体外传代过程中LTR的变异主要集中在U3区和R区的转录起始位点,但随着传代次数的增加,在负调节区丢失了GATA结合位点,并在增强子区出现了E-box基序。此外,传代初期低代次病毒株与后期的高代次弱毒株在负调节区的AP-1结合位点和转录起始位点以及TAR的起始位点存在明显差异。     

马传染性贫血病毒envgp90基因在实验感染马体内的遗传变异

为确定马传染性贫血病毒（ＥＩＡＶ）ｅｎｇ ｇｐ９０基因的遗传变异特性,本研究应用ＥＬＡＶ日本分离强毒株Ｐ３３７－Ｖ７０实验感染了１匹健康马,经第２次感染后,实验马未呈现临床症状,ｇｐ９０基因的核苷酸序列被直接从这匹马的外周血和肝脏所获得的前病毒ＤＮＡ扩增。     

马传染性贫血病毒弱毒疫苗S2基因在体内变异分析

为研究马传染性贫血病毒(EIAV)驴白细胞弱毒疫苗EIAVDLV121的S2基因在马体内的变异规律,本研究选用4匹成年马,其中2匹(#1、#2)接种EIAVDLV121,另外2匹作为对照.免疫后监测马体温、血小板含量以及病毒载量结果显示,免疫马未出现马传染性贫血体征.通过RT-PCR方法检测病毒S2基因在感染马体内不同时期的基因序列,结果显示,免疫马体内EIAVDLV121 S2蛋白的突变主要发生在氨基酸第17位、22位、39位、41位、51位和55位.另外,#1马免疫后70 d以及#2马免疫后第14 d和第28 d检测疫苗毒S2蛋白序列与EIAVDLV121亲缘关系较近,而#1马免疫后第42 d、第112 d和第140 d的疫苗毒S2蛋白序列与EIAVDLV121的致病性亲本强毒株EIAVDN40亲缘关系最近.本研究结果有助于对EIAV及EIAV疫苗株在马体内感染进程的研究.     

马传染性贫血病毒强毒株gag和gp45基因的体内进化分析

为研究马传染性贫血病毒(EIAV)强毒株体内进化规律,将3匹马分别以1×105 TCID50/匹接种EIAVLN40强毒株后,在不同时间点采取外周血,分离单核白细胞。提取白细胞中的DNA,并以其为模板,应用套式PCR技术分别扩增EIAV前病毒DNA的p15,p9和gp45基因,经克隆后进行序列分析。结果显示,与接种前EIAVLN40相比较,p15基因核苷酸和氨基酸平均差异率分别为1.8%(0～2.9%)和1.7%(0～3.6%);p9分别为2.5%(0.3%～3.8%)和2.9%(0～4.8%);gp45-Ⅰ分别为1.3%(0.3%～2.1%)和1.8%(0～3.2%),gp45-Ⅱ分别为2.1%(0～3.4%)和2.6%(0～4.7%)。在EIA发热期,每个基因核苷酸和氨基酸差异率最小;在亚临床阶段,每个基因平均差异率总体上相对较高。氨基酸变异位点分析发现,发病期(2-2、3-1)各基因氨基酸序列回复到亲本株EIAVLN40,其余时期p15基因氨基酸稳定变异位点16N/S、88T/S和112M/E;p9基因115E/G和122K/M;gp45-Ⅰ基因9T/F/L;gp45-Ⅱ基因21E/K和29G/S。此外,p15基因进化树结果显示,发热期(2-2、3-1)p15基因序列与EIAVLN40序列处于同一分支上,亚临床阶段大多数p15基因序列处于另一个大分支上;其他基因进化情况与p15基因类似。对EIAV p15、p9、gp45基因体内进化分析,有助于对EIAV在马体内感染进程的研究,为进一步研究EIAV持续感染和逃避免疫监视的机制提供参考。     

S2基因失活突变马传染性贫血病毒感染性克隆的构建及感染性研究

为研制马传染性贫血病毒(EIAV)标记疫苗株,本研究在EIAV驴胎皮肤(FDD)细胞弱毒疫苗株感染性克隆pEIAVFDDV3-8的S2基因内部引入两个终止密码子,致使S2基因终止表达,构建了一株S2基因突变的感染性克隆pEIAVFDDV3-8△S2。用该重组质粒转染FDD细胞,盲传至第4代时,转染细胞病变明显,电镜下可见细胞内的典型病毒颗粒。反转录酶活性检测和Real-time PCR对病毒拷贝数的检测均证明,获得了EIAVS2基因终止表达的感染性克隆毒株,命名为EIAVFDDV3-8△S2。     

马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株囊膜基因的优化及其DNA疫苗体外瞬时表达研究

马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus,EIAV)的密码子使用频率与哺乳动物间存在着明显差异。为此,对马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株(DLA-EIAV)囊膜全长基因按照哺乳动物优势密码子的使用原则进行了重新设计和合成,并以此为基础通过重叠延伸PCR、限制酶切等方法得到结合型和分泌型囊膜基因,将其插入含有鸡beta-actin/兔beta-globin复合启动子(AG)的高效表达载体pCAGGS中,构建了EIAV驴白细胞弱毒疫苗株结合型和分泌型囊膜基因的DNA疫苗质粒pCAGGS-opti-bou-env、pCAGGS- opti-sec-env。将构建的质粒纯化后分别转染293T细胞,以间接免疫荧光和Western blot方法检测转染48 h后细胞及上清中囊膜蛋白的表达。结果显示,两种表达质粒均可正确表达EIAV囊膜蛋白,与相对应未优化的表达载体pCAGGS-wt-bou-env和pCAGGS-wt-sec—env相比,密码子优化的基因体外瞬时表达水平有极为显著的提高,而且蛋白表达部位也与预期的结果符合。这一结果为EIAV囊膜蛋白的单抗制备、表位鉴定、免疫试验、新疫苗的开发等奠定了基础。     

EIAV基因转移载体的优化

本研究在马传染性贫血病毒（EIAV）基因转移载体pcPPTPRE（＋）的基础上[含有报告基因增强绿色荧光蛋白（EGFP）和人乙型肝炎病毒转录后调控元件（HARE）1,对其转录后调控元件和外源基因启动子进行优化。参考土拨鼠肝炎病毒（Woodchuck hepatitis virus,WHV）基因组序列和人巨细胞病毒增强子／鸡B—actin启动子序列（CAGp）,设计合成2对引物,分别扩增WHV转录后调控元件（WARE）和CAGp片段,正向插入pcPPTPRE（＋）获得重组质粒pcPPTWARE和pcPPTWCAG。将获得的EIAV转移载体pcPPTWARE和pcPPTWCAG以及pcPPTPRE（＋）,脂质体法分别转染人胚肾细胞HEK293和鸡胚成纤维细胞系DF-1,转染后12h、24h、36h、48h在荧光显微镜下观察特异性绿色荧光的表达。48h后收获细胞,利用流式细胞仪检测转染细胞中表达EGFP的阳性细胞。结果表明,在HEK293细胞中pcPPTWARE和pcPPTWCAG的阳性细胞平均百分率均极显著高于pcPPTPRE（＋）（P〈0．01）,pcPPTWCAG显著高于pcPPTWARE（P〈0．05）;pcPPTWCAG的平均道数值极显著高于pcPPTPRE（＋）和pcPPTWARE,pcPPTWPRE显著高于pcPPTPRE（＋）。在DF-1细胞中pcPPTWARE和pcPPTWCAG的阳性细胞平均百分率均显著高于pcPPTPRE（＋）,而pcPPTWARE和pcPPTWCAG的平均道数值均极显著高于pcPPTPRE（＋）,pcPPTWCAG显著高于pcPPTWARE。本研究利用WARE和CAGp优化构建了EIAV基因转移载体pcPPTWCAG,获得了较强的基因表达能力,为以鸡为宿主进行转基因研究提供了条件。     

应用ViewRNA技术特异性检测感染细胞中的不同马传染性贫血病毒株

为了对体外培养细胞感染的不同马传染性贫血病毒(EIAV)株进行特异的鉴别检测,本研究基于一种新的RNA原位杂交-ViewRNA技术,通过设计合成针对EIAVFDDV13和EIAVUK3病毒株基因组RNA的特异性探针,并结合信号放大技术和荧光标记技术,同时通过激光共聚焦显微镜进行观察,建立了可时两种不同株的EIAV基因组RNA进行细胞内原位检测的方法.研究结果表明,两组探针能够特异地与感染细胞中EIAVFDD13和EIAVUK3的病毒RNA相结合,可在两种不同EIAV株共感染的宿主细胞中实现对两种毒株的有效鉴别和定位检测.该方法为进一步研究EIAV与宿主细胞间相互作用提供了有效手段.     

Tat蛋白对马传染性贫血病毒长末端重复序列启动子活性的影响

将来源于马传染性贫血病毒（EIAV）强毒株第25代和第118代病毒的LTR，白细胞弱毒（EIAV-DLA）的LTR，以及TAR起始碱基和／或poly（A）附加位点发生突变的驴胎皮肤细胞弱毒（EIAV—FDD）的LTR分别克隆到pCAT3-Basic质粒中，获得了6个重组质粒pCAT-25、pCAT-118、pCAT—FD、pCAT—G219A、pCAT—A294C和pCAT—G219A—A294C。同时用pcDNA3．1（＋）构建了EIAV反式激活蛋白（Tat）基因的重组真核表达质粒pcTM7-D。将pcTM7-D分别与含有不同LTR的重组质粒共转染驴胎皮肤细胞，考察Tat对LTR启动子活性的增强作用。结果表明，在皮肤细胞中Tat蛋白可以特异性增强来源于皮肤细胞弱毒疫苗株LTR的启动子活性，而对白细胞源的LTR无明显增强作用；TAR起始位点和poly（A）的单碱基突变和联合突变对Tat的反式激活作用并无明显影响。     

马传染性贫血病驴白细胞弱毒株的致弱及免疫机理的研究

马传染性贫血病 (EIA)是由反转录病毒科慢病毒属的马传染性贫血病毒 (EIAV)引起的一种马属动物传染病。在慢病毒属中 ,EIAV与人免疫缺陷病毒 (HIV)在传播形式 ,单核细胞为病毒贮存库 ,病毒形态结构 ,病毒持续感染 ,病毒抗原漂移 ,EIAV的 P2 6与 HIV的 P2 4之间抗原交叉反应等都更为相似。至今 ,我国马传染性贫血病驴白细胞弱毒疫苗 (DL V)是目前世界上唯一成功应用的慢病毒疫苗 ,是慢病毒免疫预防很有希望的研究模型。因此 ,揭开 DL V的致弱及免疫机制 ,这使 EIAV有可能作为研究 HIV等慢病毒的致病机理及免疫机制的模型。EI…     

Induction of a cell membrane antigen by equine infectious anemia virus.

Equine fibroblasts persistently infected with equine infectious anemia virus acquire a new cell membrane antigen demonstrable by indirect radioimmunoassay, using infected horse serum as an antibody source.     

带有组氨酸标签的马传染性贫血病毒感染性分子克隆的构建

马传染性贫血(EIA)弱毒疫苗的广泛使用存在野毒和疫苗毒鉴别困难的问题.本研究以已构建的马传染性贫血驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆(pOK8266)为基础,在其S2基因内引入NspV酶切位点,将人工合成的编码6个组氨酸的寡核苷酸插入NspV位点,获得带有组氨酸标签的重组质粒pOK8266-HIS.将pOK8266-HIS转染驴白细胞,将驴白细胞转染产物传至第6代时,在电镜下观察到了典型的马传染性贫血病毒粒子.提取pOK8266-HIS衍生病毒的前病毒基因组DNA,通过PCR扩增和测序表明,衍生病毒基因组中引入了6个组氨酸标签,从而获得了带有分子标志的马传染性贫血弱毒疫苗株,为野毒株和疫苗病毒的鉴别诊断奠定了基础.本研究还证明了S2基因中的插入突变并不影响马传染性贫血病毒的体外复制.     

恒河猴Tetherin蛋白对马传染性贫血病毒抑制作用的研究

Tetherin是新发现的具有限制多种病毒从细胞膜释放功能的细胞蛋白。本研究采用RT-PCR技术从恒河猴巨噬细胞中扩增Tetherin基因,将其插入真核表达载体pEF4/myc-His B中构建重组质粒pHF-Tetherin。并将其转染293T细胞,通过western blot和激光共聚焦分析Tetherin在293T细胞中的表达及亚细胞定位。将pHF-Tetherin分别与马传染性贫血病毒(EIAV)或猴免疫缺陷病毒(SIV)假病毒粒子感染性质粒共转染293T细胞,分析Tetherin对EIAV及SIV出芽的限制作用。研究结果表明,pHF-Tetherin转染293T细胞48 h后可以检测到Tetherin的表达并定位于细胞膜,而且该蛋白具有抑制EIAV及SIV从转染细胞中出芽的生物学功能。