猪BMP4基因原核表达及优化

构建猪BMP4基因pET32a-BMP4原核表达质粒,在E.coli中表达并分离纯化目的蛋白。采用PCR技术以pMD18-T-BMP4重组质粒为模板扩增获得BMP4基因编码成熟肽片段,并插入到原核表达载体pET32a中,构建原核表达重组质粒pET32a-BMP4。将阳性重组质粒转化到表达宿主菌中,在不同的温度、IPTG浓度和时间下进行诱导表达,SDS-PAGE分析鉴定。构建的重组表达质粒经PCR、酶切和DNA测序鉴定与预期的结果一致,表达宿主菌经IPTG诱导表达分子量约为31 ku的融合蛋白,表达产物占菌体总蛋白的30%以上。成功构建了pET32a-BMP4原核表达质粒,并经纯化得到BMP4目的蛋白,为进一步研究该蛋白的结构和功能奠定基础。     

绿色荧光蛋白基因原核表达质粒pET32a-AcGFP1的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

 为了构建绿色荧光蛋白AcGFP1基因的原核表达载体pET32a AcGFP1,并诱导使其在大肠杆菌中高效表达,本研究以pIRES AcGFP1质粒为模板,采用PCR技术特异性扩增绿色荧光蛋白AcGFP1基因,通过酶切和连接使其与原核表达载体pET32a（+）构成重组子,经PCR、酶切和测序鉴定后,重组质粒转化大肠杆菌Rosetta（DE3）,用不同浓度的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达绿色荧光蛋白,经15% SDS PAGE鉴定,结果显示：重组质粒pET32a AcGFP1中的AcGFP1序列与Clontech公司的pIRES AcGFP1质粒的AcGFP1序列完全一致,表明本实验已成功构建了含有绿色荧光蛋白基因AcGFP1的原核表达质粒。此外,pET32a AcGFP1转化Rosetta（DE3）,经不同浓度的IPTG诱导,SDS PAGE检测均获得高效表达,为今后构建pET32a(+) TAT AcGFP1融合表达载体以及深入研究TAT的细胞膜穿透作用的机制奠定基础。     

牛肌生成抑制素基因全序列的克隆及原核表达

根据GenBank上发表的牛肌生成抑制素(MSTN)基因编码序列设计引物,利用RT-PCR技术,以牛肌细胞总RNA为模板,对牛的肌生成抑制素(MSTN)基因编码序列进行扩增.经酶切鉴定、DNA测序和氨基酸序列分析证实MSTN基因克隆成功.从pMD18T-MSTN克隆中获得MSTN编码序列,将其与pET32a( )质粒连接,构建pET32a( )-MSTN重组质粒,重组菌经IPTG诱导在大肠杆菌中表达的MSTN蛋白是以包涵体的形式表达的,SDS-PAGE特异区带分子量为60 ku.     

新疆南疆地区牛乳头瘤病毒1型L1基因克隆及原核表达

本研究以构建牛乳头瘤病毒1型L1基因原核表达系统pET32a-L1及表达牛乳头瘤病毒1型L1蛋白为目的,为进一步制备基因工程疫苗奠定基础.从牛体表赘生瘤组织中提取DNA,PCR扩增L1基因片段,克隆至pGM-T载体.测序成功后将目的片段和表达载体经双酶切连接于表达载体pET32a中,并构建重组质粒pET32a-L1.重...     

犬瘟热病毒N基因原核表达质粒的构建

为了对N蛋白表达作为诊断用抗原、检测犬瘟热病毒(CDV)特异性抗体提供参考依据,以已构建的含犬瘟热病毒N基因的pMD18-N质粒为模板,利用特异性引物进行PCR扩增,得到1572 by的N基因开放阅读框,将所得N基因克隆至经相同双酶切处理后的pET32a(+)原核表达载体中,获得重组质粒pET32a(+)-N,并转化至...     

产气荚膜梭菌肠毒素基因原核表达载体的构建

以含C型产气荚膜梭菌分离株(CP2)肠毒素基因的克隆载体pMD18-T-cpe为材料,根据产气荚膜梭菌开放阅读框设计合成一对特异性引物,采用PCR技术对其进行扩增,经BamHI和EcoRI双酶切后,从胶上回收目的基因,与经过相同两种内切酶处理的原核表达栽体pET32a连接,转化大肠杆菌DH5a感受态细胞后,提取质粒进行PCR和BamHI/EcoRI双酶切鉴定后测序.结果表明,肠毒素基因已成功地克隆到原核表达栽体上(重组质粒命名为pET32a-cpe),从而构建了产气荚膜梭菌肠毒素基因的原核表达质粒.     

人血管内皮细胞生长因子受体sFlt-1胞外区cDNA在婴儿双歧杆菌中的表达和鉴定

目的：构建携带重组基因sFlt-1的婴儿双歧杆菌基因转运载体系统,并观察其对人脐静脉内皮细胞生长的影响。方法：将编码血管内皮细胞生长因子受体sFlt-1胞外区1-3loop316个氨基酸残基的cDNA插入到pET32a构建了重组表达质粒pET32a-sFlt-1,转化入婴儿双歧杆菌,转化婴儿双歧杆菌,阳性克隆菌经质粒提取、酶切鉴定。结果：得到两条大小分别与基因sFlt-1及pET32a质粒片段大小相符的电泳条带,PCR检测到外源性sFlt-1基因已成功导入婴儿双歧杆菌,在体外实验中,重组质粒组人脐静脉内皮细胞形态出现明显改变,细胞生长受到明显抑制,而空质粒组细胞无明显变化。结论：成功构建携带重组基因sFlt-1的婴儿双歧杆菌基因转运载体系统。     

猪源肠球菌两种致病基因和表型的检测

为调查53株猪源肠球菌2种致病基因和2种表型的分布,应用聚合酶链反应检测53株肠球菌的2种致病基因,用50ml/L兔血平板和30g/L明胶平板检测β溶血和明胶溶解表型。检测结果表明,溶血素激活基因(cylA)明胶酶基因(gelE)为猪源肠球菌的主要致病基因;粪肠球菌2种致病基因和2种表型的检出率高于屎肠球菌;来源于新鲜猪肉中的粪肠球菌存在一定的致病力,提示注意食品卫生安全;在新鲜猪肉中检测到2株鸟肠球菌,基因型和表型检测说明其存在较弱毒力。     

假肠膜明串珠菌D-乳酸脱氢酶基因的克隆与表达

利用PCR的方法从假肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides 1159)的DNA中扩增得到D-乳酸脱氢酶基因,构建重组克隆质粒(pMD19-T-DLDH),转化DH5α进行蓝白斑筛选,得到阳性克隆提取质粒双酶切验证。连接pET-32a表达质粒,构建重组表达质粒,提取质粒双酶切、测序验证,测序结果与原序列基本相符。得到重组表达质粒pET-32-DLDH转化BL21大肠杆菌IPTG诱导表达,SDS-PAGE显示有明显大小约为19 ku的特异蛋白条带。     

犬细小病毒VP_2基因原核表达载体的构建与分析

从犬细小病毒/犬瘟热进口二联苗中提取犬细小病毒基因组DNA,以此为模板进行PCR扩增,PCR产物经BamH I和XhoI双酶切后,克隆至pET22b(+)质粒的相应位点上,构建了原核表达载体pET22b/VP2.重组质粒经限制性内切酶酶切和核苷酸序列分析表明,VP2基因已正确克隆到pET22b(+)载体上,从而成功地构建了pET22b/VP2表达载体.     

猪圆环病毒2型核衣壳蛋白基因原核表达载体的构建及表达

用PK-15细胞增殖PCV-2病毒,提取病毒DNA,用PCR方法扩增核衣壳蛋白（Cap蛋白）全基因,克隆到pET-32a载体中,构建了表达载体pETORF2,转化入大肠杆菌BL21中,用胛G进行诱导表达,结果显示表达的蛋白大小与设计不符。同样的方法,又构建了表达栽体pETRF2,含有Cap蛋白的部分基因,结果显示表达的蛋白大小依然与设计不符。对Cap蛋白编码基因进行改造,在不改变原氨基酸序列的基础上,把其编码密码子全部换成大肠杆菌偏爱密码子,根据此序列,设计了4条长引物,参照SOE的原理,用降落PCR的方法扩增出含Cap蛋白表位基因的片段,并克隆到pET-32a栽体中,成功构建了重组表达栽体pETP1P4。SDS-PAGE电泳结果表明,表达的蛋白分子量与设计相符。     

金黄色葡萄球菌wood46株eno基因的克隆及原核表达

为获得Eno的重组蛋白,采用PCR法从金黄色葡萄球菌wood46株基因组扩增eno基因,并连接到pMD18-T载体上,转化至BL21感受态细胞中;重组质粒经PCR及酶切鉴定后,送上海生工测序。将鉴定正确的质粒酶切回收产物与原核表达载体pET-32a连接,然后转化至BL21感受态细胞,对平板筛选的阳性质粒进行PCR和酶切鉴定。对鉴定正确的重组菌进行诱导表达并纯化。实验结果表明成功构建了pET32a-eno表达载体,并获得了该纯化蛋白。该实验结果为S.aureus亚单位疫苗研究奠定了一定的基础。     

山羊痘病毒P32基因重组真核表达载体的构建与鉴定

根据已发表的山羊痘病毒P32基因序列设计合成1对带有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的引物,用PCR方法从分离的贵州山羊痘病毒LD毒株中扩增出含P32基因的DNA片段,纯化后,经BamHⅠ/HindⅢ双酶切,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),获得pcDNA3.1(+)-P32/LD重组载体。通过PCR、双酶切及测序鉴定,证实重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-P32/LD构建成功。     

水疱性口炎病毒N基因原核表达载体的构建及表达

针对水疱性口炎病毒(VSV)N基因设计特异性引物,在引物中分别加入EcoR 和Xho 酶切位点。RT-PCR扩增后得到目的基因,将其克隆到表达载体pET30c,连接产物转化于DH5α菌株,在含Kan+的平板上37℃培养24h,然后挑取白色菌落,鉴定为阳性者,转化于BL21菌株,再经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导获得高效表达。表达融合蛋白分子质量为53ku(目的蛋白大约47ku),同预期蛋白大小相近。Westernblot检测表明,其能与本病毒阳性血清发生特异性反应,表达蛋白有望成为有价值的VSV诊断抗原。     

鸡PERK的原核表达及多克隆抗体的制备

根据鸡的蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)基因序列进行抗原肽分析,选择含大片段抗原表位区约1 500 bp的一段基因(15~1 515 bp)设计一对特异性引物后进行RT-PCR扩增,并构建pET-32a(+)-PERK重组质粒,将其转化至BL21(DE3)感受态细胞中.优化诱导表达条件,纯化重组蛋白后免疫兔并制备多克隆抗体.PCR鉴定、酶切鉴定和测序结果表明,pET-32a(+)-PERK重组质粒构建成功.SDS-PAGE电泳鉴定结果表明,重组蛋白在1.0 mmol·L-1IPTG、25℃下诱导9 h时的表达量最大.蛋白纯化结果表明,100 mmol·L-1咪唑洗脱液可较好地洗脱重组蛋白,获得较多的纯化蛋白.免疫结束后,抗体效价检测结果表明,制备的多克隆抗体效价达1∶32 000,可以与重组蛋白特异结合.     

OsMAPK4基因的原核表达及蛋白纯化

构建OsMAPK4基因的原核表达载体,对表达产物进行鉴定和纯化,为转OsMAPK4基因植株后期的Western Blot检测提供抗原。用PCR方法从本实验室已构建的植物表达载体pUM4上扩增OsMAPK4基因,将其克隆至pET32b原核表达载体,构建重组载体pET32b-MAPK4。转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析。用Ni-NTA亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,用Western Blot进行蛋白鉴定。结果表明,原核表达载体构建正确;SDS-PAGE分析及Western Blot鉴定中,均出现了与DNAMAN预测的43.6 ku大小一致的蛋白条带;得到纯化蛋白。成功构建了OsMAPK4基因的原核表达载体,得到纯化蛋白,为转OsMAPK4基因水稻植株体内蛋白表达活性的检测提供了抗原。     

犬瘟热病毒H基因原核表达质粒的构建

为H蛋白进一步表达作为诊断用抗原、建立特异的犬瘟热病毒(CDV)抗体检测方法及CDV的预防奠定基础,以已构建含有犬瘟热病毒H基因的pMD18-H质粒为模板,利用合成的特异性引物进行PCR扩增,得到1824bp的目的DNA片段,将所得H基因克隆至经相同双酶切处理后的pET32a(+)原核表达载体中,获得重组质粒pET32...     

猪伪狂犬病病毒GZ-Z1株gE基因原核表达质粒的构建

为给猪伪狂犬病病毒的诊断及防治提供科学依据,参考GenBank中猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因序列,设计1对特异性引物,以PRV GZ-Z1株DNA为模板,进行gE基因的PCR扩增,扩增产物与pMD18-T载体连接、鉴定正确后,再亚克隆至pET32a(+)原核表达载体中,经鉴定后测序。结果表明:目的片段为PRV gE基因完整开放阅读框,大小1 734bp,编码577个氨基酸,在pET32a(+)载体中位置正确,表明,pET32a-gE原核表达质粒构建成功。该基因与国内外其他18株PRV的gE基因推导氨基酸序列同源性为94.8%～98.6%;与国外分离株属同一个进化分支,遗传关系相对较近;而与国内Fa、Min、GDSH等毒株亲缘关系较远。     

抗除草剂bar基因植物表达载体的构建与抗性功能的检测

摘要：根据GenBank上发表的抗除草剂har基因序列设计引物,通过高保真DNA聚合酶进行PCR扩增,获得har基因片段,连接在pMD18-T中间克隆载体上,用限制性内切酶XbaI和BamHI酶切后连接到pBI121上获得pBI121-bar。用HindⅢ内切酶切含Bt-4AB基因的质粒并与pBI121-bar重组,重组质粒命名为pBI121-bar／Bt。重组质粒导人农杆菌LBA4404工程菌中,转化新海24号棉花胚性愈伤组织。PPT抗性实验证明,构建的pBI121-bar／Bt载体获得抗除草剂抗性,并筛选出PPT临界筛选浓度为3．0mg／L。