猪RBP-4基因原核表达载体的构建及表达

为构建猪RBP-4基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达蛋白。取成年母猪正常卵巢组织提取总RNA,RT-PCR后回收扩增产物,构建表达载体pEASY-E1-RBP4,转化BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达。测序结果显示,RT-PCR获得的cDNA全长序列与GenBank中的序列基本一致。原核表达产物经SDS-PAGE电泳鉴定,其以包涵体形式表达。试验成功构建了猪RBP4基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达,为后续蛋白纯化及抗体的制备奠定基础。     

猪轮状病毒VP6基因的原核表达载体构建和表达

根据已报道的猪轮状病毒VP6基因序列设计了2对引物,利用pGEM-T-Easy-VP6重组质粒为模板,经PCR扩增获得了1 194 bp的产物。将扩增片段分别插入到pET5α和pGEX-4T-2构建表达载体,并分别在大肠杆菌BL21(DE3)Plyss和ER2566中表达。结果表明:成功构建了重组质粒,而且该片段在大肠杆菌中也成功表达,获得了大小为44 kD的蛋白。     

猪β防御素3表达载体的构建及其 在大肠杆菌中的表达

根据Gen Bank上发表的猪β防御素3(p BD3)基因的序列,通过生物学软件预测其成熟肽序列。提取猪舌组织RNA,设计引物,通过PCR的方法扩增得到约150 bp的p BD3成熟肽基因序列,构建其原核表达载体p ETp BD3,并获得工程菌株BL21-pET-p BD3。IPTG诱导表达后,比对照多表达了1条约16 k D的蛋白条带,通过免疫蛋白印记说明所表达的蛋白为带有His·Tag的融合蛋白,证明p BD3成功表达。     

单核增生性李氏杆菌溶血素的原核表达及可溶性分析

对单核增生性李氏杆菌的主要毒力基因hlyA进行大肠杆菌原核表达,分析其表达蛋白的可溶性并纯化。根据hlyA基因设计特异性引物,细菌煮沸破裂提取基因组,PCR扩增出目的条带。连接转化至克隆载体pMD18-T,测序正确后连接表达载体pET-30a(+),酶切和PCR鉴定正确后转化至BL21(DE3),构建重组质粒pET-30a-hlyA。IPTG诱导表达蛋白,并分析其可溶性。PCR扩增的hlyA基因全长约1 600 bp,成功构建了重组质粒pET-30a-hlyA,转化大肠杆菌诱导表达了溶血素蛋白,SDS-PAGE分析表达产物,结果显示表达的蛋白分子量约为60 kD,以可溶性和包涵体2种形式存在,且以可溶性为主要形式。成功克隆和表达了单核细胞增生性李氏杆菌hlyA基因和溶血素蛋白,并得到纯化蛋白。     

猪α干扰素原核表达载体的构建及表达

以重组克隆质粒pGEM-T-IFN-αZ为模板,PCR扩增杂种猪α干扰素,将其插入原核表达载体pET-43.1a-c( )中,构建了猪α干扰素原核表达载体pET-IFN-α,实现了猪α干扰素在大肠杆菌BL21中的表达.SDS-PAGE电泳、Western-blotting检测均出现了特异性的条带.SDS-PAGE电泳分析表明,表达的融合蛋白以可溶性形式存在.经薄层扫描分析,表达产物约占菌体总蛋白的29.8%.     

致羔羊脑炎粪肠球菌XJ05 Pfs基因的克隆、功能序列分析及原核表达

采用PCR技术从致羔羊脑炎粪肠球菌XJ05基因组中扩增得到甲硫腺苷/S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(Pfs)基因的全序列,对其功能序列进行分析,同时与其他细菌相应序列及编码的氨基酸进行同源性分析,构建该基因的原核表达载体,对表达蛋白进行反应原性分析。结果显示:XJ05的Pfs基因全长696bp,与XJ01、XJ08、XJ11,与屎肠球菌TX 2466之间的同源性在99.1%以上,其中,XJ05与V583为100%,且关键的功能序列相同,与肺炎链球菌同源性在55.8%以上、霍乱弧菌同源性在55.0%以上;pfs基因编码231个氨基酸,XJ05、XJ01、XJ08、XJ11与肺炎链球菌、霍乱弧菌、粪肠球菌V583、屎肠球菌TX 2466的同源性在86.43%以上;构建的重组质粒经诱导后表达蛋白分子量为28ku,Western blot检测显示特异性条带。结果表明,表达的融合蛋白具有良好的反应原性。     

宁乡猪生长激素基因的克隆及其原核表达载体的构建

[目的]研究了宁乡猪生长激素基因(nxGH)的克隆及其原核表达载体的构建。[方法]根据已报道的猪生长激素基因序列设计了1对特异性引物,应用RT"PCR技术从宁乡猪脑垂体中克隆了nxGH编码区序列。[结果]扩增片段全长651 bp,共编码216个氨基酸。该序列与已报道的三元和五指山猪生长激素cDNA基因核苷酸序列同源性为99.85%。将nxGH cDNA序列定向插入pET"32a原核表达载体中,成功构建重组原核表达质粒pET"GH。[结论]为下一步制备宁乡猪生长激素抗体奠定了基础。     

蜂毒前溶血肽原基因的改造及其原核表达

为进一步探讨利用基因工程技术生产蜂毒肽的方法,根据大肠杆菌密码子偏好性、基因GC含量、合成蛋白加工需求等对蜂毒前溶血肽原基因序列进行改造,并利用人工化学合成方法完成改造后全基因的合成。构建蜂毒前溶血肽原与GST融合表达重组质粒pGEX-4T-1/PPMel,转化大肠杆菌BL21感受态细胞后分别在20、37℃条件下经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并利用SDS-PAGE和Western Blot对产物进行检测。结果表明,表达体系成功表达了目的融合蛋白,在20℃条件下可获得可溶性表达产物,为进一步分离纯化目的蛋白及获得蜂毒肽提供了基础。     

金花茶CnCHS基因原核表达载体的构建及表达分析

根据已经克隆得到的金花茶（Camellia nitidissima Chi．）查尔酮合成酶基因序列,设计引物对P1／P2扩增出该基因全长并将其构建到原核表达载体 pGEX 4T 1中,转入大肠杆菌BL21后,用浓度为0．4 mmol／L的IPTG诱导其表达。SDS PAGE电泳检测结果显示,被诱导的大肠杆菌菌体中出现了约68 ku的特异融合蛋白,表明该基因在大肠杆菌中成功表达。     

猪肌生成抑制素功能区编码基因的原核表达与纯化

根据猪肌生成抑制素基因设计1对引物,PCR扩增出猪肌生成抑制素功能区编码基因片段,将该片段克隆至pGEM-T载体中。重组克隆质粒经序列分析,克隆序列与目的基因序列完全一致。重组克隆质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切,目的基因片段克隆到表达质粒径pGEX-4T-1,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,融合蛋白占菌体可溶性总蛋白的18%以上。     

花生AhSOS2基因原核表达载体的构建及表达

SOS2(Salt Overly Sensitive 2)是植物中一类耐盐相关基因的统称,在植物对盐害的响应及适应过程中具有重要作用。本试验以花生AhSOS2基因全长cDNA为模板,经PCR扩增获得AhSOS2的蛋白编码区,将该区段与表达载体pET-28a(+)融合,构建获得原核表达载体pET-28a-AhSOS2,并进一步在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。经1.0 mmol/L IPTG诱导后,获得一条约51 kD的融合蛋白条带,且随着IPTG诱导时间的延长,蛋白表达量逐渐提高,诱导8 h可获得较高的蛋白表达水平。     

小鼠Nanog基因原核表达载体的构建及表达

【目的】构建小鼠Nanog基因原核表达载体并进行表达，以期得到大量GST融合蛋白。【方法】根据GeneBank中的Nanog序列及pGEX-KG中的多克隆位点设计引物，以含有Nanog基因片段的pNA992重组质粒为模板，经PCR扩增出918 bp的DNA片段。将所得片段与pGEX-KG载体连接，转化TGⅠ大肠杆菌，筛选阳性克隆，其扩增片段测序结果与原序列一致，表明原核表达载体pGEX-KG-Nanog已构建成功。提取pGEX-KG-Nanog质粒转化到BL21（DE3）表达菌株中，经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE电泳鉴定，并优化其表达条件。【结果】在大肠杆菌中获得Nanog基因融合表达，主要以包涵体形式存在；融合蛋白的分子量为63 kD；以IPTG终浓度为0.8 mmol•L-1，诱导5 h后融合蛋白产量最高。【结论】小鼠Nanog基因在大肠杆菌中获得了高效表达，为今后Nanog蛋白的多克隆抗体制备奠定基础。     

稻瘟病抗性基因Pi36原核表达载体构建·表达与鉴定

[目的]研究稻瘟病抗性基因Pi36的结构和功能。[方法]利用双酶切构建Pi36基因CC、NBS结构域的原核表达载体,通过菌落PCR鉴定和测序验证阳性克隆。然后分别收集不同浓度IPTG诱导,不同温度30和37℃分别培养的大肠杆菌细胞提取蛋白,利用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达情况。[结果]当IPTG浓度为1mmol/L、30℃培养3h,目的蛋白表达量最大。[结论]为进一步研究稻瘟病抗性基因Pi36的抗病机理奠定基础。     

增强型绿色荧光蛋白原核表达载体的构建及其表达

以EGFP为标记基因,原核表达质粒pGEX-4T-1为载体,成功构建重组质粒pGEX-4T-EGFP,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)。用IPTG进行诱导表达,通过紫外照射和SDS-PAGE检测其在大肠杆菌中的表达情况,为原核表达系统提供新的报告基因和筛选标记。     

内切葡聚糖酶基因在穿梭载体中的表达研究

将无信号肽编码序列的内切葡聚糖酶基因(GenBankNo.DQ782954)与表达载体PMK4连接后转化大肠杆菌DH5α,筛选出阳性转化子DH5α-PMK4-egls,并将提取的质粒转化到枯草芽孢杆菌WB600原生质体内,获工程菌WB600-PMK4-egls。同时,通过刚果红染色和SDS-PAGE分析表明,该基因在枯草芽孢杆菌中得到了表达。通过优化培养基因工程菌,胞外上清液中的酶活力达998U,该酶促反应的最适温度为60℃,最适pH为6.0,且pH在4.5～7.5,温度在30℃～65℃范围内,可保持最高酶活的70%以上。     

大肠杆菌原核表达载体pSBET-His的构建

为了构建原核表达载体pSBET-His。pSBETa质粒经XbaI和BamH I限制性内切酶双酶切,获得原核表达载体的骨架。以pET28a(+)为模板,通过高保真PCR法应用T7 promoter引物和T7 terminator引物对pET28a(+)载体T7表达区域进行扩增,PCR产物电泳纯化后经双酶切和纯化获得138 bp含His-Tag序列的片段。将pSBET原核表达载体骨架和含有His-Tag序列的片段进行连接后转入DH5α感受态细胞中,经菌落PCR及酶切筛选构建pSBET-His。成功构建了pSBET-His原核表达载体。应用该载体表达的蛋白质,可采用镍离子亲和层析法进行纯化。该研究为应用pSBET-His载体进行烟草丛顶病毒ORF4的原核表达研究奠定了基础。     

曲霉来源植酸酶基因phyA的克隆及原核表达

在饲料中添加植酸酶可以提高植物性饲料中磷的利用率和单胃动物对矿质元素的吸收,并减轻动物排泄物中磷对环境的污染,具有广泛的应用前景。本试验以自行分离得到的黑曲霉菌株基因组DNA为模板,克隆得到植酸酶phyA基因,并将其连接到原核表达载体pET21b、pET30a上,利用热激转化的方法将重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中,构建植酸酶大肠杆菌工程菌株。工程菌株在经诱导后可以产生大量的植酸酶蛋白。     

蓝舌病病毒 NS4 基因原核表达载体的构建与表达

蓝舌病病毒（Bluetounge virus,BTV）非结构蛋白4（Non-structural protein 4,NS4）拮抗干扰素的产生,在BTV逃避宿主天然免疫的过程中发挥重要作用。利用PCR扩增得到 NS4 基因,与空载体pET-32a双酶切后连接,构建pET-32a- NS4原核表达载体;将pET-32a- NS4转化至E.coli BL21感受态细胞,以IPTG诱导表达;利用SDS-PAGE确定IPTG的最佳诱导浓度、时间与重组蛋白的表达形式;利用Western blot分析重组蛋白的表达情况。结果表明,成功构建pET-32a- NS4原核表达载体;IPTG最佳诱导浓度为 0.8 mmol/L,时间为6 h,蛋白主要以包涵体形式表达;Western blot在27 ku处可见目的条带,与预期相符。本研究成功构建pET-32a- NS4原核表达载体,实现NS4蛋白的大量、高效表达,为进一步探究NS4蛋白在BTV拮抗宿主天然免疫中的作用机制提供材料。