牛源停乳链球菌荚膜多糖提取及纯化方法研究

为建立最佳的牛源停乳链球菌荚膜多糖提取和纯化方法,用停乳链球菌地方菌株,开展了细菌生长过程中菌液浓度与荚膜多糖得率、发酵液pH值对荚膜多糖得率、不同浓度乙醇沉淀核酸及多糖的效果、温度和时间对荚膜多糖得率、冷酚抽提次数对荚膜多糖得率和蛋白含量的影响等一系列实验,同时对制备的3批荚膜多糖进行了各项指标的检测。结果表明,牛源停乳链球菌在p H值为7.0的发酵培养液中培养8 h时荚膜多糖得率最高,最佳的去核酸乙醇浓度为25%,最佳沉淀多糖的乙醇浓度为80%,最佳温度和时间为4℃作用24 h。制备的3批荚膜多糖,其荚膜多糖回收率均在85%以上,蛋白质与核酸含量均低于1%,唾液酸含量在12.5%～14.3%间。说明建立的牛源停乳链球菌荚膜多糖提取纯化方法纯化荚膜多糖得率和纯度均比较高,符合疫苗生产要求。     

屎肠球菌荚膜多糖的提取纯化及其多糖含量的测定

为提取纯化屎肠球菌（E.faecium）荚膜多糖（CPS）并测定其多糖含量,试验采用高压法破碎菌体,加入核糖核酸酶（25 μg/mL）、脱氧核糖核酸酶（0.5 mg/mL）、溶菌酶（0.25 mg/mL）及蛋白酶K （1.25 mg/mL）等去除核酸和蛋白质,得到荚膜多糖粗提物,经过30 ku和100 ku超滤离心管超滤浓缩和DEAE Sepharose Fast Flow层析柱层析后,得到纯化的屎肠球菌荚膜多糖,再利用苯酚-硫酸法测定其含量。结果表明,成功从屎肠球菌中提取纯化出荚膜多糖,其含量为75.21%,初步确定了屎肠球菌荚膜多糖的提取纯化方法,为今后相关疫苗的研制奠定了基础。     

牛对纯化溶血性巴氏杆菌荚膜多糖的血清学反应

将纯化的溶血性巴氏杆菌生物Ａ型血清１型的荚膜多糖（ＣＰ）与盐溶液、氢氧化铝和福氏不完全油佐剂混合后，给３组犊牛注射不同的抗原制剂、５头成年母牛注ＣＰ盐制剂。接种后４周进行二次注射。将每周采集一次的血清样本以间接血凝试验检测溶血性巴氏杆菌特异性抗体；以ＥＬＩＳＡ检测ＣＰ特异性抗体。以纯化的ＣＰ刺激犊牛，能产生ＣＰ特异性ＩｇＭ、ＩｇＧ１和ＩｇＧ２，成年母牛以产生ＩｇＭ和ＩｇＧ１占优势。第二次注射ＣＰ抗     

金黄色葡萄球菌荚膜多糖血清1型和2型的研究进展

金黄色葡萄球菌荚膜多糖在其感染中起着重要的作用。文章主要介绍了荚膜多糖血清1型和2型的发现、生化性质及其在免疫中的作用。天然荚膜多糖只对同株型起到保护作用,而纯化的荚膜多糖只有少量的免疫原性。从而了解到完全抗原只能用灭活金黄色葡萄球菌或者纯化的荚膜多糖结合蛋白质来实现。     

金黄色葡萄球菌荚膜多糖的研究进展

金黄色葡萄球菌作为引起人和动物发病的一种主要的致病菌,已严重影响到人们的身体健康和畜牧业的发展。致病性金黄色葡萄球菌多数含有荚膜成分,并且这种荚膜成分与金黄色葡萄球菌的毒力和抗噬菌作用有关。文章从金黄色葡萄球菌荚膜多糖的血清学分类、分子结构、影响因素、表达调控和致病机制等方面简要介绍了目前国内外关于金黄色葡萄球菌荚膜多糖的研究进展。     

小鼠附睾分泌蛋白Fam12b的原核表达与纯化

本研究旨在克隆小鼠附睾基因fam12b,构建pET28(a)-fam12b-fam12b原核表达重组质粒,从大肠杆菌Rosetta (DE3)中获得融合蛋白.应用RT-PCR方法从小鼠附睾中扩增出fam12编码序列,串联克隆至原核表达载体pET28(a),转化大肠杆菌Rosetta (DE3)细胞,诱导表达,Ni NTA纯化融合蛋白.结果显示,获得小鼠附睾基因fam12b,纯化后的融合蛋白经过SDS-PAGE和Western印记分析鉴定,在相对分子质量31 kD处有特异的条带,并获得高纯度融合蛋白.本研究成功克隆了小鼠附睾基因fam12b,并从Rosetta (DE3)中获得高纯度融合蛋白,为进一步研究Fam12b的功能创造了条件.     

低浓度阿奇霉素对猪链球菌2型蛋白表达、荚膜多糖与药物敏感性的影响

本研究通过探索低浓度阿奇霉素对猪链球菌2型蛋白表达、荚膜多糖与药物敏感性的影响,为进一步研究环境中低浓度抗生素对微生物的影响奠定基础。用低浓度阿奇霉素处理猪链球菌2型,利用蛋白质组学iTRAQ技术,筛选关键差异表达蛋白。同时测定猪链球菌2型的荚膜多糖含量和药物敏感性。结果显示,共鉴定到差异表达蛋白174个,占总鉴定蛋白的11.6%,多数差异表达蛋白参与催化和代谢过程,属于膜蛋白,其中,3个荚膜多糖蛋白、9个ABC转运蛋白、1个50 S核糖体蛋白、1个核糖体RNA甲基转移酶、1个DNA回旋酶上调表达;8个荚膜多糖蛋白、4个50S核糖体蛋白、4个30S核糖体蛋白、1个核糖体RNA甲基转移酶、1个DNA聚合酶IV下调表达。用低浓度阿奇霉素处理猪链球菌2型,发现其对多种抗生素的敏感性降低,存活下来的菌株,恢复正常培养后,药物敏感性恢复。用低浓度阿奇霉素处理猪链球菌2型,荚膜多糖含量也未发生大幅度变化。猪链球菌2型通过改变自身蛋白质组的表达量,以适应低浓度阿奇霉素的选择压力。与低浓度阿奇霉素共存时,猪链球菌2型开启外排泵系统,会增加细菌产生多重耐药的风险。     

无乳链球菌荚膜多糖的粗提及多糖含量测定条件优化

为提取无乳链球菌荚膜多糖,并对苯酚-硫酸法测定多糖含量条件进行优化。离心收集发酵上清液,超滤浓缩,经800mL/L乙醇沉淀提取无乳链球菌荚膜多糖;采用单因素试验对苯酚硫酸法测定条件进行优化,并对测定方法的可靠性进行验证。结果表明,从1L发酵液中提取到含量为38.51%的荚膜多糖0.36g;测定的最佳条件为:2mL样品液中,加入1 mL 50 mL/L的苯酚,5 mL浓硫酸,混匀后80℃作用20min,在1.5h内测定485nm处的光密度。在该条件下,平均加样回收率为99.96%,相对标准偏差为0.40%。说明从无乳链球菌发酵上清液中成功提取到荚膜多糖,建立了苯酚硫酸法测定荚膜多糖的最优条件。     

金黄色葡萄球菌荚膜多糖的制备及生物学特性

采用Cetavlon、冷酚、不同浓度乙醇沉淀、离心等步骤精制的荚膜多糖,用生物学、免疫学等方法分析检测其理化特性及免疫原性。结果表明:提取的荚膜多糖具有良好的多糖特性、结构特征和免疫原性。     

金黄色葡萄球菌荚膜多糖的制备及生物学特性

采用Cetavlon、冷酚、不同浓度乙醇沉淀、离心等步骤精制的荚膜多糖,用生物学、免疫学等方法分析检测其理化特性及免疫原性。结果表明：提取的荚膜多糖具有良好的多糖特性、结构特征和免疫原性。     

副猪嗜血杆菌SC096株荚膜多糖及其抗血清的制备

为获得副猪嗜血杆菌荚膜多糖及其抗血清,本试验采用热酚法提取副猪嗜血杆菌SC096株荚膜多糖,并进行SDS-PAGE及银染检测,然后用荚膜多糖制备的油乳疫苗免疫家兔制备抗血清,并进行琼脂扩散试验及间接血凝试验检测.试验结果显示,热酚法可制备高浓度的荚膜多糖;SDS-PAGE电泳及银染结果显示条带呈弥散性分布,荚膜多糖分子质量55 ku左右;琼脂扩散试验结果呈阳性;间接血凝试验中红细胞发生高达10孔滴度的凝集现象.副猪嗜血杆菌SC096株荚膜多糖的提取及其抗血清的制备,为其他含荚膜的细菌抗血清的制备提供了方法和理论依据, 也为细菌荚膜多糖抗原性及其疫苗研究奠定了基础.     

Extraction,Purification and Determination of Capsular Polysaccharide in Enterococcus faecium

In order to extract and purify the capsular polysaccharide of Enterococcus faecium and measure contents of polysaccharide, high pressure crushing methods and enzyme decomposition methods (RNase A (25 μg/mL), DNase (0.5 mg/mL), lysozyme (0.25 mg/mL) and protease K (1.25 mg/mL)) were used to remove the nucleic acids and proteins to obtain crude capsular polysaccharide, and centrifugal ultrafiltration with 30 and 100 ku ultrafiltration centrifuge tubes and DEAE Sepharose Fast Flow column chromatography were also adopted to obtain the purified capsular polysaccharides of Enterococcus faecium. Then the content of polysaccharide was determined by the phenol-sulfuric acid method. The results showed the capsular polysaccharide content was 75.21%. The results revealed that capsular polysaccharide ofEnterococcus faecium was extracted successfully. The method of extracting capsular polysaccharide in Enterococcus faecium was established initially.     

病原微生物荚膜多糖的生物学功能

荚膜多糖(capsular polysaccharide,CPS)是一种广泛存在于细菌、支原体、部分真菌等菌体表面的碳水化合物.同时,荚膜多糖有助于菌体抵抗干燥和低温等不利环境,并通过在菌体表面形成物理屏障阻碍宿主补体的杀伤与吞噬作用.在长期多种应激-压力环境下,病原菌已进化出多种免疫逃避机制并促进宿主感染;在非病原微...     

副猪嗜血杆菌血清5型间接血凝试验和间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立副猪嗜血杆菌（HPS）的血清学诊断方法，通过探索HPS荚膜多糖产生的最适体外培养条件，提取了HPS血清5型菌株的荚膜多糖（CPS），并以之为抗原分别建立了间接血凝试验（IHA）和间接ELISA两种抗体检测方法，对其特异性、敏感性和符合率进行了比较研究。结果表明，两种检测方法的特异性良好，但ELISA的敏感性是IHA的5～10倍，二者的阳性符合率、阴性符合率和总符合率分别为79．7％、55．2％和65．3％。用这两种方法检测了320份临床送检猪血清，IHA和ELISA的阳性率分别为40％和59％。结果证实，这两种方法适用于不同实验室条件下HPS的诊断和流行病学调查。     

蛹虫草多糖纯化工艺研究

为优化蛹虫草多糖的纯化工艺,以蛋白去除率和多糖保留率为指标,比较Sevage法、改良的Sevage法、澄清剂法三种方法对粗多糖中蛋白杂质的去除效果。本试验依次采用DEAE－52、Sephdex G －100葡聚糖凝胶柱层析进一步分离纯化蛹虫草多糖,再经Sephdex G－200柱色谱及高效液相凝胶色谱进行纯度检验。结果显示：澄清剂法蛋白去除率为93．4％,多糖保存率为90．7％;DEAE －52柱层析得到一个洗脱峰CP ,再经Sephdex G －100柱层析后得到两个洗脱峰CP－1和CP－2。对CP－1和CP－2进行纯度检验,发现两者皆为均一性多糖。     

牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌疫苗候选株的筛选及鉴定

为了筛选生长快、毒力强、免疫原性好、副反应小的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）灭活疫苗菌株,本试验选取6株来自不同地区致犊牛肺炎死亡的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌分离株,测定了培养基生长曲线、小鼠毒力、菌体脂多糖（LPS）含量及各菌株灭活菌苗免疫小鼠和家兔后的抗体效价,并进行了攻毒保护试验。结果显示,分离株Pm2、Pm3、Pm5生长速度较快、毒力较强、LPS含量较多,均含有与毒力和免疫相关的ptfA和fimA基因;免疫小鼠及家兔未发现明显不良反应,在二免后14 d血清抗体达1：64~1：128,强毒攻毒后全部存活,而PBS对照组全部死亡。本试验结果表明,Pm2、Pm3、Pm5均可作为多杀性巴氏杆菌灭活菌苗的候选菌株,其中Pm3作为首选株。