沙棘和沙枣根瘤中固氮放线菌物种多样性研究

[目的]以沙棘和沙枣根瘤为研究对象,深入研究固氮放线菌物种的多样性。[方法]以通常用于分离弗兰克氏菌属（Frankia）固氮放线菌的无氮BAP、S、JA、ISP4、CB-CcI3、DPM和FTW等为固体和液体培养基,对采集自内蒙古通辽和赤峰的沙棘（Hippophae）和沙枣（elaeagnus）植物根瘤进行放线菌的分离纯化,并依据16S rDNA序列测定结果对分离物进行系统发育分析。[结果]分离得到的8株放线菌分属于小单孢菌属（Micromonospora）、链霉菌属（Streptomyces）、野野村菌属（Nonomuraea）和假诺卡菌属（Pseudonocardia）,所有根瘤样品中均未分离到弗兰克氏菌属菌株;采用弗兰克氏菌属16S-23S rDNA间隔区序列的特异性引物对所采集的沙棘和沙枣植物根瘤总DNA进行PCR扩增,未出现特异性的16S-23S rDNA间隔区序列条带。[结论]非豆科植物根瘤内固氮放线菌具有物种多样性,为今后固氮放线菌物种多样性研究提供借鉴。     

沙棘根瘤的解剖学研究

为了解沙棘根瘤的固氮能力，对其进行了形态结构和解剖结构的研究。结果表明：沙棘（Hippophae rhamnoides)的根系发达，具有很强的分蘖能力，而且能和放线菌中的弗兰克氏菌（Frankia)共生，形成根瘤。对根瘤生长、发育及形成的泡囊进行了研究，明确了根瘤的寄生部位和泡囊的固氮情况，并深入研究了Frankia菌的分离培养以及根瘤的侵染过程。     

非豆科木本植物与放线菌共生固氮相关基因研究进展

氮素固定是地球上维持生产力的一个重要生态反应,是继CO2固定之后最重要的生化反应.非豆科木本双子叶植物与固氮放线菌Frankia共生形成根瘤固氮,这些植物对绿化荒山、防止水土流失和保护生态环境等具有重要的作用,它们是陆地生态系统中的重要供氮者.Frankia菌具有对宿主的侵染范围广、固氮活性比较强和对氧气不敏感等特性,在Frankia菌与农作物之间建立起新的共生固氮体系的可能性很大.利用生物工程技术和方法构建高效的Frankia工程菌和新的固氮共生体系将成为今后生物固氮研究领域中的发展方向和追求目标.重点介绍了弗氏放线菌中共生固氮相关的固氮基因和谷氨酰胺合成酶基因、根瘤中结瘤固氮相关的nod基因、血红蛋白cDNA克隆及其他根瘤特异蛋白cDNA克隆等方面的研究进展.参33     

沙棘根瘤内生菌株库构建与微生物多样性分析

  目的  沙棘Hippophae rhamnoides根瘤中拥有丰富的微生物资源，探究根瘤内生菌微生物多样性，比较高通量测序与纯培养方法的优劣。  方法  运用16S rRNA高通量测序技术探究沙棘根瘤内生菌相对丰度和多样性差异，并对根瘤内生菌进行分离纯培养，以完成内生菌株库初步构建。  结果  ①传统分离方法得到纯培养菌株96株，共4门8纲8目13科19属。在门分类水平上，相对丰度较高的主要为变形菌门Proteobacteria和厚壁菌门Firmicutes。②高通量测序分析6组样品(M1~M6)中共有14门34纲89目148科314属。在门分类水平上，相对丰度较高的主要为放线菌门Actinobacteria和变形菌门，两者相对丰度之和为87.50%~97.10%。在属的分类水平上，弗兰克氏菌属Frankia占绝对优势，相对丰度为20.12%~74.81%，平均相对丰度为51.49%。③高通量测序与纯培养方法的结果有明显差异，在科和属的分类单元上差异较大。  结论  2种方法都体现沙棘根瘤内生菌的多样性，但纯培养方法仅能够分离到部分内生菌，难以评估物种组成及相对丰度。高通量测序分析能够更为全面地反映多样性信息，且为优化纯培养条件而分离特定物种奠定基础。图3表3参41     

杨梅共生菌Frankia的分离培养及侵染特性

采用根瘤匀浆和根瘤切片法对福建南部、中部和东北部的杨梅根瘤共生菌进行了分离,并进行菌株培养、初步鉴定及侵染特性检测。结果获得6株共生菌,菌株具有分枝状菌丝、孢囊、泡囊等典型Frankia的特征性结构,经无氮诱导有固氮活性,在BAP液体培养基中生长良好,适宜的碳源为乙酸钠、丙酸钠和丙酮酸钠,适宜的氮源为酪蛋白。5个菌株生理类群为B型,细胞壁化学组分为Ⅲ型,菌株FMr16比较特异,具有串珠状菌丝体,生理类群为A型,细胞壁组分为Ⅱ型。侵染结果表明,6个菌株可侵染杨梅、沙枣、沙棘和四川桤木,但不使木麻黄结瘤,菌丝体接种效果好于根瘤匀浆接种,菌丝体分批接种效果优于单次接种。     

泡桐根瘤内生细菌的分离及初步鉴定

【目的】为了探究非豆科植物泡桐与微生物共生固氮体系,对泡桐根瘤内生细菌的分离培养条件 及其系统发育地位进行初步研究。【方法】对从广西钦州市采集的泡桐根瘤上分离纯化得到的根瘤内生细菌, 进行传统生理生化研究和 16S rDNA 系统发育分析。【结果】经分离纯化得到 9 株根瘤内生细菌,大部分菌株 能较好地利用 8 种碳源;78% 的菌株能利用铵盐,89% 的菌株能利用硝酸盐;所有的供试菌株在 3- 酮基乳糖 和淀粉水解试验中呈阴性;89% 的菌株能利用柠檬酸盐;B.T.B 反应除菌株 PG-7 产碱外,其余都产酸;33% 的菌株能使硝酸盐还原;有 56% 的菌株能在牛肉膏蛋白胨培养基上生长良好,多数菌株具备豆科植物根瘤菌的 一般生理生化特征。通过 16S rDNA 全序列分析,确定 9 株供试菌株可分为 4 个菌属,其中菌株 PG-1 和 PG-2 共属于土壤杆菌属（Agrobacterium）,PG-3、PG-5、PG-6、PG-8 和 PG-9 等 5 株菌株共属于根瘤菌属（Rhizobium）, PG-4 隶属于草螺菌属（Herbaspirillum）,PG-7 隶属于伯克氏菌属（Burkholderia）。【结论】分离自同一寄主 的根瘤内生细菌其生理生化特性方面存在较大的差异性,同时表现出了遗传的多样性。     

江南桤木等根瘤内生菌的分离和回接

从赤杨属(Aluns)江南桤木(Alnus traboculosa Hand)根瘤上分离到放线菌Frankia sp.F_3,从胡颓子属(Elaeagnus)厦门胡颓子(Elaeagnusoldhani Maxim)根瘤上分离到放线菌Frankia sp.FE4,蔓胡颓子(Eleaegnusglabra Thumb)根瘤上分离到放线菌Frankia sp.FE_3,均获得纯培养。 用光学显微镜和扫描电镜观察其形态特征,确认是属具有孢囊的放线菌。该菌慢生长型,在培养基内菌丝体发育好,无气生菌丝体。液体培养,在底部生长,属微好气性。孢囊形状不规则,囊内包着大量的不游动的孢囊孢子。菌丝分枝有隔,粗细不匀,革兰氏阳性。将分离菌F_3,FE_4,FE_3回接其宿主,感染结瘤,有固氮活性。     

杨梅根瘤Frankia菌分离株的遗传多样性研究

对分离自杨梅根瘤的10株Frankia菌分离株进行表型特性研究,并用特异引物扩增其16S rDNA,对扩增产物用2种限制性内切酶HinfⅠ和HaeⅢ进行酶切后,分析酶切图谱.结果表明:这10株Frankia菌分离株不仅表型存在差异,而且其酶切图谱差异较大,说明其基因型也有差异.即使从同一株荸荠种杨梅根瘤中,不同时间分离获得的Frankia菌分离株,表型和基因型也存在较大的差异,可能属于不同的基因种群.无论是从菌株表型分析,还是PCR产物的RFLP分析,都表明从杨梅根瘤中分离获得的Frankia菌分离株存在着丰富的遗传多样性.     

广西杨梅根瘤Frankia菌的分离和培养特性研究

采用根瘤切片法从广西本地杨梅根瘤中分离获得3株内生菌,经镜检、革兰氏染色和BAP无氮培养基培养,证实这3株内生菌为Frankia sp.,分别命名为MF3、MF6和MF9。对这3株分离株在不同碳源、氮源和pH值的培养特性进行研究。结果表明,3株分离株在分别以吐温-80、葡萄糖、丙酸钠为碳源的BAP培养基上生长良好,3株分离株对琥珀酸钠的利用较差;适宜的氮源为酵母膏、酪蛋白和氯化铵,尿素的利用率低。3株分离株均适合在pH 5.5～6.5范围内生长,pH 7.0以上生长受到抑制。     

黄芪根腐病生防菌株的筛选鉴定及其防效评价

以沙棘根瘤内生细菌为材料,筛选对黄芪根腐病具有生防效果的菌株,以期为黄芪根腐病的生物防治提供优质菌种。采用平板对峙法,筛选得到抑菌性能较强的沙棘根瘤内生细菌TT14,并检测其对4株黄芪根腐病原菌的抑菌活性;根据形态和培养特征,生理生化特性及16S rRNA基因序列分析,对菌株TT14进行鉴定;通过盆栽试验,测定菌株TT14发酵液对黄芪根腐病的防治效果。结果显示,25株沙棘根瘤内生细菌中,11株具有抑制黄芪根腐病的能力,其中5株对供试的4株黄芪根腐病病原菌都表现出较好的抑菌效果,在这5株内生菌中TT14抑菌效果最佳,其对4株病原菌的抑菌率均在54.52%以上;经鉴定菌株TT14为特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis);盆栽试验显示菌株TT14发酵液对黄芪根腐病有明显的生防效果,其防治效果达65.68%,较对照组提高38.08%。综上可见,沙棘根瘤内生细菌TT14具有较强的抑制黄芪根腐病的活性,并具有较好的生防效果。     

贵州救荒野豌豆高效根瘤菌株的筛选

【目的】筛选获得结瘤固氮能力强、促生效果好的土著高效救荒野豌豆根瘤菌菌株,为贵州喀斯特地区土壤改良应用提供优质菌株资源。【方法】采用刚果红YMA平板分离培养法,对贵州省不同生态功能区的救荒野豌豆根瘤进行分离、纯化,结合菌体形态结构和16S r RNA测序方法进行细菌种类鉴定,将筛选获得根瘤菌株与豆科模式植物百脉根进行盆栽回接试验,结合菌株固氮酶活性的测定,筛选土著高效根瘤菌株。【结果】从贵州省境内不同生态功能区的救荒野豌豆根瘤样品中分离获得53株形态、颜色和大小各异的根瘤细菌菌株,革兰氏染色后,共获得30株革兰氏阴性（G-）纯化菌株,经鉴定8株为根瘤内生细菌,22株为根瘤菌分属根瘤菌属（Rhizobium）和假单胞菌属（Pseudomonas）,其中Rhizobium的分布频率最高,达91%,豌豆根瘤菌（R. leguminosarum）的分布频率最高,达27%,分别是分离获得的优势属和优势种。将来自不同地域和种类的根瘤菌与百脉根进行盆栽回接试验后,共筛选得到优良固氮促生根瘤菌6株,即XDVR141-4、ZJVR339-3、WEVR362-3、WXVR365-1、WLVR370-5和B...     

玉米内生联合固氮菌的分离与鉴定

试验对玉米内生固氮菌进行分离、鉴定,并研究内生细菌与玉米的联合固氮活性。结果表明,从玉米中分离出5株具有联合固氮活性的菌株,分别为1株弯曲假单胞菌NFR19(Pseudomonas geniculata),2株产酸克雷伯氏菌NFL28与NFSt18(Klebsiella oxytoca),1株节杆菌NFR7(Arthrobacter sp.),1株纤维化纤维菌NFR10(Cellulosimicrobium cellulans)。研究首次分离出具有固氮活性的纤维化纤维菌,并证实节杆菌具有固氮活性。从环境中筛选新的玉米内生固氮菌资源,促进玉米生长,为玉米内生联合固氮细菌的应用奠定基础。     

马桑根瘤内生菌纯培养物的分离、回接及其生物学特性

多次采用根瘤切片法直接从野生的马桑根瘤中分离内生菌纯培养物均未获成功;但用同样方法从温室里人工接种形成的马桑根瘤中却分离到大量纯培养物。其中273株经盆栽回接后发现有24株能侵染结瘤;少数菌株还通过半固体斜面和珍珠岩盆栽回接成功。对10株纯培养物表型特性的研究表明,它们均具有Frankia的形态和培养特征;生理类型除有A、B两型外,尚出现有一类A、B混合型,其中凡属B型菌株的均能侵染结瘤,A型则不能,两株A、B混合型中有1株能结瘤,另1株却不能;碳、氮源利用特性和其它Frankia基本相似;细胞壁组分既有Ⅲ型也有Ⅱ型;全细胞鉴别性糖大多为木糖和半乳糖,少数菌株只含有半乳糖或木糖,或含有半乳糖、木糖和阿拉伯糖。DNA中G+C mol%为65%～74%。     

杨梅根瘤Frankia菌的分离和培养特性研究

从荸荠种杨梅根瘤中分离获得3个内生菌株,经显微镜检查、回接、固氮活性测定、革兰氏染色检测,证实这3个内生菌为3个Frankia sp.,分别命名为Mpc11、Mpc12、Mpa11,并对这3个分离株的培养特性进行了研究.结果表明,Mpc11、Mpc12、Mpa11 3个菌株的固氮酶活性分别为691 nmol乙烯/mg蛋白·h、689 nmol乙烯/mg蛋白·h和1039 nmol乙烯/mg蛋白·h.适宜于在BAP(有氮)固体培养基、BM+NZ和FMS液体培养基上生长.且分别以葡萄糖、丙酮酸钠(含量均为1 g/L)、吐温-20(含量为1 mL/L)为唯一碳源或分别以酪蛋白水解物、酵母抽提物(含量均为0.5 g/L)为唯一氮源的BAP培养基上生长良好;能利用丙酸钠,但利用率低;且均不能利用尿素.Mpc11和Mpa11分离株适宜于在pH5.5～6.5范围内生长,pH7.0以上则菌体生长受到抑制.     

Frankia菌侵染木麻黄与其共生结瘤程序

通过回接结瘤后定期制作半薄、超薄切片,在光学和电子显微镜下观察研究了分离自浙江省短枝木麻黄Casuarina equisetifolia根瘤的2株Frankia菌的侵染过程。结果表明:Frankia菌从根毛细胞侵入后向内部的皮层细胞延伸,受Frankia菌侵入的刺激,侵染的根毛细胞产生大量电子云密度不等的沉积物。沉积物包裹Frankia菌继续向内侵染,形成侵染线穿越细胞壁进入邻近细胞,最终到达根瘤。根瘤产生的时间程序为:接种 6 d 后Frankia菌已侵染根部细胞;接种 12 d 后形成了根瘤原基;15 d 后根瘤原基的部分薄壁细胞被Frankia菌侵染后,转变为前根瘤;接种 24 d 后前根瘤进一步生长发育伸长,突出皮层后形成新根瘤并最终发育成成熟瘤。Frankia菌的整个侵染过程为:Frankia菌侵染形成侵染线形成界面质穿壁繁殖泡囊孢子。根瘤的发育可概括为:根瘤原基前根瘤成熟瘤。图9参20     

砂生槐根瘤内生细菌多样性及其促生潜力研究

以珍稀植物砂生槐为材料,对该植物根瘤内生细菌种群组成及其促生潜力进行研究,为砂生槐在荒漠化地区生态恢复与重建中的应用提供理论依据。采用YMA培养基通过平板涂布分离法分离内生细菌,通过16S rDNA序列同源性分析其遗传多样性,采用溶磷圈和钼锑抗比色法测定溶磷能力,Salkowski比色法测定IAA分泌量,微量凯氏定氮法测定固氮量。结果表明,从砂生槐根瘤中分离到19株代表性内生细菌,分别属于芽孢杆菌属(Bacillus)、解糖假苍白杆菌(Pseudochrobactrum)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、沙雷氏菌属(Serratia)和普罗威登斯菌属(Providencia)等5个属,其中芽孢杆菌属为优势菌属。在19株供试细菌中,7株具有良好的溶解无机磷能力,溶磷量达到100 mg/L以上;6株菌株具有良好的溶解有机磷能力,溶磷量达到42 mg/L以上;5株菌株具有良好的固氮能力,固定氮量达44 mg/L以上;3株菌株具有良好的IAA分泌能力,IAA分泌量达45μg/mL以上。利用种子发芽指标测定高溶磷菌株的促生能力,其中菌株R24能明显提高砂生槐种子的萌发率。综上,西藏砂生槐根瘤内生细菌遗传多样性丰富,且具有良好促生能力,是重要的生物资源。     

云南红豆杉内生菌的分离及拮抗植物病害菌的筛选

[目的]为从与红豆杉共生的内生菌或其代谢物中寻找其他新型防治植物病虫害药物提供基础依据。[方法]以云南红豆杉为试验材料,从其根、茎、叶中分离内生菌;以棉花枯萎病、小麦赤霉病、番茄叶霉病等11种病原真菌作为供试菌株,研究红豆杉内生菌的抗菌活性,从中筛选出有较高抗菌活性的内生菌。[结果]从云南红豆杉根、茎、叶中分离出内生菌152株,其中细菌80株,真菌48株,放线菌24株;从中筛选出了有较高抗菌活性的11株内生细菌、5株内生放线菌和3株内生真菌,分别占分离得到的内生细菌、内生放线菌和内生真菌总数的13．75％、37．50％和20．83％。[结论]云南红豆杉组织内存在丰富的内生菌,不同组织内生菌的数量、种类有一定差异,在具有抑菌活性的菌物中,放线菌占的比例最高。     

小麦、水稻、玉米、白菜、芹菜内生固氮菌及其系统发育

【目的】了解小麦、水稻、玉米、白菜、芹菜内生固氮菌的主要类群,确定内生固氮菌的系统发育地位。【方法】样品表面灭菌后采用无氮培养基分离、培养内生固氮菌,乙炔还原法测定菌株固氮酶活性;PCR扩增得到菌株16S rDNA,通过序列测定和相似性分析研究菌株的系统发育。【结果】从大田小麦体内分离到内生固氮菌34株,固氮酶活性在0.30-30.24 nmol C2H4/h•mg蛋白,基于16S rDNA序列最大相似性,这些菌株分属于假单胞菌（Pseudomonas）、根瘤菌（Rhizobium）、芽孢杆菌（Bacillus）、黄杆菌（Flavobacterium）等13属21种,种群分布较为广泛;从大田水稻体内分离到内生固氮菌25株,固氮酶活性在3.12-254.12 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于芽孢杆菌、伯克霍尔德氏菌（Burkholderia）、肠杆菌（Enterobacter）、克雷伯氏菌（Klebsiella）等9属16种,伯克霍尔德氏菌、肠杆菌和克雷伯氏菌是水稻内生固氮菌特有种群;从大田玉米体内分离到内生固氮菌9株,固氮酶活性在7.27-59.58 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于根瘤菌、鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）等5属6种;从盆栽试验小白菜体内分离到内生固氮菌14株,固氮酶活性在2.33-205.21 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于根瘤菌、节杆菌（Arthrobacter）等6属8种;从市售芹菜体内分离到内生固氮菌10株,固氮酶活性在1.23-46.70 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于鞘氨醇单胞菌、假单胞菌等5属8种。【结论】在生长期小麦、水稻、玉米和部分蔬菜体内普遍存在内生固氮菌,菌株固氮酶活性差异较大,在0.30-254.12 nmol C2H4/h•mg蛋白,系统发育地位分属于假单胞菌、根瘤菌、芽孢杆菌等25个属的56个种,这些内生固氮菌对于农业生产有巨大潜能。     

宁夏干旱荒漠区苦豆子内生放线菌生态分布及抑菌活性研究

从宁夏灵武白芨滩国家级自然保护区不同土壤类型、不同优势植被的6个样区采集的健康苦豆子中,分离得到153株内生放线菌.同一植株不同组织中,内生放线菌数量以根部最多,其次为种子,叶部最少;淡灰钙土中苦豆子内生放线菌数量比风沙土中多.鉴定结果表明:苦豆子内生放线菌以链霉菌属(Stredtomvc)和诺卡氏菌属(Nocardia)较多;通过皿内对峙培养,对153株苦豆子内生放线菌进行抑菌活性测定,拮抗菌株数占总菌株数的90.2%,个别菌株抑菌带宽度达到20mm以上.     

新疆13种荒漠植物根内生放线菌多样性及其抗菌活性筛选

以荒漠植物骆驼刺、铃铛刺、碱蓬、盐穗木、柽柳等13种植物的根为材料,利用SCA培养基分离其内生放线菌,通过菌株16S rRNA基因测序,分析荒漠植物内生放线菌物种多样性。以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌、细极链格孢菌、大丽轮枝菌和尖孢镰刀菌为靶标,通过琼脂扩散法和平板对峙法开展抗菌活性筛选。从13种荒漠植物分离出533株内生放线菌,鉴定的361株,分布于6个目,7个科,9个属,77个种,另有3个潜在新种,其中链霉菌属为优势类群,冢村氏菌属与伦茨菌属首次从植物中分离得到。研究表明13种荒漠植物内生放线菌多样性有明显差异,骆驼刺内生放线菌最丰富,分离到6个属27个种,链霉菌属有20个种;老鹳草分离到的菌株数量最多,有3个属;铃铛刺分离到2个属,其中的链霉菌属有28个种;猪毛菜、盐穗木等植物只分离到链霉菌属。抗菌活性筛选显示80株放线菌有抗菌活性,其中链霉菌74株,拟无枝酸菌3株,拟诺卡氏菌、糖霉菌和链孢囊菌各1株。本研究为寻找新型抗菌活性化合物,为生物医药和生物肥料提供菌株来源。