用单克隆抗体分析受血清型限制及不受限制的蓝舌病病毒(BTV)的抗原决定簇

用第17型BTV免疫小鼠产生的淋巴细胞杂交瘤所产生的21株单克隆抗体和BTV作用进行检测,能在其杂交瘤的培养上清液中鉴定出限制性及非限制性血清型的特异性(SerotTpe Specificities)。方法用固相放射免疫测定(RIA)和放射同位素标记的17型BTV感染细胞溶解产物做免疫沉淀试验,进行杂交瘤筛选和标化单抗的特异性。结果有13株单抗可以与病毒的结构蛋白9(VP_9)发生沉淀。表明有三种血清型特异性:有一株单抗可沉淀VP_7—48000道尔顿的非结构蛋白质,它在RIA中,能中和20个     

蓝舌病病毒17型VP2蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

为制备蓝舌病病毒(BTV)血清17型VP2蛋白的单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究用原核表达系统部分重叠表达的两段VP2蛋白共同免疫BALB/c小鼠,采用细胞融合技术获得杂交瘤细胞,通过以重组VP2蛋为白包被抗原的间接ELISA筛选获得2株稳定分泌抗BTV17 VP2蛋白的MAbs杂交瘤细胞株,分别命名为3F4和4H10.Ig亚类鉴定2株MAbs均为IgG1/k链.Western blot证明,2株MAbs均能识别重组VP2蛋白.间接免疫荧光试验表明:2株MAbs均与BTV17呈阳性反应,其中MAb 3F4与BTV1、BTV2、BTV3、BTV5、BTV8、BTV11、BTV13、BTV16、BTV23、茨城病病毒(IBAV)、牛轮状病毒(BRV)、牛呼肠孤病毒(RV)均呈阴性反应,但与BTV10和BTV24呈弱阳性反应.利用合成多肽对VP2抗原表位鉴定结果表明,MAb 3F4识别的抗原表位为540DPWNNR545,MAb 4H10识别的抗原表位为540DPWNNRA546.本研究结果为建立BTV17型特异性检测方法及VP2功能研究奠定了基础.     

抗致病性大肠杆菌O78特异单克隆抗体的研制及其初步应用

应用淋巴细胞杂交瘤技术将提纯O_78:K_80：H_9标准菌株免疫BALB／C小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，获得5株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞命名为1G_7、2C_6、3C_1、3E_1、3D_12，这5株杂交瘤细胞经三次克隆化都能稳定分泌抗体。玻板凝集试验、酶联免疫吸附试验和间接免疫荧光试验结果表明：这5株单抗对所试37个菌株中O_78菌株都能发生反应。但3E_1、3D_12还可与另外6个菌株出现交叉反应。3C_1可与另外所试14个菌株发生反应，1G_7和2C_6则只与O_78菌株发生反应。用上述1G_7，单抗对临床分离123株细菌进行鉴定，与常规单因子血清鉴定结果完全符合。试验结果表明对，O_78特异单抗可以取代常规O_78单因子血清。     

抗乙型脑炎病毒非结构蛋白NS1单克隆抗体的制备与鉴定

本研究利用原核表达的乙型脑炎病毒(JEV)SA14-14-2株非结构蛋白NS1作为免疫原.免疫8周龄BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术进行融合,共获得4株特异性针对JEV NS1的杂交瘤细胞,分别命名为1H6、2C3、3A7、4C8,经测定1H6单抗亚类属于IgG2b,其他3株为IgG1,轻链均为K链.4株杂交瘤细胞诱生小鼠腹水效价分别达1:20 480、1:2 560、1:20 480、1:10 240,western blot证实所得杂交瘤细胞分泌的抗体均可与JEVNS1蛋白发生特异性反应,间接免疫荧光试验表明1H6、3A7、4C8 3株单抗能够识别天然的JEV NS1蛋白.本研究为进一步探究JEV NS1蛋白结构及其功能奠定了基础.     

牛白血病病毒单克隆抗体的研究 Ⅰ.牛白血病病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

用持续感染BLV的羊胎肾细胞(BLV/FLK)制备的BLV抗原免疫2月龄BALB/c小鼠,取血清抗体阳性的小鼠细胞与SP_(2/0)小鼠骨髓瘤细胞融合,以PPA-ELISA为抗体检测方法,通过有限稀释法,克隆出E_4和C_9两株分泌抗BLV-gp抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞,其核内染色体数均为97～107。杂交瘤细胞诱生BALB/C小鼠腹水的酶标抗体滴度可达20000倍,经琼扩试验,两株分泌的MAB都仅与兔抗鼠IgG_3标准血清呈现明显而均一的沉淀线,经蛋白质渍印试验和斑点试验,两株的MAB也都只与BLV-gp抗原发生特异性反应,经过连续传代和冻存,两株细胞的抗体滴度稳定。     

非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链A单克隆抗体的制备及其靶位点区域的鉴定

为制备非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链A(NMHC-II A)的单克隆抗体(MAb),本研究将编码NMHC-Ⅱ A羧基端1 651～1 960氨基酸的表达重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞Rosseta中诱导表达,重组蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,分离小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞用PEG 4000介导融合。ELISA方法检测筛选阳性杂交瘤细胞,制备腹水并纯化MAb,以间接免疫荧光和免疫沉淀方法鉴定MAb的特异性,western blot检测MAb靶位点区域。结果表明,通过筛选得到1株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞系,其抗体亚型为IgG1,细胞培养上清和腹水效价分别为1∶2 560和1∶1.0×106;该MAb能够特异性结合相应抗原,并结合Marc-145细胞;western blot结果显示该抗体与NMHC-Ⅱ A的1 812～1 894氨基酸位点结合。该抗体的制备为研究NMHC-Ⅱ A在猪繁殖与呼吸综合征病毒感染细胞中的作用奠定了基础。     

抗猪瘟病毒NS3(p80)蛋白单克隆抗体的制备及其特性鉴定

在大肠杆菌Rosetta（DE3）中表达猪瘟病毒石门株NS3基因部分功能片段,以纯化的重组NS3（p80）蛋白免疫BALB／c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2／0进行融合,经间接ELISA筛选及3次连续克隆化获得了4株可分泌抗NS3单抗的杂交瘤细胞（2G7,2F11,5D2和6F11）,通过小鼠体内诱生法制备腹水,并对杂交瘤细胞和单克隆抗体的特性进行鉴定。结果表明,杂交瘤细胞染色体正常,抗体分泌稳定,单抗效价高,亲和力各不相同,Ig亚类鉴定均为IgGl。Western blot分析证明4株单抗均能与原核表达的NS3蛋白特异性结合,6F11株与真核表达的NS3蛋白有较强的特异性反应。     

猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备猪流行性腹泻病毒(PEDV)的单克隆抗体,本实验以重组PEDV-N蛋白免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合技术,经过3～5次亚克隆与筛选,获得了4株分泌抗PEDV McAb的杂交瘤细胞,分别命名为4A7、6C1、5E10和6F7。4株杂交瘤细胞分泌的McAb均为IgM,其轻链均为κ链。ELISA、Western Blot和免疫荧光鉴定结果表明,4株单抗均与N蛋白及PEDV具有良好的结合活性。复苏冻存的4株杂交瘤细胞,连续传代培养30代,4株杂交瘤细胞能够持续稳定分泌抗体,细胞上清的ELISA抗体效价均在1∶800以上。4株细胞诱生的小鼠腹水抗体效价为1∶10~5～1∶10~6。将单克隆抗体(4A7)用于免疫组化试验和IPMA时,其能够特异地识别PEDV人工感染猪小肠组织和Vero细胞内的病毒。上述实验结果表明,制备的单克隆抗体可以用于PEDV抗原检测以及体内病毒的组织定位分析,并可为进一步研发PEDV抗原或抗体检测技术奠定基础。     

传染性法氏囊病病毒抗原表位分析--单克隆抗体的制备与鉴定

将传染性法氏囊病病毒(IBDV)分离毒株ZB和TA3的细胞培养物采用不连续蔗糖密度梯度离心的方法浓缩纯化病毒,免疫BALB/c小鼠,运用淋巴细胞杂交瘤技术将免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,建立了6株分泌抗IBDV单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞系1C1、1E6、2B2、2G8、3A2、3E2。间接ELISA测定,杂交瘤细胞培养上清液的抗体效价为102,诱生腹水的抗体效价为106～107。相加ELISA分析,这6株单克隆抗体对应不同的病毒抗原表位。中和试验结果表明,2G8对病毒有较强的中和能力,腹水的中和效价为105。用2B1和3E2配对建立的夹心ELISA可特异地检测IB DV。     

抗促乳素单克隆杂交瘤细胞株的建立及鉴定

制备抗促乳素(prolactin,PRL)的单克隆抗体。应用PRL纯品免疫BALB/c小鼠,被免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA筛选阳性克隆,将阳性克隆多次有限稀释得到抗PRL阳性单克隆细胞株,杂交瘤细胞上清分离法和诱生腹水法制备单克隆抗体,测其效价。共建立5株持续分泌抗体的杂交瘤细胞,分别命名为AA5B1、AB6C8、BB3C1、CA6E4、CE2H6。杂交瘤细胞株冻存4个月后复苏培养,形态良好,生长旺盛。培养液上清及腹水效价的OD值略有升高,说明杂交瘤细胞株稳定。5株杂交瘤细胞染色体众数均为99～105,并可见到中部和亚中部着丝点的骨髓瘤细胞标志染色体,说明5株杂交瘤细胞确为SP2/0骨髓瘤细胞与被免疫小鼠的脾细胞融合而产生的。     

蓝舌病病毒单克隆抗体的制备与生物学特性的鉴定

用纯化的蓝舌病病毒(BTV)免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,经间接ELISA方法筛选,有限稀释法克隆,获得2株稳定分泌抗BTV特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株(1F5和4E5).其细胞培养上清ELISA效价分别为1:512和1:256,腹水ELISA效价分别为1:512 000和1:128 000.亚型鉴定表明,1F5和4E5分别为IgGl和IgG2a.ELISA结果显示,2株单克隆抗体仅与BTV反应,不与其他相关病毒反应,表明2株单克隆抗体特异性良好.2株单克隆抗体1F5和4E5的相对亲和力指数分别为5.14×106mol/L和6.71×106mol/L.这2株单克隆抗体的获得为建立BTV免疫学检测方法奠定了基础.     

抗A型产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体杂交瘤细胞系中建立与中和效应

用提取的A型产气荚膜梭菌α毒素包涵体免疫BALB/c小鼠后,取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合和克隆化,经间接ELISA筛选,共获得1A8,1C3,1D5,1D8,1F1,1H1和2E37株稳定分泌单克隆抗体（McAb)的杂交瘤细胞株,经鉴定,7株McAb的Ig亚类有IgG1(1D8),IgG3(1A8,1C3和2E3)和IgM（1D5,1F1和1H1）,细胞培养上清和腹水抗体效价分别为1：512-1：1024和1：10^6-1:10^8。尤为重要的是,2E3杂交瘤细胞株分泌的McAb不仅能够中和α毒素的磷脂酸C活性和溶血活性,而且能够对致死性腹腔感染小鼠产生良好的被动保护作用。     

抗蓝舌病病毒VP7和NS2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为建立蓝舌病病毒(BTV)的检测方法和研究该病毒蛋白的功能,本研究利用BTV血清8型(BTV8)免疫BALB/c小鼠,取免疫后的小鼠脾淋巴细胞与SP2/0细胞融合,制备单克隆抗体(MAb).并以BTV8作为包被抗原建立间接ELISA方法,经筛选获得了8株稳定分泌抗BTV8 MAb的杂交瘤细胞株(1B2、1F6、2B1、2D10、3B6、3D9、4D4和4D12).Western blot结果显示,MAb 1F6、2B1、2D10、3B6、3D9与BTV8 VP7蛋白反应,MAb B2、4D4、4D12与BTV8 NS2蛋白反应.间接免疫荧光结果显示,该8株MAb与24型BTV血清型呈不同的反应论系.本研究所获得的MAb为建立BTV免疫学检测方法和相关病毒蛋白的功能研究提供了实验依据.     

水泡性口炎病毒单克隆抗体的制备与鉴定

将水泡性口炎病毒（VSV）经差速离心和蔗糖密度梯度离心法进行纯化后,以纯化的VSV作为免疫原免疫8～10周龄雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA方法筛选能稳定分泌抗VSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对制备出的抗VSV单抗的特异性、抗体亚类等生物学特性进行鉴定。结果显示,试验成功筛选出2株能稳定分泌抗VSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1A2、4C3。ELISA鉴定结果表明,2株单抗均能特异性地与VSV结合,而与口蹄疫病毒（FMDV）、猪水泡病病毒（SVDV）均不发生交叉反应;诱生小鼠腹水产生的抗体效价可达1∶25 600～1∶51 200。杂交瘤细胞染色体核型鉴定结果显示,杂交瘤细胞染色体数为95～105,均高于2个亲本细胞的染色体数目,说明这2株细胞是两者的杂交产物。抗体亚类鉴定结果显示,所获得2株单抗1A2、4C3均为IgG1。Western blot分析结果表明,1A2可识别VSV G蛋白。2株抗VSV单克隆抗体的成功制备将为VSV快速检测方法的建立以及检测试剂的研制等奠定基础。     

大豆凝集素单克隆抗体的制备及鉴定

为获得分泌抗大豆凝集素(SBA)单克隆抗体的杂交瘤细胞,以纯化的SBA为抗原,免疫BALB/c小鼠,加强免疫3 d后取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,应用有限稀释法和间接ELISA 方法克隆筛选出2株分泌抗SBA单克隆抗体的杂交瘤细胞系A7、F12。细胞上清抗体效价均在1∶2×10³以上,腹水抗体效价均为1∶1×10⁶,单抗亚型鉴定结果均为IgG2b型,分子质量为189.6 ku,亲和常数为7.1×10⁷ mol/L,Western blotting结果表明,2株单抗具有较高的特异性。该McAb的制备为建立SBA定量检测方法奠定了基础。     

IBD病毒古典株和变异株之间抗原相关性的研究

传染性法氏囊病毒(IBDV)属于双股RNA病毒科,其基因组由两个片断的双链RNA组成.目前公认IBDV含有4种蛋白质:VP_1(90KDa)、VP_2(40KDa)、VP_3(32KDa)和VP_4(28KDa).另外还有一种附加蛋白质VP_x(48KDa),被认为是VP_2的前体.VP_2是重要的宿主保护性抗原,带有诱发中和抗体的抗原决定基.该中和抗体可区别两种血清型以及血清Ⅰ型中各毒株.VP_3是群特异性抗原.美国和欧洲已发现两种抗原性不同的血清型.大量的交叉中和试验表明,血清Ⅰ型各毒株间存在明显的抗原性差异.Jackwood等在参试的13个血清Ⅰ型毒株中鉴别出6个亚型.近来单抗的应用使人们已能分析IBDV血清Ⅰ型古典株和变异株之间的抗原性差异.Snyder等报道,从美国分离的新毒株发生了抗原漂移,从而导致了血清Ⅰ型古典株病毒两个中和位点中的一个发生缺失或移位.     

蓝舌病单克隆抗体的研制

作者应用淋巴细胞杂交瘤技术,将小鼠骨髓瘤细胞SP_2(?)0—Ag14与提纯篮舌病10型病毒免疫的小鼠脾细胞进行杂交,制备能分泌抗蓝舌病病毒的单克隆细胞株225个,经三次克隆化,选择了35株杂交瘤细胞制备腹水,用间接ELISA和间接免疫荧光与蓝舌病病毒排谱反应表明,获得单抗中有12株具有群特异性。用蓝舌病病毒1、2、3、4、5、6、8、10、15和17型高免血清作阻断ELISA试验,单克隆抗体7D_8和2D_12有很明显阻断作用,可望用于检测临床样品。     

抗猪圆环病毒2型Cap蛋白中和性单克隆抗体的制备及鉴定

以纯化的杆状病毒表达的重组猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白(PCV2-rCap)免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞瘤杂交技术获得了5株稳定分泌抗PCV2-rCap蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为1D2、2E8、3A10、5F2和6F10.这5株杂交瘤细胞诱导同品系小鼠产生的腹水抗体效价分别为1:2 048 000、1:512 000、1:1 024 000、1:512 000、1:1 024 000;其中1D2、2E8、5F2和6F10单抗亚类为IgG2a,仅3A10为IgG1;2E8、3A10、5F2和6F10单抗轻链为入型,仅1D2轻链为K型.Western blot结果显示,这5株单抗中2E8、3A10、5F2和6F10可与自然PCV2-Cap发生反应,而1D2无反应.IPMA和抗原捕获ELISA结果表明,ID2单抗可与PCV2病毒蛋白发生反应,而与PCV1无交叉反应;病毒中和试验证实,1D2单抗具有中和活性,是一株针对PCV2-Cap蛋白中和表位的单抗.这些单抗的制备为PCV2抗原表位分析及分子诊断提供了技术手段.     

新城疫病毒M蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为获得新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV） M蛋白单克隆抗体,本研究将编码该蛋白的基因克隆、表达并纯化重组蛋白,作为免疫原免疫小鼠,同时建立ELISA筛选方法对小鼠血清效价进行测定,筛选出血清抗体效价最高的小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,最终获得能稳定产生NDV M蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并进行了抗体的免疫荧光、Western blotting、亚类的鉴定、杂交瘤细胞染色体计数、小鼠腹水制备及腹水内单克隆抗体效价测定。结果显示,PCR、重组质粒测序及双酶切鉴定正确,M基因大小约为1 095 bp。SDS-PAGE和Western blotting检测显示,试验成功表达了重组M蛋白,分子质量约为60 ku,且可与NDV阳性血清反应。建立的ELISA筛选方法中,重组M蛋白、His标签蛋白和抗体的最佳工作浓度分别为0.5 μg/mL、0.5 μg/mL和1∶256 000。抗体的免疫荧光、Western blotting、亚类的鉴定显示,杂交瘤细胞产生的抗体可与NDV SG10株及重组M蛋白特异性结合,其轻链为κ,重链为IgG2A。C9-G2、D3-F2杂交瘤细胞染色体计数结果分别为97和101条;杂交瘤细胞上清的ELISA检测效价均为1∶6 400,腹水的ELISA检测效价分别为1∶409 600和1∶102 400。本研究成功制备了NDV M蛋白的单克隆抗体,可为进一步研究M蛋白的功能提供工具。     

IL-17单克隆抗体的制备与鉴定

为制备山羊IL-17单克隆抗体,诱导重组菌rIL-17-pET32a-TransB(DE3)表达山羊IL-17重组蛋白(rIL-17),纯化后免疫BALB/c小鼠,取免疫合格的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,采用间接ELISA方法筛选阳性克隆细胞株。对获得的杂交瘤细胞进行染色体组型分析,并对其分泌的IL-17单克隆抗体进行抗体特异性、抗体类别等分析。结果显示,成功获得了纯化的山羊IL-17原核表达产物;筛选到1株能特异性分泌山羊IL-17单克隆抗体的杂交瘤细胞株-B6,其分泌的单克隆抗体亚型为IgG1,抗体轻链为κ。