牛冠状病毒4H12/1D4单链基因片段在大肠杆菌中的表达

用ＥｃｏＲＩ酶切ＰＲ５Ｂ４质粒，采用“Ｖ”字形内槽电洗脱法回收约０．８０４Ｋｂ牛冠状病毒基因工程抗体４Ｈ１２／１Ｄ４单链基因片段，并将其插入载体质粒ＰＥＴ－１７ｂ的ＥｃｏＲＩ位点构成重组质粒ＰＥＴ－Ｄ４，将重组质粒转化ＤＨ５α感受态细胞，在ＩＰＴＧ的诱导下表达，细菌裂解物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳筛选，发现含ＰＥＴ－Ｄ４细菌经诱导新增一条约２８ＫＤα蛋白带，该蛋白带与设计基因工程抗体的大小相符，经光密度扫描，表达量约占菌体总蛋白的１４％     

猪生殖和呼吸综合征中国分离株ORF5基因的克隆及序列分析

本研究利用对应于ＰＲＲＳＶＡＴＣＣＶＲ－２３３２株及ＬＶ株ＯＲＦ５基因保守序列的１对均为２５个碱基的引物１００５ＰＳ、１００６ＰＲ对ＰＲＲＳＶ中国分离株Ｂ１３进行ＲＴ－ＰＣＲ,扩增出了包括完整ＯＲＦ５基因的ＤＮＡ片段,片段长约７３０ｂｐ。将此片段定向克隆入ｐＵＣ１８载体的ＥｃｏＲＩ和ｓｔＩ位点之间,获得了Ｂ１３ＯＲＦ５基因与ｐＵＣ１８载体的重组质粒。通过ＥｃｏｒＩ／ＰｓｔＩ、ＥｃｏｒＩ／ＨｉｎｄⅢ     

鸡传染性支气管炎腺胃病变型分离株H_(95)免疫原基因的克隆与鉴定

用反转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ），从纯化的腺胃病变型鸡传染性支气管炎分离株病毒基因组ＲＮＡ扩增出约１．７ｋｂ的ＩＢＶＳ１基因。将该扩增产物于ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨⅠ位点克隆到ｐＵＣ１８质粒载体中，对重组质粒载体进行酶切分析，得到与Ｓ１基因预期大小一致的插入片断。经Ｓ１探针Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测，表明插入片断为Ｓ１基因。利用该法筛选到４株阳性重组质粒转化子。     

从重组人Bcl-2质粒中制备pBluescript Ⅱ KS(-)载体

目的：从重组人Ｂｃｌ－２质粒中制备对基因重组和ＤＮＡ测序等有用的ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＫＳ（－）载体。方法：先将重组人Ｂｃ１－２质粒转化ＤＨ５α菌株,小规模制备此质粒ＤＮＡ,然后从低熔点琼脂糖凝胶中回收其中用ＥｃｏＲⅠ酶切的线性ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＫＳ（－）载体,用Ｔ４ＤＮＡ连接酶催化连接并再次转化ＤＨ５α细菌,并用限制酶切鉴定,最后进行冻存和大量制备及纯化。结果：限制酶切分析证明两次转化的细菌分别是含重组人Ｂｃｌ－２质粒和ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＫＳ（－）载体的工程菌。实验还大量制备了这两种质粒或载体ＤＮＡ,并用聚乙二醇沉淀法进行了纯化。结论：利用分子生物学技术成功地从重组人Ｂｃｌ－２质粒制备出ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＫＳ（－）载体。     

旋毛虫肌幼虫ES抗原基因TSPGⅡ在真核细胞中的表达

用限制性内切酶ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ从克隆载体ｐＵＴＳⅡ中工出一个０．９８８ｋｂＴＳＰＧⅡ基因,经ＥｃｏＲⅠ和ＢｓｔＸⅠ酶切鉴定;表达载体用相同的酶切,经琼脂糖凝胶电泳,分别回收ＴＳＰＧⅡ基因和ＰＳＶ．ＳＰＯＲＴⅠ表达载体,用Ｔ４ＤＮＡ连接酶定向接连,转化大肠杆菌感受态细胞,挑取重组,经ＥｃｏＲⅠ,ＢｓｔＸⅠ和ＨｉｎｄⅢ酶切鉴定,构建了重组表达质粒ＰＳＶ．ＴＳⅡ。利用脂质体作载体,将重且表达质粒转     

含有IBV S1基因的昆虫杆状病毒表达载体的构建

以含有鸡传染性支气管炎病毒Ｈｏｌｔｅ株Ｓ１基因的重组质粒ｐＵＣ１８－Ｓ１．Ｈｏｌｔｅ和ｐＵＣ１８－Ｓ‘１．Ｈｏｌｔｅ为材料,分别构建了可表达ＩＢＶ Ｓ１基因的昆虫杆状病毒转移载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＾＋Ｘ３－Ｓ１．Ｈｏｌｔｅ（含ＩＢＶ先导序列）,ｐＳＸＩＶＶＩ＾＋Ｘ３／４－Ｓ１．Ｈｏｌｔｅ（ＩＢＶ先导序列为融合短肽）,ｐＡｃＧＨＬ－Ｃ－Ｓ１,Ｈｏｌｔｅ。     

FPV282E4株BamHI7．3kb片段的亚克隆

选用ＦＰＶ２８２Ｅ４株ＢａｍＨＩ７．３ｋｂ含非必需区片段，经ＸｂａⅠ酶切，将Ａ、Ｂ、Ｃ３个片段亚克隆于ＫＳ（—）质粒中，同时使Ｄ片段自身环化，获得ＫＳＦａ、ＫＳＦｂ、ＫＳＦｃ、ｐＵＣＦｄ４个重组克隆，经酶切鉴定证明亚克隆正确。为以ＦＰＶ基团组非必需区的ＢａｍＨＩ７．３ｋｂ片段中ＢｇｌⅡ片段所在区域构建重组载体质粒和体内重组表达外源基因的研究以及非必需区的核苷酸序列分析奠定基础     

旋毛虫ES抗原结构基因TSPGⅡ重组表达质粒构建

用限制性内切酶ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ,从克隆载体ｐＵＴＳⅡ中切出一个０．９８８ｋｂＴＳＰＧⅡ基因,经ＥｃｏＲＩ和ＢｓｔＸＩ酶切鉴定,同时表达载体也用相同的酶进行酶切,经琼脂糖凝胶电泳,分别回收ＴＳＰＧⅡ基因和ｐＳＶ·ＳＰＯＲＴⅠ表达载体,用Ｔ４ＤＮＡ连接酶定向连接,转化大肠杆菌感受态细胞,挑取重组子,经ＥｃｏＲⅠ,ＢｓｔＸⅠ和ＨｉｎｄⅢ酶切鉴定,构建了重组表达质粒ｐＳＶ·ＴＳⅡ．     

鸡痘病毒282E4株基因组BamHⅠ片段的克隆及酶切图谱分析

本研究用ＰＵＣ１８质粒作载体，采用鸟枪法克隆ＦＰＶ基因组ＢａｍＨＩ部分片段，用ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－ｄＵＴＰ标记的ＦＰＶ２８２Ｅ４ＢａｍＨＩ片段探针打点杂交，证实２２个克隆插入了ＦＰＶ２８２Ｅ４ＤＮＡ的ＢａｍＨＩ片段，２２个阳性克隆提取的质粒经琼脂糖凝胶电泳，选取具有代表性的大小不同的６个质粒ＰＵＡ、ＰＵＢ、ＰＵＣ、ＰＵＤ、ＰＵＥ、ＰＵＦ。６个质粒插入的片段Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ分别为７．３ｋｂ     

法氏囊三肽囊素(Bursin)的研究Ⅰ.抗 Bursin 单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

以戊二醛法制备ＢｕｒｓｉｎＫＬＨ，免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取脾细胞，以ＰＥＧ为融合剂，与ＳＰ２融合，用间接ＥＬＩＳＡ法筛选出与Ｂｕｒｓｉｎ－ＢＳＡ结合、不与ＢＳＡ结合的２Ｆ９－４克隆株，经鉴定，抗体属性为ＩｇＭ，Ｋ轻链。水溶性Ｂｕｒｓｉｎ可阻抑２Ｆ９－４对鸡法氏囊的反应，切片标本经ＰＢＳ处理，反应性消失，免疫组织化学染色于法氏囊上获得特征性阳性结果。     

人胰岛素样生长因子-Ⅰ基因农杆菌工程菌株的构建

采用固相亚磷酸三酯法人工化学合成了人胰岛素样生长因子－Ⅰ（ｈｕＩＧＦ－Ｉ）基因的４条寡核苷酸 片段，再通过片段１、２与３、４末端互补配对和Ｋｌｅｎｏｗ酶促补平及酶切连接成为完整的ｈｕＩＧＦ－ＩＤＮＡ片段，用 ＥｃｏＲ　Ｉ／ＰｓｔＩ酶切后克隆于 ｐＧＥＭ Ｔ－Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ，经测序证明所得 ＤＮＡ序列与设计的序列完全一致；选用植物 偏爱密码子校正了启始密码子ＡＴＧ下游的６个密码子，并在ＡＴＧ处增加Ｋｏｚａｋ序列后，插入ｐＢＩ１２１的ＢａｍＨＩ／ ＳａｃＩ位点，构建了以 ３５Ｓ为启动子的植物表达载体；以 Ｈｉｎｄ ＩＩ／ＥｃｏＲＩ切下“３５Ｓ－Ｋｏｚａｋ－ＩＧＦ－Ｉ－ＮＯＳ（ｔｅｒ．）”插入 ｐＣＡＭＢＩＡ２３００之Ｈｉｎｄ ＩＩ／ＥｃｏＲ　Ｉ位点，构建成ｈｕＩＧＦ－Ｉ植物表达载体；通过ＣａＣｌ２直接转化法将表达载体导入农 杆菌ＥＨＡ１０５（Ｒｉｆ．ｒ），并以菌落原位杂交技术和 ＤＮＡ ｄｏｔ ｂｌｏｔ对重组农杆菌进行了筛选，所获得的重组农杆菌菌株为培育ｈｕＩＧＦ－Ｉ豆药用植物奠定了基础。     

从重组人Bcl—2质粒中制备pBluescriptⅡKS（—）载体

目的：从重组人Ｂｃｌ－２质粒中制备对基因重组和ＤＮＡ测序等有用的ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＫＳ（－）载体。方法：先将重组人Ｂｃｌ－２质粒转化ＤＨ５α菌株,小规模制备此质粒ＤＮＡ,然后从低熔点琼脂糖凝胶中回收其中用ＥｃｏＲ Ⅰ酶切的线性ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＫＳ（－）载体,用Ｔ４ＤＮＡ连接酶催化连接并再次转化ＤＨ５α细菌,并用限制酶切鉴定,最后进行冻存和大量制备及纯化。结果：限制酶切分析证明两次转化     

新型伪狂现病毒基因缺失株的构建

以伪狂犬病病毒Ｆａ株为起我建;的ｐｐ６３ＬａｃＺ转移载体质粒与ＰＲＶ Ｆａ ＤＡ经磷酸钙转染,在ＭＤＢＫ细胞内同源重组获得ＰＲＶ Ｆａ ｇＥ／ｇｉ＾－／ＬａｃＺ基因缺失株。以ＰＤＴＫ３－６,５－６ＴＫ缺失质粒与上述基因缺失株在ＴＫ＾－１４３细胞内同源重复且,获得ＰＲＶ－ＳＡ２１５等三基因缺失株。经核酸杂交证实构建是成功的。生物学特性观察显示,该基因缺失株对多种动物安全,具有良好的免疫原性,有望成为     

玉米谷氨酰胺合成酶c—DNA导入根癌农杆菌15955

用粘端连接法将构建于Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＦＤＢ２１３菌檄中的玉米谷氨酰胺合成酶（ＭＧＳ）ｃ－ＤＮＡ亚克隆于由农力质粒改造的ＰＢＩ１２１载体中。测定的７２个转化菌中７株（９．２％）插入ＭＧＳｃ－ＤＮＡ片段。亚克隆后的质粒ＤＮＡ用ＨｉｎｄⅢ和ＢｓｔｘＩ酶解可确定其ｃ－ＤＮＡ片段的插入方向。结果显示：Ｐ９、Ｐ１５、Ｐ１６与Ｐ１７为正向插入,Ｐ２为反向插入的菌株。Ｐ６质粒ＤＮＡ进一步用直接基     

电穿孔技术在EBV—LMP表达质粒转染人鼻咽癌细胞中的应用

目的：观察人鼻咽癌细胞用电穿孔技术进行体外基因转染所需的转染电击条件ＥＢＶ－ＬＭＰ基因的转染表达。方法：以人高分化鼻咽癌细胞株（ＥＮＥ１）为对象，用电穿孔基因转染技术，观察不同电压及电容条件电击癌细胞对基存活率的影响；将重组ＥＢＶ－ＬＭＰ表达质粒转染ＣＮＥ１细胞，以载体质粒转染及未经转染的ＣＮＥ１细胞为对照。结果：ＣＮＥ１癌细胞存活率与电容及电压值的大小成反比。ＣＮＥ１细胞转染较合适条件是电压值６     

传染性法氏囊病病毒主要结构蛋白基因及其表达产物免疫学试验

用传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）ＶＰ２、ＶＰ３重组质粒ＤＮＡ及其大肠杆菌表达产物全菌裂解液油乳剂苗肌肉注射１４日龄仔鸡,免疫后１４和２１ｄ测定血清ＥＬＩＳＡ抗体效价,并于免疫后２１ｄ用ＩＢＤＶ南京野毒株攻击。结果显示：（１）ＶＰ２基因重组质粒ＤＮＡ除可诱导产生较高的ＥＬＩＳＡ抗体外,还可明显降低仔鸡ＩＢＤＶ攻击所引起的急性发病率和死亡率;（２）ＶＰ３－ＧＳＴ融合蛋白表达产物全菌裂解液可较早地诱导产     

法氏囊三肽囊素的研究：Ⅰ.抗Bursin单克隆抗体杂瘤细胞株的建立

以戊二醛法制备Ｂｕｒｓｉｎ－ＫＬＨ，免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取脾细胞，以ＰＥＧ为融合剂，与ＳＰ２融合，用间接ＥＬＩＳＡ法筛选出与Ｂｕｓｉｎ－ＢＳＡ结合，不与ＢＳＡ结合的２Ｆ９－４克隆株克隆株，经鉴定，抗体属性为ＩｇＭ，Ｋ轻链。水溶性Ｂｕｒｓｉｎ可阻性２Ｆ９－４对鸡法氏囊的反应，切片标本经ＰＢＳ处理，反应性消失，免疫组织化学染色于法氏囊上获得特征阳性结果。     

EBV-LMP对人高分化鼻咽癌细胞株(CNE1)体外增殖能力的影响

目的：探讨ＥＢＶ－ＬＭＰ对人高分化鼻咽癌细胞株ＣＮＥ１增殖能力的影响。方法：以人高分化鼻咽癌细胞株（ＣＮＥ１）为对象,采用电穿孔基因转染技术,将重组ＥＢＶ－ＬＭＰ表达质粒转染ＣＮＥ１细胞。以载体质粒转染及ＣＮＥ１细胞为对照。用细胞体外增殖实验、细胞软琼脂克隆形成率测定、流式细胞仪测定各细胞周期和细胞ＰＣＮＡ的检测,观察细胞增殖能力的变化。结果：体外细胞增殖实验,Ａ比值实验组（２．８６±０．１２）显著高于空白组（１．６２±０．０５）及阴性对照组（１．３８±０．０３）（Ｐ＜０．０１）;实验组细胞软琼脂克隆形成率（２５．２％）显著高于空白组（１１．２％）及阴性对照组（１３．４％）（Ｐ＜０．０１）;ＦＣＭ法测定细胞周期,实验组Ｓ期细胞（３４．９％）高于空白组（２６．２％）及阴性对照组（３０．８％）;ＰＣＮＡ免疫组化染色,实验组细胞ＰＣＮＡ阳性率（８４．６％）明显高于空白组（６１．１％）及阴性对照组（６７．２％）（Ｐ＜０．０１）。结论：ＥＢＶ－ＬＭＰ对ＣＮＥ１细胞体外增殖能力有明显的促进作用,提示ＬＭＰ在ＮＰＣ细胞演进过程中可能起重要作用     

马传染性贫血病病毒L株前病毒全基因组核苷酸序列分析

 本实验所用的马传染性贫血病毒（ＥＩＡＶ）Ｌ株（ＥＩＡＶ－Ｌ）是我国研制成功的ＥＩＡＶ弱毒疫苗的原始强毒株。以ＥＩＡＶ－Ｌ感染马外周血液白细胞中ＤＮＡ为模板，利用ＰＣＲ技术，分４个片段扩增ＥＩＡＶ－Ｌ前病毒ＤＮＡ，并分别克隆到载体质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ中，得到 ４个重组质粒ｐ２．８、ｐ２．４、ｐ３．１和 ｐ１．２，经酶切鉴定后测序。对测序结果分析、拼接，得到 ＥＩＡＶ－Ｌ前病毒基因组全序列。ＥＩＡＶ－Ｌ前病毒基因组全长 ８２３５ｂｐ，其中 Ｇ＋Ｃ含量为 ３８％。通过使用计算机软件ＤＮＡＳＩＳ分析，ＥＩＡＶ－Ｌ与马传贫驴强毒和马传贫驴白细胞疫苗毒序列同源性分别为９８．４％和９６．９％。同源性如此接近反映了它们之间的亲缘关系，另外 ＥＩＡＶ－Ｌ与驴强毒的同源性高于其与驴白细胞弱毒疫苗株的同源性，这符合驴白细胞弱毒疫苗株的衍生过程。基因组两端是长为３１６ｂｐ的ＬＴＲ，其中Ｕ３为１９７ｂｐ，Ｒ为８０ＢＰ，Ｕ５为３９ｂｐ。前病毒基因组有 ３个较大的开放阅读框架（ＯＲＦ），分别编码 ｇａｇ、ｐｏｌ和 ｅｎｖ基因。ｇａｇ基因位于 ７１３～１９１２位碱基之间，全长１２００ｂｐ；ｐｏｌ基因位于 １７０８～５１０９位碱基之间，全长     

人雄激素受体LBD基因融合表达产物的分离制备

利用硫氧还蛋白事例表达系统,将编码人雄激素受体（ｈＡＲ）激素结合区（ＬＢＤ）的基因（编码ｈＡＢ５８４－９１８氨基酸）插入质粒ｐＴｒｘ Ｆｕｓ中ｔｒｘＡ基因的３′端,重组后的质粒ｐＴｒｘＡＲ导入Ｅ．ｃｏｌｉ ＧＩ７２４中,经Ｔｒｐ诱导,该转化的菌株表达一融合蛋白。通过制备包含体,再利用制备型ＳＤＳ－ＰＡＧＥ或Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２００柱层析都可较好地纯化分离该融合表达产物（达到ＳＯＳ电泳单点纯）,