抗草甘膦转基因大豆PCR检测方法的建立与应用

 应用PCR检测方法 ,以大豆凝集素 (lectin)基因为内置标准 ,检测了抗草甘膦转基因大豆中的外源CaMV35S启动子、NOS终止子和CP4 EPSPS成分 ,并通过Southern杂交进一步证实了PCR检测结果的可靠性 ,建立了基于PCR的抗草甘膦转基因大豆检测方法 ,最低检测限度为 0 .0 5 %。用此方法检测转基因情况未知 ,分别来自欧盟、美国、阿根廷、未知国别的进口大豆及未知国别的进口豆粕 ,除从欧盟进口的大豆无CaMV35S启动子、NOS终止子、CP4 EPSPS基因成分外 ,其余样品均含有上述成分 ;而从国内非转基因大豆中未检出上述成分。用此方法检测抗草甘膦大豆京引D1×豫豆 12的F2 和F2∶5群体植株 ,PCR检测结果与大田施药 (草甘膦有效成分 1.0kg·ha-1)检测结果一致率分别达 10 0 %和 93.0 %。     

转基因抗除草剂油菜相关基因的PCR检测及其在育种中的应用

以抗草甘膦杂交油菜三系和抗草丁膦杂交油菜二系亲本及其F1杂种为材料,探索建立和优化抗草甘膦的CP4、gox基因和抗草丁膦的bar基因及其Barnase、Barstar基因的PCR检测方法,为转基因抗除草剂油菜的品种选育、F1种子纯度鉴定和转基因油菜的生态安全性研究提供可靠、实用的检测方法。     

抗草甘膦转基因大豆PCR定量检测研究

试验建立大豆中转基因成分的定量测定方法。采用双链DNA SYBR Green I结合染料实时荧光定量PCR技术，扩增编码大豆凝集素的内参照基因lec和抗草甘膦转基因大豆中的外源花椰菜花叶病毒CaMV35s基因。绘制2种基因扩增的循环数一拷贝数标准曲线图，根据标准曲线方程计算样品中的转基因含量；并作重现性和熔解曲线分析。结果表明，lec和CaMV35s基因标准曲线方程线性好，R^2值分别达到0．9997和0．9992。不同转基因含量的标准及模拟大豆样品定量显示，实测值与实际值接近，相对偏差5％～11％。SYBR Green I实时定量PCR方法可用于定量测定大豆中转基因品种的含量。     

抗草甘膦转基因大豆的获得

大豆[Glycine max(L.)Merrill]是我国主要的粮食和油料作物,但近年来由于大量进口美国的转基因大豆,使我国的大豆生产严重萎缩。生物技术方法应用于改良大豆的农艺性状和产品质量以及对除草剂的耐受性,特别是对草甘膦的耐受性这一个重要性状。本研究以东农50为受体,采用农杆菌介导法,将抗草甘膦基因G10-EPSPS基因转入到大豆中,先后获得了3株T0代植株,在T0代进行抗性鉴定后,1株得到种子。试验通过对转基因后代的PCR检测、Western检测以及草甘膦抗性鉴定,证明外源基因已整合到植物基因组中,并在T0、T1和T2代稳定表达。本研究为转基因大豆育种提供了材料和数据。     

抗除草剂草甘膦转基因作物

利用生物工程技术,培育出抗除草剂作物新品种、近年来研究发展迅速。草甘膦因其具有最优秀的除草剂特性而成为抗除草剂转基因作物研究的首选对象,抗草甘膦转基因大豆已培育成功并大面积种植。将抗性基因导入油菜、烟草、番茄、棉花、玉米等作物也获得了表达。本文对草甘膦的作用靶标酶———ＥＰＳＰ合酶的发现,抗草甘膦突变的ＥＰＳＰ合酶基因及变异的ＥＰＳＰ合酶抗性特点,及其将快速催化草甘膦代谢成无毒产物的酶的基因导入植物,而获得抗草甘膦作物研究作了概况综述。     

转基因抗草甘膦棉花鉴定方法研究

以引进的转基因抗草甘膦棉花5A39及其与非抗除草剂材料的杂交后代为试材,采用不同的草甘膦浓度,对不同生长发育时期的棉花进行处理。试验初步明确棉花苗期对除草剂最为敏感,也是进行抗性鉴定的最佳时期。     

转基因马铃薯PCR检测方法

本文针对国际上商业化种植的3种转基因马铃薯的1种国内大田实验的转基因马铃薯，确定了使用PCR方法检测商品化转基因马铃薯的技术路线。在本研究中，选取马铃薯种属特异性的内源蛋白ptatatin基因片断为内对照，用以检验蝗取的样品DNA质量，有效避免假阴性并确定检测样品的种源，选取FMV35S启动子、CaMV35S启动子、NOS终止子、NPTⅡ选择基因作为筛选基因，选取外源目的基因PLRVrep、PVYcp作为鉴定品系的鉴定基因，同时筛选出检测以上基因的最佳引物序列，并优化了PCR反应条件，实验结果表明，各对引物特异性强且工作良好；PCR反应条件稳定可靠。本方法适用于进出口检验检疫部门和农业部门对转基因马铃薯的检测监控。     

抗草甘膦小飞蓬检测方法的建立

采用温室生物测定法建立小飞蓬对草甘膦的抗性检测方法。小飞蓬幼苗长至5~7叶期,单株移栽,15~20叶时,按不同浓度处理喷施草甘膦。用药后3 d进行第一次观察,记录各浓度的药害症状,并划分药害级别。以后每隔4 d记录1次,药害级别转化为药害综合指数。当不同处理间的药害症状有极显著差异时进行鲜重和干重的测定。分别以所获得的药害综合指数、鲜重、干重和药剂剂量的对数进行回归,所有的数据都用log-logistic回归模型进行模拟。通过比较两次重复实验的结果,证实采用药害分级、鲜重、干重的方法都能较好地反映小飞蓬受害情况和不同剂量草甘膦处理间的关系,但药害分级的方法是3种方法中重复性最好的一种。     

抗草甘膦转基因油菜品种RG1和RG2的抗性测定

以转基因抗除草剂油菜RG1、RG2及陇油5号(CK)为材料,通过盆栽试验鉴定RG1、RG2及陇油5号对草甘膦的抗性.结果表明RG1、RG2对草甘膦具有很强的抗性,当草甘膦的喷施浓度达到4 000 mg/L时,RG1和RG2油菜可以正常生长.在甘肃永登县区域试验中,RG1和RG2的产量分别为3 952.5 kg/hm2和3 561.0 kg/hm2;在甘肃靖远县区域试验中RG1、RG2产量分别为3847.3 kg/hm2和3 535.0 kg/hm2.相比之下,陇油5号(CK)在永登县和靖远县的产量分别为3 568.5 kg/hm2和3 584.0 kg/hm2.     

四重PCR检测抗除草剂转基因油菜T45

【目的】建立多重PCR检测抗除草剂转基因油菜T45的方法,为其转基因检测提供技术支持。【方法】选择油菜内源参照基因CruA、外源基因P-CaMV 35S、T-CaMV 35S和pat作为四重PCR检测基因,特异性引物序列参照国家相关标准或文献,通过对多重PCR退火温度和引物浓度的优化、灵敏度测试及已知样品验证,建立抗除草剂转基因油菜T45多重PCR检测体系。【结果】多重PCR的适宜退火温度为58℃,适宜引物终浓度(μmol/L)配比CruA∶P-CaMV 35S∶T-CaMV35S∶pat为0.1∶0.2∶0.2∶0.2,方法灵敏度为0.01 ng/μL,所有已知样品的扩增条带与其分子特征显示的外源基因元件完全一致。【结论】建立的抗除草剂转基因油菜T45品系四重PCR检测方法可实现在一个反应体系中同时检测抗除草剂转基因油菜T45内源参照基因和多个外源基因成分,为转基因油菜T45提供了一种有效的检测手段。     

柑橘转基因成分多重PCR检测体系的建立(英文)

[目的]建立柑橘转基因成分的多重 PCR 检测体系。[方法]根据 GenBank 中 pBI121 质粒序列和柑橘(Citrus.)Actin 基因序列,分别设计CaMV35S 启动子、NOS 启动子、NOS 终止子特异引物和 Actin 基因的特异引物,建立能同时检测出 4 种序列的多重 PCR 检测体系,同时通过正交试验确定该体系的最佳引物浓度和比例及 PCR 反应体系中各因素的浓度及反应程序,并对该方法的灵敏度进行验证。[结果]试验得到的最佳MPCR 反应体系为:10×buffer 2.5 μl,25 mmol/L MgCl22.0 μl;dNTP Mixture (2.5 mmol/L each)2.0 μl,10 μmol/L 的 Actin 基因、35S 启动子、NOS 启动子、NOS 终止子引物分别加入 1.0、1.0、1.5、0.5 μl,模板 DNA 0.1 μg,Taq DNA 聚合酶 1.25 U,加 ddH2O 至 25 μl。PCR 反应程序为:94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s,64.1 ℃ 45 s,72 ℃ 50 s,31个循环;72 ℃ 10 min。试验中,经正交优化后的4重PCR反应灵敏度达0.1%。[结论]该研究建立的MPCR检测体系,理论上已能满足柑橘或其深加工产品的转基因成分检测。     

柑橘转基因成分多重PCR检测体系的建立

[目的]建立柑橘转基因成分的多重PCR检测体系。[方法]根据GenBank中pBI121质粒序列和柑橘(Citrus.)Actin基因序列,分别设计CaMV35S启动子、NOS启动子、NOS终止子特异引物和Actin基因的特异引物,建立能同时检测出4种序列的多重PCR检测体系,同时通过正交试验确定该体系的最佳引物浓度和比例及PCR反应体系中各因素的浓度及反应程序,并对该方法的灵敏度进行验证。[结果]试验得到的最佳MPCR反应体系为:10×buffer 2.5μl,25 mmol/L MgCl22.0μl;dNTP Mixture(2.5 mmol/L each)2.0μl,10μmol/L的Actin基因、35S启动子、NOS启动子、NOS终止子引物分别加入1.0、1.0、1.5、0.5μl,模板DNA 0.1μg,Taq DNA聚合酶1.25U,加ddH2O至25μl。PCR反应程序为:94℃预变性5 min;94℃30 s,64.1℃45 s,72℃50 s,31个循环;72℃10 min。试验中,经正交优化后的4重PCR反应灵敏度达0.1%。[结论]该研究建立的MPCR检测体系,理论上已能满足柑橘或其深加工产品的转基因成分检测。     

多重PCR分析方法应用于转基因农作物的检测

以转基因大豆、水稻等样品为材料,采用多重PCR技术对转基因作物中常见的启动子、终止子、筛选标记基因和转入的目的基因等多个外源转基因元件进行检测,以期建立一套快速、准确、高效的转基因农作物筛查鉴定技术。通过多重扩增实验,建立了关于转基因大豆检测的大豆内源Lectin基因,花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus,CaMV)35S启动子和根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因NOS终止子的三重PCR分析体系,及关于转基因水稻检测的CaMV35S、NPTII和HPT基因的三重PCR分析的技术体系。并以大豆、水稻等农作物样品为检测材料,采用单一PCR和多重PCR技术同时进行检测,结果表明多重PCR方法具有快速、高效、简便、准确等特点,在转基因成分的检测上具有非常重要的实际应用价值和潜力。     

Detection of Herbicide-tolerant Canola by Multiplex PCR

[Objective]This study aimed to establish a multiplex PCR detection method of herbicide-tolerant canola.[Method] An endogenous reference gene(CruA) and three exogenous genes(T-CaMV 35 S, P-CaMV 35 S and pat) were selected for multiplex PCR. Specific primers were designed based on national standards or related literature. The annealing temperature, ratio of primer concentration and sensitivity of the established multiplex PCR system were optimized. The optimal multiplex PCR system was verified with known samples. [Result] The experimental results showed that the optimal annealing temperature of multiplex PCR was 58 ℃; the optimal ratio of primer concentration(μmol/L) was T-CaMV 35S: CruA: P-CaMV 35S: pat=0.1: 0.2: 0.2: 0.2;the detection sensitivity of the established multiplex PCR method was 0.3 ng. The amplified bands of known samples were completely consistent with the molecular characteristics. [Conclusion] This study provided a rapid, accurate and effective multiplex PCR technique for detection of herbicide-tolerant canola.     

SYBR~ GreenI实时PCR鉴定检测转基因油菜RT73品系

利用特殊性引物,应用SYBR Green I实时PCR技术鉴定检测了商业化种植的转基因油菜RT73品系。结果表明,应用实时PCR技术,利用SYBR Green I染料能选择性结合双链DNA的特点,可检测到RT73品系特异性靶序列扩增所产生的荧光信号,且通过溶解曲线确定其熔点值为(80.2±0.5)℃,而对其他油菜品系则检测不到荧光信号。SYBR Green I实时PCR能通过溶解曲线有效地区分了特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体,是基因鉴定检测的新方法。     

猪圆环病毒多重PCR检测方法的建立

为建立PCV1和PCV2混合感染快速检测的PCR方法,根据GenBank已发表PCV1和PCV2全基因组序列,设计合成4条引物,通过PCV1和PCV2阳性质粒的构建、反应条件的优化、敏感性试验和特异性试验,建立了PCV多重PCR检测方法,可扩增出PCV1和PCV2长度分别为726 bp和433 bp特异性目的基因片段。结果显示,建立的PCV多重PCR可检测到5×101个拷贝的PCV1和PCV2目的基因,HCV、PRV、PPV核酸扩增均为阴性,具有良好的特异性和敏感性。并初步应用建立的方法对42份采自四川省部分地区的样品进行检测,结果表明,PCV1阳性率为33.3%,PCV2阳性率为45.2%,其中PCV1和PCV2混合感染阳性率为16.6%。     

玉米中转基因成分筛查策略

根据商业化转基因玉米外源基因元件信息,构建玉米转基因检测分子特征矩阵,并根据元件信息建立转基因玉米的筛查检测策略。结果表明:利用CaMV35S启动子、NOS终止子2个元件的组合,可完成对现有转基因玉米转化事件的筛查检测,检测灵敏度可达到1g/kg。该筛查方法可对玉米中的转基因成分进行快速、高灵敏度的筛查。     

Establishment of PCR-ELISA for Detecting Glyphosate Resistant Transgenic Soybean

A PCR-ELISA method for detecting the glyphosate resistant transgenic soybean was established and optimized. The results showed that the key parameters of PCR-ELISA were as follows: the concentration of digoxin tag probe was 0.5 μmol · L-1, the time of hybridization reaction was 15 min and the chromogenic reaction should last for 30 min. The sensitivity and the repeatability of our PCR-ELISA method were evaluated, and the results showed that it could be detected when the concentration of DNA template from transgenic soybean samples was 0.01% or higher, and the coefficient of variation of this method was less than 5% in our research condition. These results suggested that PCR-ELISA method establishment in this study had good repeatability and high precision for detecting the transgenic soybean samples.     

转基因抗草甘膦棉花对草甘膦的耐受性研究

为了明确转基因抗草甘膦棉花10-6001对除草剂草甘膦的耐受性,以转基因抗草甘膦棉花材料10-6001和常规棉花品种冀棉958（ CK）为试验材料,在棉苗6片真叶时叶面喷施不同浓度〔0（不喷施除草剂,人工除草, CK）、0.25％和0.50％〕的草甘膦溶液,分别于施药后0（当天下午）、1、7、14和21 d调查棉花的株高、药害级别、受害指数和死苗率,施药后35 d 调查棉花的死苗情况;分析2种棉花对不同浓度草甘膦的反应程度,并对其株高差异进行了显著性方差分析。结果表明：转基因抗草甘膦棉花品系10-6001对草甘膦的耐受性很好,喷施0.25％和0.50％草甘膦溶液的棉花在整个试验期间药害均较轻,表现为植株矮化,生长减慢,叶片略变小,且无死苗,株高方差分析结果显示与人工除草（ CK）相比差异均不显著;随着时间的延长,药害逐渐缓解。而常规品种冀棉958对草甘膦的耐受性很差,喷施0.25％和0.50％草甘膦溶液的棉花药害症状表现为植株矮化,生长缓慢,叶片变小、枯黄、褐化干枯,并且药害程度随着时间的延长而加重,药害级别和受害指数均高于10-6001,株高方差分析结果显示与人工除草（ CK）相比差异均达到了极显著水平,施药后35 d部分棉花出现整株枯死。