假臭草DNA提取及RAPD反应体系的优化

以假臭草叶片为材料,对影响其随机扩增多态DNA（RAPD）反应的各因素进行优化．建立了假臭草RAPD的优化反应体系和程序,即在10μL反应体系中,5ng（／10μL）模板DNA,1．0μmol／L随机引物F15,150μmol／LdNTPs,2．0mmol／LMg^2＋,1．0UTaqDNA聚合酶;扩增程序为95℃预变性4min,95℃变性40S,36℃退火40S,72℃延伸1min,10个循环,后94℃变性30s,35℃退火30s,72℃延伸1min,35个循环,72℃延伸5min,4℃保温。     

蛇莓ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用单因素试验对蛇莓ISSR—PCR反应体系中的6种主要反应因子（模板DNA、Mg^2＋、Taq DNA聚合酶、BSA、dNTP及引物）进行优化筛选，确立了适合蛇莓ISSR分析的最佳PCR扩增反应体系，即10μl PCR反应体积中含：1×TaqDNA聚合酶配套缓冲液（10mmol／L Tris·HCl，pH值9．0；50mmol／L KCl；0．1％Triton X-100），1．75mmol／L Mg^2＋，2mg／ml BSA，0．2mmoL／L 4×dNTP，10ng模板DNA，18pmol引物，0．5U Taq DNA聚合酶。     

大花君子兰ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以大花君子兰为材料研究了PCR反应体系的主要成分及退火温度对君子兰ISSR扩增结果的影响,并对影响PCR反应体系的主要成分及退火温度进行筛选和优化,确立了适合君子兰ISSR-PCR分析的最佳反应体系:在20μL的反应体系中,Mg2+为2.0 mmol/L,模板DNA用量为50 ng/μL,Taq酶0.4 U,dNTPs浓度为0.15 mmol/L,引物浓度为0.4 mmol/L。筛选出了13个适宜君子兰遗传分析的ISSR引物,确定最适宜退火温度为52~56℃。     

春兰ISSR-PCR反应体系的建立和优化

[目的]为进一步从分子水平上研究春兰种群的遗传多样性奠定基础。[方法]以春兰基因组DNA为模板,通过单因子试验研究ISSR反应体系中主要成分对扩增结果的影响,以寻找适合春兰ISSR分析的反应体系。[结果]春兰的ISSR反应体系较适宜的扩增条件为:25lμPCR反应体积中,15.78μl双蒸水,2.5μl 1×CR buffer,1.1 UTaqDNA聚合酶,100 ng基因组DNA,2.0 mmol/L MgCl2,150μmol/LdNTPs,2μmol/L引物。最佳扩增程序为:94℃预变性5 min,然后进行40个循环;94℃变性45 s,复性温度比各引物的TM值略低1~2℃,45 s,72℃延伸75 s,循环结束后72℃延伸7 min,4℃保存。[结论]该优化系统的建立为进行春兰鉴定及种质遗传多样性分析提供了一个标准化程序。     

田野菟丝子ISSR-PCR反应体系的建立与优化

利用ISSR技术对田野菟丝子的遗传多样性进行了研究,通过筛选引物并对影响PCR扩增效果的一些因素如Mg2 浓度、牛血清白蛋白浓度、4×dNTP浓度、模板DNA用量、引物用量、TaqDNA聚合酶用量以及退火温度等指标进行优化,建立了可用于田野菟丝子ISSR分析最适宜的反应体系:10μl PCR反应体积中,1×Taq酶配套缓冲液(10 mmol/L Tris.HCl,pH值9.0,50 mmol/L KCl,0.1%Triton X-100),2.5 mmol/L MgCl2,2.0mg/ml牛血清白蛋白,0.2 mmol/L4×dNTP,10 ng模板DNA,6 pmol引物,0.3 UTaqDNA聚合酶。引物UBC811的最适退火温度为50.7℃。     

冬虫夏草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为进一步研究冬虫夏草的遗传多样性,试验采用改良的CTAB法提取高质量DNA模板,克服了冬虫夏草中富含多糖、蛋白、盐类和色素的影响。建立并优化了冬虫夏草ISSR-PCR最适反应体系,即在25μL体系中反应物的含量分别为:10×PCRBuffer 2.5μL,模板DNA20 ng,引物0.9μmol/L,dNTP 0.12 mmol/L,Mg2+1.5 mmol/L,Taq DNA聚合酶0.5 U,引物835号的最适退火温度为50.8℃。结果表明此反应体系标记位点清晰、稳定、重复性好。     

荷花ISSR-PCR反应体系的建立及优化

以荷花叶片提取的基因组DNA为材料,通过对影响ISSR-PCR扩增效果的一些因素,如dNTPs浓度、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶用量、引物用量、模板DNA用量以及退火温度等进行筛选和优化,确立了可用于荷花ISSR-PCR分析的最适宜的PCR反应体系:20μL PCR反应体积含0.4 mmol.L-1dNTPs、3.5 mmol.L-1Mg2+、1.5 UTaqDNA聚合酶、0.4μmol.μL-1引物、3 ng模板DNA。PCR扩增程序为:94℃预变性2 min,94℃变性30 s,54.5℃退火30 s,72℃延伸1 min,45个循环,最后72℃延伸7 min,置4℃保存。应用该ISSR体系对6份荷花种质进行了扩增,证实了该体系的适用性和稳定性。     

三七ISSR-PCR反应体系建立及优化

 为建立和优化三七 ISSR PCR反应体系,运用正交试验和单因子试验分析模板DNA,TaqDNA聚合酶、引物、Mg2+和dNTPs 5个因子对ISSR PCR反应影响。结果发现,三七 ISSR PCR 25μL反应体系中5个因子最佳水平：DNA模板为9.6ng,TaqDNA聚合酶为2.0u, Primer浓度为1.0mmol/L,dNTPs浓度为0.68mmol/L,Mg2+浓度为2.8mmol/L。研究结果为利用ISSR分子标记技术研究三七提供了理论支持。     

大血藤ISSR-PCR反应体系的建立

采用改进的SDS法抽提大血藤基因组DNA,分析了镁离子、dNTP、模板DNA含量、引物浓度、Taq DNA聚合酶量和BSA浓度对大血藤ISSR-PCR扩增结果的影响,建立了稳定的、可重复的大血藤ISSR最佳反应体系:10μL PCR反应体积中,4×Taq酶配套缓冲液(10 mmol/L Tris-HC l,pH9.0,50 mmol/L KC l,1 g/LTriton X-100),0.5U Taq DNA聚合酶,2 mmol/L MgC l2,0.1 mmol/L dNTP,12 pmol引物,10 ng模板DNA,2 mg/mL牛血清白蛋白。大血藤的最适退火温度为52.4℃。     

吴茱萸ISSR-PCR反应体系优化

[目的]建立吴茱萸ISSR-PCR最佳反应体系。[方法]采用改良的CTAB法提取吴茱萸基因组DNA,研究模板DNA、dNTPs、Mg^2＋、引物（U834）、Taq DNA聚合酶的浓度对ISSR-PCR扩增结果的影响。[结果]20μl反应体系中含2μl 10×PCR buffer,0.15 mmol/LdNTPs,1.6 mmol/L Mg^2＋,0.4 mmol/L引物,20 ng模板DNA,1.2 U Taq DNA聚合酶。[结论]为研究吴茱萸种质资源遗传多样性和分子鉴定奠定了技术基础。     

黄芪ISSR-PCR反应体系的建立及优化

为获得最优黄芪ISSR-PCR反应体系,以山西省浑源县官儿乡蒙古黄芪为试验材料,利用单因素试验法对反应体系中的4个因素(模板DNA,dNTPs,Taq DNA聚合酶,ISSR引物)分别设置浓度梯度进行体系优化。结果表明,20μL黄芪ISSR-PCR最优体系为:模板DNA质量浓度6.0 ng/μL,dNTPs浓度0.03 mmol/L,Taq DNA聚合酶浓度0.05 U/μL,引物浓度0.80 mmol/L。最后用不同产地的黄芪检测该体系,结果发现,PCR产物多态性良好。优化体系的确立为今后黄芪种质资源的分子评价奠定了技术基础。     

金银花ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以金银花叶片基因组DNA为模板,通过单因素试验,研究了退火温度、Taq DNA聚合酶的用量及模板DNA、引物、dNZPs、Mg2 浓度等6种因素对ISSR-PCR扩增的影响,建立了适合于金银花IS-SR-PCR反应体系和扩增程序,即在20μ1反应体系中,内合1×PCR反应缓冲液(Mg2 free)、1.5U TaqDNA聚合酶、0.15mmol/L dNTPs、0.41xmo1/L 引物、1.5mmo1/L MgC12、60ng模板DNA.确定了适宜的退火温度为49.9℃.扩增程序为94℃预变性5min;35个循环为94℃变性30s,49.9℃退火30s,72℃延伸1.5min;最后72℃延伸7min,4℃保存.利用优化反应体系,从100务ISSR引物中筛选出10条稳定性和重复性高的引物;以这1O条引物对22个金银花品种基因组DNA扩增,共扩增出108条带,其中多态性条带96条.多态性条带比率为88.9%.金银花ISSR反应体系的建立为利用ISSR标记技术进行金银花品种鉴别、分类、种质资源遗传多样性分析奠定了良好基础.     

藤三七ISSR-PCR反应体系的建立与优化

[目的]建立和优化藤三七稳定ISSR-PCR反应体系和扩增程序。[方法]采用5因素4水平的正交试验和单因子梯度优化相结合的方法。[结果]适用于藤三七的25μl ISSR-PCR反应体系中各因素的最佳浓度分别为:10×buffer 2.5μl,dNTPs 0.15 mmol/L,Mg2+2.0mmol/L,Taq酶1.0 U,引物0.5μmol/L,DNA 100 ng。[结论]对于藤三七ISSR-PCR试验,一次正交试验完全可以建立满足要求的ISSR-PCR体系。     

大叶石上莲ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为建立并优化大叶石上莲(Oreocharis benthamii)ISSR-PCR反应体系,采用改良的CTAB法提取大叶石上莲叶片DNA,利用正交试验设计方法,从Mg~(2+)、d NTP、引物、Taq DNA聚合酶以及模板DNA 5因素4水平,对大叶石上莲ISSR-PCR反应体系进行优化,确立了适用于大叶石上莲的扩增多态性高、稳定性强、条带清晰的ISSR最佳反应体系:2.0μL的10×PCR缓冲液,2.0 mmol/L Mg~(2+),0.25 mmol/L d NTP,0.7μmol/L引物,2.0 U TaqDNA聚合酶,30 ng DNA模板(20μL反应体系)。在此基础上,从100条引物中筛选出13条ISSR扩增引物,其中5条引物最为合适并已确定其最佳退火温度。     

单雌蓖麻ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以单雌蓖麻提取的基因组DNA为材料,采用单因子试验方法,分别研究了Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶以及模板DNA用量5种因素对ISSR-PCR反应的影响;建立了适合单雌蓖麻IS-SR-PCR扩增的反应体系,即在20μL反应体系中,10×PCR buffer 2.5μL(Mg2+free),模板DNA 20 ng,2.0mmol/L MgCl2,引物浓度1.0μmol/L,dNTP 0.4 mmol/L,Taq DNA聚合酶1.0 U。     

对节白蜡ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以对节白蜡(Fraxinus hupehensis Chiú,Shang et Su)基因组DNA为材料,采用正交试验和单因子试验对其ISSR-PCR反应体系进行了构建与优化。结果表明,在15μL反应体系中含DNA模版40 ng、引物终浓度0.7μmol/L、7.5μL 2×Taq PCR Plus Master Mix的扩增效果最好。该反应体系筛选出了14条稳定性强、多态性高、扩增效果较好的ISSR引物,并通过梯度PCR试验比较引物在不同退火温度下的扩增效果,从而确定引物最佳退火温度。     

扁玉螺ISSR-PCR反应体系的建立及其优化

以扁玉螺基因组DNA为材料,分析了Mg2 ,dNTP、Taq DNA聚合酶、引物以及模板DNA浓度对ISSR-PCR扩增效果的影响,建立了一套适合扁玉螺的ISSR-PCR反应体系.该反应体系包括:2.0mmol·L-1的Mg2 ,0.25 mmol·L-1的dNTP,0.8 U的Taq DNA聚合酶,0.2 μmol·L-1的ISSR引物和40 ng模板DNA.利用优化后的反应体系,从30条ISSR引物中筛选出13条扩增效果较好的引物,为进一步利用ISSR标记研究扁玉螺的遗传多样性奠定了基础.     

钩距虾脊兰ISSR-PCR反应体系的建立与优化

[目的]为钩距虾脊兰种质资源研究奠定基础。[方法]以钩距虾脊兰为试验材料,、利所改良的CTAB法提取钩距虾脊兰基因组DNA,并对影响ISSR扩增反应的各因素进行优化。[结果]获得了高质量的钩距虾脊兰基因。组DNA;同时,建立了最适的钩距虾脊兰ISSR-PCR体系,即25山PCR反应体积中,2．5μl10×PCRbuffer,2．0mmol／LMgCl2,100ng模板DNA,240μmol／LdNTPs,1．75UTaqDNA聚合酶,0．4μmol／L引物;最佳扩增程序为94℃预变性5min。然后进行40个循环：94℃变性30s,复性温度根据各引物的TM值略低1～2℃,30s,72℃延伸50s,循环结束后72℃延伸7min,4℃保存。[结论]这一优化系统的建立为进一步利用ISSR分子标记技术进行钩距虾脊兰遗传多样性研究提供了基础。