牛分离精子ICSI后卵母细胞激活方法的研究

本研究的目的是比较采用由流式细胞仪分离的牛X和Y精子进行胞质内精子注射(ICS I)后,两种不同激活方法对ICS I卵母细胞的激活效果。ICS I后,卵母细胞用5μm o l/L的Ionom yc in(离子霉素)处理5 m in后,先在化学成分明确培养液(CDM-1)中培养3 h,然后再在含有1.9 mm o l/L 6-DM AP(6二-甲氨基嘌呤)的培养液中培养3 h(Ionom yc in CDM-1 DM AP),或用5μm o l/L的Ionom yc in处理5 m in后,不经过CDM培养直接转入1.9 mm o l/L DM AP的培养液中培养3 h(Ionom yc in DAM P)。结果发现,两种激活处理的效果差异不显著。     

用冻干精子生产ICSI小鼠

前期研究中，我们采用小鼠卵母细胞胞浆内精子注射（ICSI）技术，成功地用新鲜精子获得了生理健康的ICSI小鼠。在此基础上，本文结合细胞冻干技术，进行了冻干精子ICSI生产试管小鼠的尝试。B6D2F1成年公鼠的精子在Tris-HCl-EDTA（pH8.2）溶液中冻干4 h后解冻，将其精子头注入到KM小鼠成熟卵母细胞的胞质中。6 h后，83.0%的卵子受精。用CZB溶液体外培养发现，冻干精子生产的胚胎，体外发育至2-C (92.0% vs 99.5%)、4-C（52.7% vs 97.2%）、桑椹胚（36.6% vs 86.3%）和囊胚的比例（21.4% vs 68.7%）极显著地（p<0.01）低于新鲜精子生产的ICSI胚胎。移植2-C期冻干精子ICSI胚胎检测体内发育，结果发现，D10的着床率为63.0%（17/27）；胎鼠的出生比例为21.7%（13/60），这些ICSI小鼠成年后的生理和生殖能力正常。试验结果说明，精子冻干后，仍能生产ICSI动物，冻干技术可以用于哺乳动物精子的保存。     

兔精子微注射受精研究：Ⅳ精子机械损伤对受精和发育的影响

冷冻或超声波处理兔精子会导致精子一定程度的损伤，这种损伤的性质多属机械性的，表现在精子活力的降低与结构完整性的破坏；兔精子微注射受精试验表明，上述两种类型的精子损伤并不影响微注射卵正常受精反应的发生与受精卵早期发育的正常卵裂行为，说明微注射受精中精子的活力及其结构的完整性不是卵子受精的发育所必需；但超声波处理对微注射卵的受精率和发育率却有明显的不良影响，揭示超声波处理后脱落的胞质成分中可能含有某种     

孕酮对绵羊精子体外获能的影响

为了探讨孕酮对绵羊精子体外获能的影响,将绵羊精子分别加到含不同浓度(1、5、10μm o l/L)孕酮的输卵管合成液(SOF)中,作用不同时间后分别取出部分精子样本进行金霉素荧光染色(Ch lortetracycline,CTC),通过精子与CTC结合染色的不同类型来评定孕酮对绵羊精子的影响。结果显示,在240 m in和360 m in时,各实验组中获能精子的百分数均明显高于对照组的(P<0.05),说明一定浓度的孕酮有利于绵羊精子的体外获能。     

哲罗鲑精子冷冻保存

哲罗鲑(Hucho taimen)是分布于额尔齐斯河和黑龙江等水域的冷水性珍稀鱼类,对其精子冷冻保存技术进行研究并建立精子冷冻库,对于哲罗鲑种质保存、人工繁殖发育、苗种培育及种群恢复都具有重要的意义.本研究利用生理盐水、葡萄糖、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)等配制了9种精子稀释液(MPRS,RS,Hanks,ELS,EG1,EG2,Stein,SS-2和D1S),对哲罗鲑精子在稀释液中活力、加入抗冻剂后活力和液氮中冷冻后活力进行检测,发现精子在以上稀释液中均具较高活力(73.00±2.65)％～(96.67±2.08)％,加入二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)后活力下降,冷冻后仅在ELS和D15中具有极低活力(1.21±0.00)％和(1.1±0.00)％.进而利用ELS对甲醇、二甲基亚砜浓度进行筛选,发现精子在4％～12％甲醇中平衡20 min后活力仍为(79.00±6.52)％～(88.80±7.89)％,冷冻后仅在6％甲醇中具有相对较高活力(18.33± 10.61)％,但与鲜精活力相比显著下降(P＜0.05).精子在4％～12％ DMSO中平衡5 min后精子活力为(43.75± 11.09)％～(81.67±2.89)％,平衡20 min后精子活力极大下降(3.25±0.30)％～(45.00±5.77)％,冷冻后精子活力极低(1.00±0.00)％～(2.75±1.50)％(P＜0.05).以D15为基础液对葡萄糖浓度进行筛选,发现当葡萄糖浓度为30％(D30)时,冷冻后精子活力相对较高(17.80±2.59)％,但与鲜精相比活力显著下降(P＜0.05).另外对精子在D15、D30、Stein和ELs4种稀释液中短期保存的效果进行比较表明,Stein中精子存活在时间最长(45 h),D30次之(15h).综上所述,分别在ELS和D30中加入6％甲醇冷冻保存哲罗鲑精子具有一定活力,本研究结果为哲罗鲑精子大量冷冻保存和精子库建立等方面研究奠定了基础.     

不同孵育时间对猪精子转染外源DNA效果的影响

建立稳定的精子载体法技术体系对家畜的转基因育种等研究具有重要意义.为获得公猪精子与DNA最佳共孵育时间,优化建立猪精子载体法技术体系,本研究通过定量PCR、荧光显微镜检测和精液常规分析方法等,研究分析猪精子与DNA不同共孵育时间对猪精子活力、活率、DNA转染率、吸附DNA和内化DNA量的影响.结果表明,多聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)包裹的标记DNA与精子共孵育15、30、60和90 min后,随着孵育时间的延长,精子活力和活率有极显著下降(P＜0.01),而精子转染率呈极显著(P＜0.01)或显著(P＜0.05)上升,吸附外源DNA量和内化外源DNA量也呈上升趋势,但是30 min后不同孵育时间之间差异不显著(P＞0.05).此外,随着共孵育时间的延长,与精子转染率提高幅度相比,精子活力和活率的下降幅度更明显.综合考虑精子活力、活率、转染率、吸附DNA量和内化DNA量等参数,猪精子与外源DNA共孵育时间以30 min为最佳.     

红景天多糖对猪精子冷冻保护效果的研究

研究旨在探索红景天多糖以及三种添加方案对猪精子冷冻保护效果的影响.实验1中,在冷冻保存I液中分别添加红景天多糖分别为0、2 mg/L、4 mg/L、6 mg/L、8 mg/L和10 mg/L;实验2中,在冷冻保存Ⅱ液中添加红景天多糖,浓度同实验1;实验3基于实验1和2,对比了三种红景天添加方案对猪精子冷冻效果的影响.研究结果表明:1、红景天多糖较适宜添加浓度为6 mg/L,能明显提高猪冷冻精子品质,并能为猪精子提供较好的抗氧化作用;2、三种添加方案中,在I液中添加(方案A)对猪冷冻精子保护效果明显优于方案B和C(P<0.05).     

奶牛X性控冻精的卵胞质内精子注射研究

探讨奶牛X性控冻精的卵胞质内单精子注射(ICSI)技术的可行性及显微操作条件对奶牛X性控冻精ICSI效果的影响.结果表明,注射运动性控冻精ICSI卵的卵裂率和囊胚发育率均高于不运动组,但差异不显著(P>0.05).分别用5%、8%和10%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的精子操作液处理性控冻精,进行ICSI操作,ICSI卵的卵裂率差异不显著;但PVP在5%和10%时,正常卵裂率分别是78.4%和69.1%(P<0.05),囊胚率分别是29.7%和20.4%(P<0.05).精子显微注射时,将卵母细胞的极体调整在相当于时钟6点与12点的位置时,所获ICSI卵的卵裂率差异不显著,但正常卵裂率(76.4%,66.7%)和囊胚率(28.6%,19.0%)明显提高(P<0.05).结论认为,进行奶牛X性控冻精ICSI操作时,应选用运动精子,并用含5%PVP的精子操作液进行处理,而且注射在卵母细胞极体置于6点的位置,有利于ICSI卵体外发育.     

额尔齐斯河江鳕精子冷冻保存研究

额尔齐斯河中蕴藏着丰富的冷水鱼类种质资源,江鳕(Lota lota)是其中之一,建立其精子冷冻保存技术和精子冷冻库,对种质资源保存具有重要意义。本研究利用无机盐、葡萄糖、蔗糖、胎牛血清等配制7种精子稀释液,以5∶1的比例稀释精液,激活后观察统计精子活力。结果显示,江鳕精子仅在SS、D15和CM中具有(13.33±2.89)%~(8.33±2.88)%活力。在此基础上配制22种梯度稀释液(SS-00~SS-10和D15-0~D15-7),以同样的方法稀释和观察精子活力。结果显示,SS-0(56.67±5.77)%、SS-2(63.33±5.77)%、SS-5(53.33±5.77)%和D15-7(63.33±5.77)%中精子活力较高,与鲜精活力(76.67±5.77)%接近(P0.05)。将二甲基亚砜(DMSO)和甲醇(MeOH)以3∶2比例配制成混合抗冻剂(DM),分别以5%~12%浓度加入到精子稀释液SS-5和D15-7中,以5∶1比例稀释精液,冷冻保存精子。结果显示,冷冻前,5%DM的SS-5和D15-7中精子活力(73.33±5.77)%与鲜精无显著差异(P0.05),当DM浓度升高到10%~12%时,精子活力接近于0;冷冻后,在DM浓度为6%的SS-5中,精子活力较高为(26.67±5.77)%(P0.05);在DM浓度为7%的D15-7中,精子活力较高为(26.67±5.77)%(P0.05)。本研究结果为额尔齐斯河江鳕精子冷冻保存提供了一定的理论和技术依据。     

星斑川鲽精子冷冻保存与生理特性分析

针对星斑川鲽(Platichthys stellatus)养殖群体中雄性个体较雌性小,产精液量低,限制了人工繁殖育苗和杂交育种开展等问题,本研究以性成熟的星斑川鲽为实验材料,对精子稀释液成分、稀释液渗透压、激活海水适宜温度和冷冻精液的适宜稀释比例等进行筛选,并用冷冻精液和鲜精分别与星斑川鲽卵进行受精和孵化实验,实验结果利用SPSS软件中单因素方差分析法和Student-Newman-Keuls进行比较分析。结果表明,利用Ts-2(37.65 g/L蔗糖+10.01 g/L KHCO3+1.21 g/L Tris碱)和SFs-4(60 g/L葡萄糖+10.01 g/L KHCO3+1.21 g/L Tris碱)冷冻保存的精子活力最高,分别为(56.67±5.78)%和(66.67±5.77)%。利用计算机辅助精子分析(computer assisted sperm analysis,CASA)系统对星斑川鲽精子进行分析,测定了用Ts-2和SFs-4保存的冷冻精液中精子运动方式的各项参数。结果显示,测定的各项参数(曲线运动速度(curvilinear velocity,VCL)、直线运动速度(straight line velocity,VSL)、平均鞭打频率(beat cross frequency,BCF)、运动的直线性(linearity,LIN)和运动的前向性(straightness,STR)表明,利用SFs-4保存的精子各项运动参数明显高于Ts-2。利用蔗糖、KHCO3和Tris碱配制不同渗透压稀释液中,在渗透压为319.94 Pa时,精子活力最高,为(61.67±5.00)%,与鲜精相比无显著差异(P0.05)。利用3~18℃海水激活精子,结果显示,当激活海水温度在12℃时精子活力最高,与鲜精相比无显著性差异(P0.05),而其他温度下显著低于鲜精活力(P0.05)。将解冻后的精液稀释10~40倍,与星斑川鲽卵受精,结果显示,在稀释20倍后冷冻精液的受精率最高。本研究利用Ts-2+20%二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)和SFs-4+20%DMSO对星斑川鲽精子成功进行冷冻保存,为星斑川鲽精子冷冻保存、种质库的建立和应用提供理论和技术依据。     

辐照对棉铃虫精子数量与活力的影响

辐照没有影响棉铃虫雄虫复射精管中有核精子束的数量和雌虫精包中有核精子的数量 ,但影响了有核精子束成熟的过程。与 40 0Gy辐照棉铃虫雄虫交配后 ,雌虫受精囊中有核精子的数量与活力显著减小 (P <0 0 5)。     

辐照对光肩星天牛交配能力的影响

光肩星天牛 (A .glabripennis)的精子在羽化后 1 0～ 1 4d发育成熟并在精巢中开始活动。一个有核精子和一个无核精子联合在一起组成一个正常的成熟精子 ,其中无核精子的功能是帮助有核精子游动。辐射对精子传导没有影响 ,然而对精子活力有一定的影响。纱笼试验条件下 ,不同交配类型的交配次数总体上趋向于概率预测值。纱笼试验条件下释放的辐照光肩星天牛有效抑制了正常光肩星天牛的生殖 ,辐照对光肩星天牛的交配竞争能力没有显著影响     

ICSI介导生产转基因牛胚胎影响因素的研究

采用牛体外成熟卵母细胞和冷冻解冻的精子为材料,以pEGFP-N1为模式基因,探讨DNA浓度、精子质膜破损方法、注射台温度对牛精子胞质内注射（ICSI）介导转基因效果的影响。结果表明：线性pEGFPN1质粒DNA浓度为5μg/mL、10μg/mL两组的早期胚胎发育率显著高于50μg/mL组（19.8%,16.7%VS 7.9%,p〈0.05）。以冻融、TritonX100、超声波断尾三种方法破损精子质膜,冻融组的囊胚发育率（24.7%）最高,且冻融组的早期胚胎基因表达率极显著高于超声断尾组（41%VS 20.5%,p〈0.01）;当分别在25℃、38℃的注射台进行显微注射时,两组之间胚胎的囊胚率无显著差异（p〉0.05）,但二者之间胚胎的基因表达率差异显著（46.83%VS 28.57%,p〈0.05）。以上结果表明：（1）牛精子转染外源GFP基因的浓度不宜过高,转染高浓度的DNA会影响胚胎发育;（2）精子质膜是阻碍外源DNA与牛精子相结合的主要因素,将精子冻融处理可有效破损其质膜,利于精子与外源DNA的结合,从而提高ICSI介导转基因效率;（3）25℃和38℃热台温度对牛ICSI胚胎的早期发育无影响,但25℃热台温度可提高牛ICSI介导转基因的效果。     

~(60)Coγ射线对柑桔大实蝇Dacus citri雄性生殖细胞的影响

本文研究了~(60)Coγ射线对柑桔大实蝇(Dacus citri)精子发生的影响。用9krad辐照羽化前2天的蛹,成虫羽化后解剖观察,雄虫已有大量成熟精子,精子形态、数量和活力与未经辐照处理的雄虫无显著差异,但其超微结构则发生了某些异常变化,如营养细胞出现空泡、精子排列零乱、线粒体衍生体和轴丝增多或减少、构型被破坏、精子细胞分裂异常等。     

青杨脊虎天牛精子超微结构及其辐照后的变化

研究了青杨脊虎天牛幼虫、蛹和成虫阶段受γ射线辐照后雄虫精子超微结构的变化情况。青杨脊虎天牛雄虫精子分为头部和尾部。头部无顶体,由精核组成,核染色质致密均匀;尾部主要由9+9+2型轴丝和2个在横切面上大小近于相等的线粒体衍生物组成。青杨脊虎天牛成虫、幼虫期和蛹期受γ射线辐照后,雄虫精囊内均发生了2个或多个精子粘连现象。在80Gy剂量辐照下,成虫和幼虫期辐照的精子束内2个精子粘连的现象居多,精子损伤程度基本一致;而蛹期辐照的精子损伤程度略高于成虫和幼虫阶段,精子束内以2个以上精子粘连为主,精细胞内各细胞器排列分散,附体和线粒体衍生物形态改变。120Gy辐照的天牛雄虫精子发生明显肿胀,精核直径为正常精子的10倍多,多个精子粘连的现象增多,精细胞内各细胞器的排列也发生变化,损伤程度明显高于80Gy。     

γ射线辐照对黄斑星天牛雄虫精子超微结构的影响

应用透射电镜观察黄斑星天牛雄虫精子及其辐照后精子的超微结构。精子分为头尾两部分,头部主要结构为精核,尾部由线粒体衍生物及微管系统(轴丝)组成。轴丝由副微管、双微管和中心微管组成,呈9+9+2构型。经80和120Gy的γ射线辐照后,黄斑星天牛出现了多个精子相粘连现象,粘连状态下有些附体连在一起形如弯曲的线形,一些线粒体衍生物也发生粘连。未发生粘连的精子内细胞器排列分散,线粒体衍生物以及轴丝两侧附体形状也发生改变。80和120Gy辐照虫之间的精子超微结构变化未见明显差异。     

Sperm winding in Collembola

The winding process leading to the formation of rolled-up spermatozoa in Collembola is described. It is a phenomenon common to all collembolan species examined so far and it starts with the organization of a cytoplasmic flattened evagination beneath the head of the elongated spermatid, which gives rise to an extracellular cavity. Within this cavity secretory material produced by the epithelial cells of testes is progressively stored. The spermatozoon, whose cytoplasm is reduced to a thin layer, enrolls around this material. The final appearance is that of a spheroidal or lenticular structure containing dense material in the central extracellular cavity; this cavity is surrounded by the flattened sperm in whose cytoplasm the sperm components forms several spires. The material into the extracellular cavity becomes progressively denser and has a different appearance in the species examined.     

辐照对棉铃虫精子传导及产卵反应的影响

本文报道辐照棉铃虫与正常棉铃虫精子传导。棉铃虫的精子传导是一个复杂的过程 ,正常棉铃虫精子传导的失败率为 1 9% ,经 2 50Gy和 40 0Gy辐照后 ,精子传导的失败率分别为 2 1 %和 50 %。精包“帽”定位的异常是精子传导失败的一个重要原因。当棉铃虫雌虫与高剂量辐照雄虫交配后 ,产卵反应表现异常。     

氧化乐果对雄性大鼠生殖毒性及作用机制

为评价氧化乐果在体内的亚慢性生殖毒性,以0（CK）、0.44、1.32和3.97mg/(kg•d).连续染毒大鼠6周。结果显示,氧化乐果能引起雄鼠体重下降,睾丸和附睾及脏器系数极显著增加（P ＜0.01）,睾丸组织病理学改变,尤其引起睾丸曲细精管萎缩、变性,各级生精细胞减少,支持细胞数量减少,间质增宽。降低附睾精子数及附睾精子活力(P ＜0.01 ）,精子畸形率显著升高(P ＜0.05 ）; 降低睾丸组织酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、乳酸脱氢酶（LDH）的活力,增加γ-谷氨酰转移酶（γ-GT）活力（P ＜0.01）和睾酮（T）（P ＜0.01）和卵泡刺激素（FSH）的含量（P ＜0.05）。结合组织病理、性激素、酶活性及精子质量的变化,表明氧化乐果可对雄性大鼠机体产生明显的毒性作用,也具有雄性生殖毒性,其主要靶器官为睾丸。