应用RT-PCR技术检测马铃薯A病毒

参考GenBank中马铃薯A病毒(potato virus A,PVA)的保守序列,利用Primer6.0引物设计软件设计并合成了一对特异性引物PVAF、PVAR,以此引物利用RT-PCR方法对PVA保守序列基因进行了特异性扩增。结果表明:引物PVAF、PVAR能从已知的感染PVA病毒的植株中扩增出834bp的cDNA特异性片段;该RT-PCR的检测灵敏度为1pg的病毒核酸,特异性强,重复性好,可用于PVA病毒的快速检测。     

菜豆荚斑驳病毒的RT-PCR检测

菜豆荚斑驳病毒是对大豆经济具有重要影响的病毒.根据已报道的菜豆荚斑驳病毒外壳蛋白基因序列,设计出一对特异性引物,采用RT-PCR法,可有效地扩增出BPMV不同亚组的4个分离物,得到650 bp大小的PCR产物.这种方法能成功地检测出大豆病叶中的BPMV,结果和酶联检测是一致的,而对大豆种皮中BPMV的检测效果不佳,建议采用酶联的方法进行检测.     

马铃薯病毒的RT-PCR检测技术评述

对应用于马铃薯病毒检测中9种不同形式的RT-PCR检测技术进行评述,重点讨论常规RT-PCR、多重RT-PCR、Real-time RT-PCR等方法。分析了RT-PCR在同种病毒不同株系鉴定中的应用效果及建立系统进化树时应注意的问题。对RT-PCR技术在马铃薯病毒检测中可能出现的问题也进行了分析,并提出了应对策略。     

马铃薯纺锤块茎类病毒内蒙古分离株的克隆及序列分析

采用内蒙古自治区采集的感染马铃薯纺锤块茎类病毒(Potato spindle tuber viroid,PSTVd)的马铃薯材料,克隆了PSTVd的全长基因,命名为内蒙古分离株(PSTVd-IM),对其序列进行分析。结果表明,该序列大小为359 bp,其与俄罗斯的PSTVd分离株(EF044305.1)序列吻合。将该分离物与国内外已经报道的PSTVd株系进行了比较,构建了系统进化树,确定了其分类地位;通过序列比对和二级结构分析,发现PSTVd-IM与已报道的PSTVd三类致病类型株系:强株系(U23058.1)、中间株系(AY937179.1)和弱株系(M14814.1)的同源性分别为97.78%,98.61%和99.44%;且与这三种类型株系在中央保守区、致病区和可变区结构域存在差异,说明这些结构域可能与其致病性相关。PSTVd-IM的序列与二级结构分析有利于明确其来源及致病性的差异位点,对于PSTVd的致病机制的研究具有重要意义。     

马铃薯X病毒的RT-PCR和IC-RT-PCR检测

马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)是侵染马铃薯重要病毒之一,通常引起花叶症状,在田间常与其他病毒混合感染导致马铃薯的毁灭性减产。PVX尚无有效的药剂可以防治,加强对PVX的快速检测是一个亟待解决的课题。本研究应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和免疫捕捉反转录聚合酶链式反应(IC-RT-PCR)技术检测马铃薯X病毒。结果表明:IC-RT-PCR方法可检测出稀释至1.0×10-3的粗汁液中的病毒;RT-PCR方法可从稀释至1.0×10-4的总RNA中扩增出特异的目的条带。这两种方法均具有较高的检测灵敏度,均可用于马铃薯X病毒的检测。     

马铃薯卷叶病毒CP基因的RT-PCR扩增

根据马铃薯卷叶病毒CP基因的序列设计合成了两对特异性DNA引物,用RNA提取试剂RNAplant从感病的马铃薯叶片中提取总RNA,在3′引物引导下以总RNA为模板反转录合成cDNA第一链,然后进行PCR,分别扩增出了长627 bp和336 bp的特异性PCR产物,其大小与预期的CP基因及其部分序列一致,实现了马铃薯卷叶病毒CP基因及其片段的简便、有效的RT-PCR扩增。     

马铃薯病毒分子检测技术研究进展

对种子、苗木和无性繁殖材料以及在发病早期对植株进行快速准确地检测尤为重要。目前国内外马铃薯病毒分子检测技术的研究,主要涉及以蛋白质和核酸为基础的检测方法。以蛋白质为基础的检测方法主要根据免疫学原理,包括酶联免疫吸附反应测定法、直接组织斑免疫测定法和胶体金免疫层析法。以核酸为基础衍生的检测方法较多,主要有RT-PCR检测技术、免疫捕捉-RT-PCR检测技术、核酸杂交检测技术、指示分子NAS-BA技术、实时荧光定量PCR技术和基因芯片技术。     

应用DAS-ELISA法同时检测多种马铃薯病毒

报道了使用多价血清同时检测多种马铃薯病毒的快速DAS ELISA法。实验分别用快速DAS ELISA法和常规DAS ELISA法检测PVX、PVY、PVS、PVM、PLRV5种主要马铃薯病毒进行比较 ,二者阳性率和灵敏度基本相同 ,但快速法比常规法操作简便、节省时间、节省材料 ,且快速法重复性好 ,结果可靠 ,表明快速DAS ELISA法是一种直观、实用、快速、准确可靠的检测方法 ,适合种薯生产中大量样品的多种主要马铃薯病毒的快速检测。     

马铃薯病毒的常用检测方法

目前常用马铃薯病毒检测的方法,主要包括寄主生物学检测法、抗血清检测法、电子显微镜检测法、酶联免疫检测法和分子生物学检测法。重点讨论了分子生物学方法中的各种RT-PCR方法。同时对各种方法的优缺点进行了比较,并总结出将传统生物学检测技术、免疫学检测技术和分子生物学检测技术相结合必将成为检测植物病毒最经济有效的手段。     

NCM-ELISA检测马铃薯Y病毒(PVY)技术的研究及应用

血清学方法是病毒检测的主要手段。本试验通过对马铃薯Y病毒(PVY)的提纯,免疫家兔制备PVY抗血清,并提取PYV免疫球蛋白IgG作为NCM-ELISA反应为一抗,以市售羊抗兔抗血清为二抗,在硝酸纤维素膜(NCM)上进行NCM-ELISA反应检测PVY,建立PVY NCM-ELISA检测反应体系。试验结果显示,NCM-ELISA具有反应特异性强,灵敏度高的优点,检测植物叶片样品的最高稀释度可达到1:250。通过对田间40份样品的NCM-ELISA和DAS-ELISA检测比较,其检测结果吻合率达到100%。由于NCM-ELISA方法可以将样品点在硝酸纤维素膜上,并且可贮存几个星期或将膜送到其他实验室进行检测,因此具有操作简单,使用方便,检测成本低等优点。     

武汉地区马铃薯Y病毒株系的类型

马铃薯Y病毒(PVY)是严重危害我国马铃薯生产的主要病毒之一。本研究通过RT-PCR的方法,对依据症状采集的124份马铃薯叶片样品进行了病毒检测,并对其中PVY阳性样品进行了株系类型分析。结果显示,在93份PVY阳性样品中,PVYN/NTN/N??O类型株系占60.2%,而PVYO普通株系占20.4%,还有18个样品(19.4%)显示受到两种类型PVY的混合侵染。进一步分析表明,在PVYN/NTN/N??O类型株系中,PVYNTN、PVYN??O和PVYN三种株系分别占83.8%、12.2%和4.0%;而PVYO普通株系中,PVYO-FL和PVYO-RB两种变异型各占70.3%和29.7%。本研究结果显示,PVYNTN和PVYO-FL是检测样品中主要的PVY株系,该结果为指导马铃薯PVY的防治提供一定的依据。     

湖南省马铃薯主产区马铃薯病毒种类及流行分析

马铃薯是世界第四大粮食作物,其病毒病危害严重。2010年对湖南马铃薯主产区采集的66个病毒标样进行了RT-PCR检测,结果表明,检测出的马铃薯病毒有马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)、马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯A病毒(PVA)和马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)。其中PVS的检出率最高,为54.5%,其次是PVX,检出率为45.5%,PVY的检出率为39.4%,PSTVd和PVA的检出率均为21.2%,PLRV的检出率为18.2%。2~4种病毒的复合侵染现象较为普遍。PVY中重组型PVY占85.7%。     

我国马铃薯病毒的种类及脱毒种薯生产过程中病毒的检测

对近年来我国各马铃薯产区病毒发生情况进行分析,详细列出马铃薯主产区病毒病种类及各主要马铃薯病毒的分布情况。分析表明,我国很多马铃薯产区尚缺少全面、系统的马铃薯病毒调查。同时比较了我国各地区马铃薯脱毒种薯生产过程中对病毒的检测规程,并分析了马铃薯A病毒(PVA)的检疫风险。     

马铃薯Y病毒一步RT-PCR检测试剂盒的研制

马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)对马铃薯的危害最大,可导致马铃薯退化,降低马铃薯产量。解决这一问题的重要途径就是培养脱毒种薯,但是否完全脱毒需要经过检测才能证实。本研究依据PVY CP基因序列设计合成了一对引物PY1、PY2,以带毒样品植物总RNA为模板,在同一个反应中同时加入反转录和PCR反应所需试剂,反应程序中包括反转录和PCR反应所需条件,进行反应扩增,带毒样品扩增得到340 bp的目的条带,而健康对照无此目的条带,从而建立了PVY的一步RT-PCR检测技术,并组装成试剂盒。该试剂盒具有良好的稳定性和特异性,灵敏度可以检测到带毒植物组织下限的6.25μg,高于ELISA(100μg)和NASH(15μg)的灵敏度,虽然和常规方法的灵敏度相同,但更为快速、简便、易于操作,适合脱毒苗和脱毒种薯生产单位做大量样品的检测。