TYLCV侵染对番茄叶片解剖结构和保护酶系统的影响

1材料与方法 1．1材料番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）是由烟粉虱以持久方式传播,机械接种传毒,但较困难;种子不带毒,植株间接触也不传毒,所以该试验依靠烟粉虱传播使材料获得病毒表现症状。毒原为上海农科院园艺所保持的带有TYLCV的烟粉虱。2006年7月中旬将番茄材料播种在50孔的穴盘中,以草炭为基质,8月中旬定植在具有足够传播TYLCV烟粉虱的玻璃温室内,每天间断性的驱赶,使烟粉虱充分接触试验材料。供试番茄是对TYLCV的感性品种“2300”,健康植株品种“2300”定植在没有毒源的温室内为对照。     

番茄黄化曲叶病毒侵染对番茄叶片光合及荧光特性的影响

以感病番茄‘1479’和抗病番茄‘H24’为试验材料,研究番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)侵染对植株叶片光合及荧光特性的影响。结果表明:TYLCV侵染后,‘1479’叶片叶绿素含量、净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)均显著降低,胞间CO2浓度(Ci)增加;‘H24’各个参数变化不显著;2个品种的PSⅡ最大光化学量子产量(Fv/Fm)降低幅度较小,‘1479’的PSⅡ有效光化学量子产量(Fv’/Fm’)、PSⅡ实际光化学量子产量(ΦPSⅡ)、表观光合电子传递速率(ETR)和光化学猝灭系数(qP)均显著降低,而‘H24’则降幅较小;‘1479’非光化学猝灭系数(qN)显著升高,而‘H24’升高不明显。表明TYLCV侵染使番茄植株光合作用受到抑制,对感病材料影响显著,而对抗病材料无明显影响。     

TYLCV山东分离物株系分化及侵染性克隆的构建

对2012~2014年山东省96份感番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)样品进行特异性检测,发现有94份样品感染TYLCV,有2份样品感染番茄卷叶病毒(To LCV)。对该94份样品进行全序列克隆和序列测定,共分离出13份TYLCV株系,经核苷酸序列相似性分析和系统进化树构建,明确侵染我国山东地区的TYLCV为TYLCV-IL株系,且3年间爆发于山东省内的TYLCV株系的DNA组分并未发生大变异。遂构建山东寿光TYLCV株系侵染性克隆,经致病性验证,具有较好的侵染率,为番茄抗Ty育种提供稳定的毒源筛选压力。     

RNAi和GroEL介导的双价转基因番茄对TYLCV的抗性

本研究将已构建的SUC2-GroEL和pBI121-AC1-AC2植物表达载体共转化番茄,共获得19株卡那霉素抗性再生植株。经过PCR和RT-PCR检测,初步获得转SUC2-GroEL载体的阳性植株5株,转pBI121-AC1-AC2载体的阳性植株3株以及转SUC2-GroEL/pBI121-AC1-AC2双载体的阳性植株2株。利用TYLCV侵染性克隆农杆菌注射接种法对T0代转基因阳性植株进行抗性鉴定,获得抗TYLCV的转基因植株7株。对T0代未扩出病毒条带的T1代植株进行抗性鉴定,结果发现转SUC2-GroEL、pBI121-AC1-AC2、SUC2-GroEL/pBI121-AC1-AC2不同载体的株系植株中平均带毒率依次是35%、25%和15%,推断转双基因的植株的抗病能力优于转单个基因植株的抗病能力。     

上海市番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)病的初步鉴定

番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)病是对番茄产量影响最严重的病害之一。该病引起的主要症状是叶片边缘呈鲜黄色,卷曲,叶脉墨绿,叶肉变厚,叶片变小;植株矮化萎缩,开花延迟,花朵减少,果实减少,产量损失严重。自1964年番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)被正式命名以     

GroEL基因抗番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)的研究

利用烟粉虱体内GroEL基因,构建了具有抗生素标记的SUC2-GroEL和无抗生素标记的CaMV35SPDRB10 2个植物表达载体.通过农杆菌介导法转化番茄,获得抗性再生苗.对抗性植株进行PCR、RT-PCR以及病毒检测.PCR检测结果表明:SUC2-GroEL载体和CaMV35S-PDRB10载体转化的阳性植株分别有11株和9株.RT-PCR检测结果显示:SUC2-GroEL载体和CaMV35S-PDRB10载体转化植株分别有6株和2株检测到GroEL基因特异条带,说明GroEL基因在转录水平得到表达.农杆菌病毒接种和带毒烟粉虱传毒检测结果显示,SUC2-GroEL 载体转基因植株3、4和5号和CaMV35S-PDRB10载体转基凶植株5号均未表现发病症状,证明利用GroEL基因抗番茄黄化曲叶病毒具有可行性,而且SUC2启动子诱导的GroEL抗性更加理想.     

BTH处理对番茄幼苗TYLCV抗性、光合特性及防御酶活性的影响

以番茄‘1479’和‘2300’为材料,研究了苯并噻二唑(BTH)诱导番茄对番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)的抗病性,并测定BTH处理对番茄幼苗叶片光合特性和几种防御酶活性的影响。结果表明:0.10～2.00 mmol·L-1BTH均有不同程度的诱抗效果,其中0.50 mmol·L-1BTH处理效果明显,诱导效果可达42.7%。BTH可以提高番茄叶片的净光合速率(Pn)和气孔导度(Gs),能缓解由TYLCV侵染带来的净光合速率和气孔导度下降的趋势。喷施BTH或接种TYLCV均可提高番茄叶片过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性,但喷施BTH诱导并接种TYLCV处理的植株叶片上述酶活性比只诱导不接种处理上升速度快。表明,BTH处理可以缓解TYLCV侵染对番茄光合系统的伤害,诱导防御酶活性的增强,显著降低其病情指数,增强番茄对TYLCV的抗性。     

番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒复合侵染的分子鉴定

以番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)及番茄褪绿病毒(tomato chlorosis virus, ToCV)为对象,用分子检测方法对山东、安徽2省病原进行鉴定。选取山东、安徽2省7个地区,对2种病毒病进行田间调查,采集疑似样品扩增序列,对其进行同源性比对和遗传进化树等分析,进一步了解山东、安徽2个省蔬菜产区2种病毒病的发生情况。结果表明,YLCV在山东省大部及安徽省局部地区已经发生扩散且中国所有的分离物仍属于IL株系。明确了ToCV在安徽地区发生,且统计发现2个省6个地区ToCV、TYLCV存在单独侵染及复合侵染。ToCV分离物均可分为2个大组,其中该研究所得到的分离物均与中国其他地区的分离物聚类到一组。     

侵染河南省番茄的番茄黄化曲叶病毒及伴随卫星DNA分子的基因组特征

从河南省长葛市的番茄病株上分离到4份病毒分离物HNCG1、HNCG2、HNCG3和HNCG4,为明确病原类型及其亲缘关系,首先采用检测双生病毒的简并引物进行检测,均能从样品中扩增出约500 bp的片段,4个序列同源性达99%。对HNCG4基因组DNA-A全序列测定表明,其全长为2 781 bp,与番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)省内分离物(HNSQ1、HNNY1、HNLY1、HNQX)及其临近省份的河北分离物(TYLCV LF)、北京分离物(TYLCV BJ3)亲缘关系较近,序列同源性均达99%。进一步研究发现,HNCG1和HNCG4均伴随有1 347 bp的卫星DNAβ,而HNCG2和HNCG3中未检测到DNAβ。序列比对结果表明,HNCG1和HNCG4的DNAβ之间序列同源性为100%,与越南TYLCV分离物DX2的卫星DNAβ序列同源性最高,达88%。根据以上结果,引起河南省长葛市番茄黄化曲叶病的病毒为TYLCV,部分分离物伴随有卫星DNA分子。     

番茄黄化曲叶病毒侵染危害海南番茄及其分子特征

[目的]明确引起海南三亚、东方和陵水番茄黄化曲叶病的病毒分子特征,为防控该病害提供科学依据.[方法]以2019年2月从海南三亚、东方和陵水采集的15份疑似番茄黄化曲叶病样本为材料,采用菜豆金色花叶病毒属病毒的通用简并引物AV494/CoPR对15份样本进行PCR检测,并对PCR检测为阳性的样本进行滚环扩增(RCA)及基因克隆,获得侵染海南三亚、陵水和东方番茄的病毒基因组全序列,进而在GenBank数据库BLASTh程序进行相似性比对,利用SDT 1.2的MUSCLE alignment进行序列相似性比较分析,采用MEGA 6.0的邻接法(Neighbor-joining,NJ)构建系统发育进化树,明确所获得病毒分离物与已报道分离物的亲缘关系.[结果]获得侵染海南三亚、陵水和东方番茄的3个番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)分离物基因组全序列,其大小均为2781 nt,编码6个开放阅读框(ORF),其中病毒链上AV1和AV2基因,互补链上AC1、AC2、AC3和AC4基因.相似性比对分析结果表明,TYLCV海南分离物与墨西哥和美国分离物的相似性在99.0%以上,与来自我国不同省(市)的14个TYLCV分离物的相似性在98.0%以上.系统发育进化分析显示,海南三亚、陵水和东方3个分离物与墨西哥、美国及我国北京和江苏分离物聚集在一个小分支,进一步与来自我国其他12个省(市)、韩国、哥斯达黎加和澳大利亚的分离物形成一个分支.[结论]侵染海南番茄的TYLCV可能来自我国大陆的番茄等种苗和烟粉虱带毒传入,也有可能来自墨西哥和美国等其他国家.