BIOLOG碳源筛选与分离技术结合研究新疆哈密南湖嗜盐菌多样性

[目的]获得新疆哈密南湖的嗜盐菌,并分析其生物多样性,以期为分离培养基碳源设计引入一种快速可行的方法.[方法]利用BIOLOG筛选碳源并结合可培养方法分离哈密南湖中的嗜盐菌,通过16S rRNA基因序列系统发育分析法初步确定所分离菌株的分类地位,获得嗜盐菌的多样性信息.[结果]BIOLOG方法筛选出5种碳源,分别为海藻糖、蔗糖、柠檬酸、甘油和甘露醇.通过将筛选碳源添加至分离培养基的方法,共分离得到细菌和放线菌27株,分属于细菌域中3个门7个科14个属.多数菌株归属于厚壁菌门(Firmicutes),最优势菌株属于薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus).其中6株菌株的16S rRNA基因序列与最近缘种的同源性在94.24;～96.86;,可能为潜在的新种或新属.[结论]新疆哈密南湖嗜盐细菌和放线菌都具有较为丰富的生物多样性,其嗜盐菌主要以薄壁芽孢杆菌和盐单胞菌为主,并且该地区可能含有丰富的嗜盐菌新物种,具有进一步开发研究价值.     

回头岸礁区4 种造礁珊瑚中可培养细菌的多样性

采用稀释涂布平板法,分离三亚鹿回头岸礁区4种造礁珊瑚及其周围海水中的细菌,并基于16S r RNA基因序列进行了系统发育分析,从而探讨造礁珊瑚中可培养细菌的物种多样性。从澄黄滨珊瑚(Porites lutea)、鹿角珊瑚(Acropora sp.)、盔形珊瑚(Galaxea sp.)、扁脑珊瑚(Platygyra sp.)样品中分别分离获得细菌60、61、54、20株,从珊瑚周边海水中分离获得细菌31株。16S r RNA基因序列分析表明,珊瑚来源的细菌分布于放线菌门(Actinobacteria)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)。在属级水平上对4种珊瑚及海水来源细菌群落组成分析,发现在4种珊瑚中均有分布的属有3个,为Brachybacterium、Microbacterium和Ruegeria,珊瑚来源细菌类群有一定差异。同时发现4种珊瑚来源细菌与海水来源细菌类群差异较大。在分离的菌株中,有7株菌与已有效描述的细菌物种典型菌株的全长16S r RNA基因相似性低于97%,代表着潜在新属或新种。试验结果表明,三亚鹿回头岸礁区珊瑚中存在较为丰富的细菌多样性,并潜藏较多的新物种资源。     

塔里木河流域土壤小单孢菌的选择性分离及其抗菌活性筛选

小单孢菌(Micromonospora)是产抗最多的稀有放线菌，为了探索塔里木河流域土样中小单孢菌物种多样性并筛选抗菌活性菌株，本研究通过可培养的方法以塔里木河流域采集的10份土样为研究对象，采用6种不同的分离培养基，通过添加特定抗生素选择性分离培养小单孢菌，并对小单孢菌进行物种多样性及次生代谢产物生物合成基因簇分析。结果表明：选用可培养方法从塔里木河沿岸采集的土样中分离鉴定出484株菌株，分属于3门5纲13目19科22属70种，其中小单孢菌属菌株424株，占87.60%，小单孢菌属的出菌率高。以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌、解淀粉欧文氏菌和白色念珠菌等病原菌作为靶标菌对小单孢菌的发酵粗提物进行抗菌活性筛选，结合antiSMASH生物合成基因簇分析，筛选出5株既具有抗菌活性又具有代谢潜力的小单孢菌。研究表明塔里木河沿岸含水量高的土样中拥有丰富的小单孢菌资源，通过向分离培养基中添加新生霉素、萘啶酮酸、放线菌素等抗生素施加选择压，可以有选择性地分离获得小单孢菌。     

海绵共附生放线菌的分离鉴定与抑菌活性分析

为了探究海南海绵共附生放线菌资源的多样性及潜在的药用价值,采用 4 种分离培养基分离海南文昌海域海绵的共附生放线菌,利用 16S rRNA序列分析对分离的放线菌进行鉴定,采用滤纸片扩散法对分离放线菌的发酵产物进行抗菌活性分析。结果表明,从4种海绵中共获得50株放线菌,所分离菌株归属于5 个亚目、6个科和 7 个属,包括链霉菌属、小单孢菌属、红球菌属、糖多孢菌、栖白蚁菌属、分枝杆菌属和Krasilnikoviella属,其中Krasilnikoviella为首次从海绵中分离得到,4株海洋放线菌为潜在的新物种。抗菌活性测试显示48%的分离菌株呈现抗细菌活性,24%的分离菌株呈现抗植物丝状病原真菌活性。本研究结果初步揭示了海南文昌海域海绵共附生放线菌的可培养物种多样性及其发酵产物的抑菌活性。     

西安市北郊污灌区土壤中抗铅链霉菌的多样性分析

从西安市北郊污灌区采集土样,用添加K2Cr2O75 μg·mL-1和青霉素2 μg·mL-1的高氏1号、HV和SC固体培养基分离到120株具有链霉菌特征的放线菌.采用浓度梯度法,用含Pb2+培养基对分离菌株进行筛选,得到50株抗铅链霉菌.在抗铅能力实验结果的基础上,选取14株抗性较强链霉菌代表菌株进行形态培养特征、生理生化和16S rDNA基因序列相似性等分析.结果表明,14株代表菌株可归为6个不同的颜色类群,其表型特征与生理生化性质和链霉菌相符合,在系统发育树上处于8个不同的进化分支.菌株HQ0031与已知链霉菌相似性差异较大,可能为链霉菌属内1个潜在新种.研究表明西安市北郊污灌区土壤中抗铅链霉菌具有丰富的多样性,可为重金属污染环境的生物修复提供有益的微生物资源.     

宁夏黄土高原马铃薯连作栽培对土壤可培养细菌遗传多样性的影响

采用平板培养、BOXAIR-PCR和16SrDNA RFLP技术对宁夏黄土高原马铃薯连作栽培土壤可培养细菌遗传多样性进行研究。结果表明,4个连作年限2个生育期8份土样共分离到91株细菌菌株,BOXAIRPCR分析发现,91株细菌菌株的遗传相似系数为0.531~0.939,相同连作年限不同生育期根际土细菌菌群分布不同,不同连作年限同一生育期根际土细菌菌群的分布也不同,随着连作年限增加,可培养细菌遗传多样性呈现下降趋势;结合16SrDNA的序列分析,从91株菌株中筛选出的41个代表菌株可分为23个物种,分属于细菌域的12个属,其中,芽孢杆菌属(Bacillus)占同一连作年限菌株数的53.6%。连作导致土壤细菌菌群结构发生变化,出现各自特有的菌属。系统发育分析表明,23个细菌物种分布于6个系统发育群。     

长白山天池水可培养细菌的16S rRNA鉴定

为了解长白山天池水中细菌的种类及多样性,用NA、1/10NA、R2A、1/10R2A培养基从长白山天池水样品中分离出25株细菌菌株,对其进行16S rRNA基因序列的系统发育分析及形态观察,结果得到9种具有代表性的菌株,9株细菌在系统发育上与芽孢杆菌属(Bacillus sp.)及厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus sp.)关系密切,其中芽孢杆菌属为分离获得的优势菌属.     

藏北高寒草原耐碱放线菌的多样性及其生物活性

【目的】研究藏北高寒草原耐碱放线菌的多样性、产酶潜力及拮抗活性,为开发利用相关资源提供参考。【方法】从藏北高寒草原盐碱地采集22份土样,用平板稀释法从中分离放线菌,进行初步的形态鉴定后得到有代表性的36株耐碱放线菌,对这些代表性菌株的16SrRNA基因序列进行系统发育分析,将这些菌株鉴定到属;采用生长速率法测定分离菌株发酵液对1种细菌和4种农作物真菌的抑菌活性,并对分离株菌进行纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶酶活初筛,分析其拮抗活性。【结果】从22份土样中分离到有代表性的36株耐碱放线菌;16SrRNA基因序列分析表明,这36株菌分布于放线菌门放线菌纲5个亚目5个科的5个属,即链霉菌属(Streptomyces)、糖丝菌属(Saccharothrix)、小单孢菌属(Micromonospora)、原小单孢菌属(Promicromonospora)和韩国生工菌属(Kribbella);分离菌株中25.0%具有纤维素酶活性,8.3%具有淀粉酶活性,16.6%具有蛋白酶活性。所得耐碱放线菌中33.3%的菌株有抑菌活性,其中有5株具有高拮抗活性(抑菌圈直径≥20mm),分别是J10、J14、J21、J48和J65。【结论】藏北高寒草原盐碱地生境蕴藏着丰富的耐碱放线菌资源,这些耐碱放线菌具有高酶和拮抗菌活性。     

西藏青稞根际土壤可培养放线菌的遗传多样性及其促生功能分析

【目的】认识藏区青稞根际土壤中可培养放线菌的遗传多样性及应用价值。【方法】采集藏区青稞根际土壤,对根际样品中的放线菌进行分离,测定分离菌株的溶磷能力、抗病促生(IAA产量)能力,并运用反转录重复因子扩增(BOXA1RPCR)技术、16S r RNA基因测序和系统发育分析系统分析可培养放线菌的系统发育地位。【结果】通过7种培养基共分离得129株放线菌菌株,其中有51株菌株(占总分离菌株的39.5%)产IAA,8株产量较高(>57 mg/L),77株(占总分离菌株的60.0%)表现出溶磷活性。基于BOXA1R-PCR图谱,采用平均连锁聚类法(UPGMA)进行聚类分析,129株菌被分成19种不同的遗传图谱类型。基于分离菌株的菌落特征和遗传聚类图谱选取32株代表菌株进行16S rRNA基因序列测定。通过Mothur软件对分离菌株进行OTUs(operational taxonomic units)聚类分析,共得到5个OTU分类单元,其中以OTU1为主。系统发育显示代表菌株分属于链霉菌属(Streptomyces),拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis),类诺卡氏菌属(Nocardioides),小单孢菌属(Micromonospora),放线菌属(Actinomyces)等5个属,其中链霉菌属(Streptomyces)为优势种属。【结论】西藏青稞根际土中放线菌多样性明显,这些放线菌中蕴藏着大量的有开发应用前景的菌株。     

文山石漠化地区豆科植物根瘤内生细菌多样性分析

[目的]开展石漠化地区豆科植物根瘤内生细菌多样性研究,为豆科植物在石漠化地区生态恢复与重建中的应用提供理论依据.[方法]采用YMA培养基、NA培养基对采集自文山石漠化地区6种豆科植物根瘤的内生细菌进行分离纯化,再对分离获得的内生细菌进行酶切去除冗余、ARDRA分析、16S rDNA序列同源性分析及生物学表型特征分析.[结果]从6种豆科植物根瘤中共分离获得135株根瘤内生细菌,分别隶属于7个属24个种,其中49株为假单胞菌属(6个种)、17株泛菌属(3个种)、25株肠杆菌属(6个种)、17株芽孢杆菌属(5个种)、14株类芽孢杆菌属(1个种)、10株根瘤菌属(2个种)、3株农杆菌属(1个种).生物学表型特征分析显示,SWFU-W032菌株能在盐浓度为5％的培养基中生长;13株内生细可以在pH 12.0的培养基上生长;SWFU-W024、SWFU-W009菌株可以水解淀粉;SWFU-W011、SWFU-W015和SWFU-W020菌株具有抗生素合成能力;除SWFU-W060外的供试菌株均具有产IAA能力;SWFU-W045、SWFU-W046和SWFU-W070菌株具有产蛋白酶能力.[结论]文山石漠化地区豆科植物根瘤内生细菌具有丰富的多样性,其中存在一些具有较高抗性、较强耐受性和多种可促进植物生长的特异菌株,这些菌株可作为石漠化地区土壤改良和生态恢复等的资源应用.     

盐泽地分离的耐盐性芽孢杆菌菌株的分子鉴定

采用生理生化检测、Rep-PCR指纹图谱分析、16S rDNA及gyrB基因序列分析技术,对在青海尕海盐泽地植物根际土壤中分离得到的几株菌落形态较为特殊的芽孢杆菌菌株进行鉴定。生理生化分析结果表明:分离的芽孢杆菌菌株革兰氏染色为阳性。Rep-PCR指纹图谱表明,不同分离菌株间的指纹图谱完全相同,为同种芽孢杆菌。16S rDNA及gyrB基因序列鉴定结果显示,菌株与地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的亲缘关系最近。综合几种鉴定结果,最终将分离自盐泽地的芽孢杆菌菌株鉴定为B.licheniformis。     

广西北仑河口红树林底泥放线菌多样性及其抑制甘蔗鞭黑粉菌活性分析

[目的]分析广西北仑河口红树林底泥放线菌多样性及其次级代谢产物抑制甘蔗鞭黑粉菌活性,为挖掘放线菌新物种及其新型农用杀菌剂打下基础.[方法]选取6种分离培养基,采用稀释涂布法对广西北仑河口红树林底泥样品进行分离培养,ISP2培养基纯化菌株,基于16S rRNA序列分析样品中放线菌多样性,并以牛津杯法对分离得到的菌株进行抑制甘蔗鞭黑粉菌活性测定.[结果]经排重合并和16S rRNA序列比对分析,从广西北仑河口红树林底泥中共分离得到36株放线菌,隶属于6目9科12属,链霉菌属(Streptomyces)为优势菌属,共有5株菌株的16S rRNA序列与标准菌株的相似性低于98.00%,可能为潜在新物种.抑菌活性测定结果表明,36株放线菌中有22株菌对甘蔗鞭黑粉菌有抑制作用,占所分离放线菌总数的61.11%.[结论]广西北仑河口红树林底泥中蕴藏着丰富的海洋放线菌资源,具有开发成新型农用生防杀菌剂的潜力.     

茅尾海无瓣海桑根际土壤细菌多样性及抑菌活性分析

[目的]研究茅尾海无瓣海桑根际土壤细菌多样性及抑菌活性,挖掘更多潜在新物种和高效活性物质,为进一步研究红树植物根际土壤中细菌的次生代谢产物及研发新型高效生物农药提供参考依据.[方法]从广西钦州茅尾海红树林保护区采集无瓣海桑根际土壤,采用6种分离培养基分离可培养细菌;通过16S rRNA基因序列的系统发育学分析其物种多样性,并采用牛津杯法考察根际细菌对甘蔗鞭黑粉菌的抑制活性.[结果]从无瓣海桑根际中分离得到可培养细菌97株,通过16S rRNA序列比对排重后,从中获得57株不同细菌,可归为4门5纲9目15科21属,有1株Cell-vibrio sp.的潜在新种.其中29株细菌能够抑制甘蔗鞭黑粉菌活性,分别有12、14和14株细菌对甘蔗鞭黑粉菌菌丝生长、"+"担孢子增殖和"-"担孢子增殖表现出抑制活性,抑菌圈直径范围为7.54~21.81 mm,其中有9株细菌能够抑制2~3种甘蔗鞭黑粉菌的形态.[结论]广西茅尾海红树林保护区中无瓣海桑根际细菌具有较高的物种多样性,蕴藏着潜在新物种资源,且富含抑菌活性菌株.     

柠条锦鸡儿根瘤菌及其共生固氮基因多样性

为研究西北干旱地区豆科植物柠条锦鸡儿(Caragana korshinskii)根瘤菌的系统发育地位及共生基因多样性,对从甘肃省分离得到的菌株进行16SrRNA PCR-RFLP和序列分析,构建系统发育树,确定其分类地位,并通过分析共生基因nodA和nifH,确定种群共生类型。结果表明:从柠条根瘤内分离到64株菌,共有7个PCR-RFLP 16SrRNA基因型,主要归属于Ensifer(占分离总数43.8%)、Mesorhizobium(31.2%)、Rhizobium(25%),其中,Ensifer为主要类群,约占34.4%。共生基因nodA和nifH与Ensifer和Mesorhizobium模式菌株同源性较高,与16SrRNA基因确定的根瘤菌分类地位相比,发现部分共生基因与16S rRNA基因确定的分类地位不同,揭示了共生基因横向转移现象的发生。     

塔里木盆地一处柽柳林土壤细菌多样性分析

[目的]对塔里木盆地一处柽柳林土壤细菌多样性进行初步探索,为下一步对塔里木盆地其它地区柽柳林土壤微生物多样性分析及极端环境微生物的筛选奠定基础.[方法]采集塔里木盆地一处柽柳林土壤样品,采用纯培养方法进行细菌的分离纯化.提取各菌株基因组DNA,进行16S rRNA扩增、测序及系统进化树的绘制,分析其多样性.[结果]共分离得到21株菌,其中Firmicutes(厚壁菌门)11株,Actinobacteria (放线菌门)7株,Proteobacteria(变形菌门)和Bacteroidetes (拟杆菌门)各1株.革兰氏染色结果表明,3株菌为革兰氏阴性,其余为革兰氏阳性.Blast比对结果表明菌株CL4与标准菌株Pontibacter korlensis (DQ888330,普拉特链霉菌)的同源性为91;,可能为潜在的新种.[结论]塔里木盆地柽柳林土壤中存在较丰富的细菌资源,并可能存在微生物新物种,具有进一步研究开发的价值.     

新疆南部图兰扇头蜱及卵携带R.raoultii的分子检测

【目的】世界上蜱类3科18属899种,中国有2科10属117种,新疆至少有2科10属45种,占全国蜱种类的1/3之多,分布也极其广泛。蜱直接危害和传播多种病原,且一些病原可经卵垂直传播,给畜牧业造成巨大经济损失,还严重威胁公共卫生安全。图兰扇头蜱是新疆南部荒漠及半荒漠地区常见种和优势种。确定新疆南部图兰扇头蜱及其卵是否携带立克次体,对该蜱及其传播立克次体病的防控意义重大。【方法】对新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室在新疆南部阿拉尔市某羊场收集的饱血雌性扇头蜱,置于一定湿度和一定温度的环境中产卵,随机取5个独立的卵样品及其对应的5只雌蜱为研究对象。通过对雌蜱及其卵分别处理后提取基因组DNA,进行PCR扩增蜱12S r RNA基因和立克次体16S r RNA基因,并对扩增产物测序,利用BLAST在线平台和多个分子生物学软件进行序列分析。【结果】5只雌蜱12S r RNA基因PCR扩增全部阳性,测序获得的4段蜱12S r RNA基因序列完全一致;Blast分析与Gen Bank数据库中图兰扇头蜱12S r RNA基因序列相似性高达99%以上,且高相似性前五基因序列均为图兰扇头蜱,其中包括来自新疆绵羊的图兰扇头蜱;本研究蜱12S r RNA基因序列提交Gen Bank数据库获得登录号为MG744514,与来自于Gen Bank数据库图兰扇头蜱、血红扇头蜱、微小牛蜱、边缘革蜱、草原革蜱、长角血蜱、小亚璃眼蜱、亚洲璃眼蜱、残缘璃眼蜱、全沟硬蜱及外围群尘螨的22个12S r RNA基因序列的进化树显示,研究所获得的蜱12S r RNA基因序列与图兰扇头蜱进化关系最近,聚在同一个小分支;确定了该扇头蜱为图兰扇头蜱。5只产卵后的雌蜱和相应蜱所产的全部卵立克次体16S r RNA基因PCR扩增,有1只蜱和其产的卵样品阳性,蜱携带率为20%;雌蜱及其卵立克次体16S r RNA基因测序结果完全一致;Blast分析与Gen Bank数据库中Rickettsia raoultii 16S r RNA基因序列相似性高达99%以上,且高相似性前五基因序列为4个Rickettsia raoultii和1个Rickettsia sp.,其中包括来自新疆2011年的亚洲璃眼蜱和草原革蜱的立克次体;立克次体16S r RNA基因序列提交Gen Bank数据库获得登录号为MG744513,与来自于Gen Bank数据库的37个24种立克次体16S r RNA基因序列的进化树显示,研究获得的立克次体16S r RNA基因序列与Rickettsia raoultii进化关系最近,聚在同一个小分支,与其他15种立克次体同属于斑点热群立克次体;确定了本研究图兰扇头蜱及其卵均携带斑点热群立克次体R.raoultii。【结论】首次发现图兰扇头蜱及其卵携带R.raoultii。     

山苍子（Litsea cubeba）可培养内生细菌的多样性

【目的】研究山苍子可培养内生细菌的多样性。【方法】利用添加植物组织浸提液的营养琼脂培养基分离山苍子根、茎、叶及果实中的可培养内生细菌,采用16S rDNA序列鉴定法对分离获得的山苍子可培养内生细菌进行鉴定。同一组织内,对16S rDNA序列及形态完全一样的菌株合并冗余,用Clustalx对分离得到的菌株16S rDNA进行排序,构建NeighborJoining系统进化树,并计算Jaccard指数和多样性指数。【结果】 共分离得到52株山苍子可培养内生细菌（根23株、茎8株、叶7株、果实14株）,分属于芽孢杆菌属（Bacillus）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、Paenochrobactrum、普罗威登斯菌属（Providencia）、假单胞菌属（Pseudomonas）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）和Lysinibacillus共7个属的16个种,其中芽孢杆菌属细菌40株,与Bacillus tequilensis、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）3个种最接近的内生细菌占分离细菌株数的69.2%;根及果实中的可培养内生细菌数量及种属均最丰富,其多样性指数高于茎、叶;叶与果实可培养内生细菌的Jaccard指数最高,达0.56,其余均较低。【结论】山苍子可培养内生细菌在植株内部的分布既有种属特异性,又有器官相似性。     

植物根际放线菌分离方法初探及根皮苷降解活性分析

【目的】研究不同培养基及不同土样处理方法对植物根际放线菌分离效果的影响,并从中挖掘具有开发潜力的高活性根皮苷降解放线菌株,为苹果连作障碍机制研究及微生物修复提供理论和实践指导。【方法】从吉林、河北、山东、陕西、甘肃、河南、湖北、四川、重庆、上海、江西、安徽、浙江等13个省（市）采集植物根际土样40份,自然风干处理后分别经10 mmol/L的MOPS溶液及CaCO3预处理,用涂布平板法在7种不同的培养基中进行放线菌的分离培养。将分离获得的菌株点种于根皮苷筛选培养基进行活性检测。【结果】在7种培养基B、MSC、MG、MT、Chi、HSG、HV中分别分离获得100、78、108、64、79、113和88株放线菌。土样用MOPS溶液处理后所分离得到的放线菌总数明显高于用CaCO3预处理所得。分离所得630株菌株中有29株对根皮苷有降解活性。对其中41株高活性菌株及形态特殊菌株进行16S rRNA基因测序分析,发现分属于14个不同的放线菌属。【结论】7种分离培养基中HSG培养基的分离效果最好,MG培养基次之,MT培养基最差。土样处理中用MOPS溶液处理的方法优于用CaCO3预处理。根际放线菌株中有一定数量具有降解根皮苷能力的菌株。根际放线菌资源具有丰富的生物多样性。     

新疆棉花根际土壤铁载体产生菌的遗传多样性及系统发育研究

 【目的】了解中国新疆地区铁载体产生菌的遗传多样性和系统发育,为筛选高效铁载体产生菌提供依据。【方法】采用BOXAIR-PCR、16S rRNA PCR-RFLP和16S rDNA全序列分析方法对分离自新疆地区棉花根际土壤的铁载体产生菌的遗传多样性进行分析。【结果】在BOXAIR-PCR分析中,68株供试菌分为11个遗传群;在16S rRNA PCR-RFLP分析中,68株供试菌分10个遗传群;代表菌株的16S rDNA 全序列分析表明,供试菌分属于假单胞菌属（Pseudomonas）、肠杆菌属（Enterobacter）、不动细菌属（Acinetobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）、产碱杆菌属（Alcaligenes）、短状杆菌属（Brachybacterium）和泛菌属（Pantoea）。其中,假单胞菌属（Pseudomonas）为优势属。【结论】分离自新疆地区棉花根际土壤铁载体菌存在极大的遗传多样性。