东南地区猪圆环病毒2型检测及分子流行病学分析

【目的】分析我国东南地区2012－2018年规模化猪场猪圆环病毒2型（PCV2）的流行动态、基因组特性及病毒重组情况,为猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）的防控和疫苗开发提供理论依据。【方法】对2012-2018年采自福建、江西、广东、江苏及浙江等省规模化猪场疑似断奶仔猪多系统衰弱综合症（PMWS）猪只的649份组织样本及血清样本采用PCR方法进行检测,对PCV2进行基因分型,并选取54份阳性样品进行PCV2全基因组同源性比对、系统发育分析和重组分析,同时对ORF2基因进行遗传进化分析和衣壳（Cap）蛋白氨基酸序列比对。【结果】东南地区猪场感染PCV2较普遍,PCV2阳性率为41.9%（272/649）。猪场存在PCV2a、PCV2b、PCV2d和PCV2e 4个基因型毒株,其中以PCV2d流行为主。基于PCV2全长核苷酸序列和ORF2基因的系统进化分析表明,54株PCV2毒株均分为4个基因型; PCV2e毒株检出率较低（仅为0.46%）,其基因组全长1 777 bp,与其他基因型代表毒株的全长核苷酸同源性较低（91.0%~93.0%）。重组分析表明,不同基因型毒株间存在重组现象。Cap蛋白的氨基酸序列分析表明,不同基因型具有特征性的突变位点。【结论】东南地区猪场存在4种基因型PCV2,其中PCV2d为优势基因型,不同基因型毒株间存在重组现象。新基因型PCV2e的检出率较低。     

河南省猪圆环病毒2型感染的病原流行病学研究

采用PCR方法,从来自河南省不同地区的822份猪肺脏等病料组织中共检出514份猪圆环病毒2型(PCV2)阳性样品,总检出率为62.6%。2011年3-12月,PCV2在河南省的检出率介于41.6%～85.3%。其中,9-12月的检出率显著高于3-8月(P<0.05)。在河南省不同地区的猪群中,PCV2的检出率介于44.6%～87.9%;其中,驻马店市、漯河市、信阳市3个地区PCV2的检出率显著高于全省其他地区(P<0.05)。PCR检测过程中还发现,PCV2的检出率与猪群类别(日龄)有一定关系,其检出率随猪年龄的增长而升高(P<0.05)。在211份PCV2阳性样品中,有144份(占69.2%)能分离出不同的共感染菌。最常见的共感染菌是链球菌(52.1%,75/144)、副猪嗜血杆菌(42.4%,61/144)、大肠杆菌(39.6%,57/144)和多杀性巴氏杆菌(20.1%,29/144)。研究表明,PCV2在河南省10多个地区的猪群中广泛存在,且与病原菌的共感染情况非常严重。     

2016—2020年浙江地区猪圆环病毒2型分子流行病学分析

为了解猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)在浙江地区的流行病学特点和遗传变异规律,本研究采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)对2016—2020年采自浙江省不同地区猪场的1 725份疑似猪圆环病毒2型感染的临床病料进行PCV2的病原学检测,同时对部分阳性样品进行全基因组扩增、克隆和测序,并与Gen Bank中收录的16株参考株序列进行比对和遗传进化分析。结果表明：PCV2检测阳性的样品有359份,平均阳性率为20.8%,2016—2020年PCV2阳性率分别为38.1%、23.2%、24.1%、12.5%和10.7%;测序所得PCV2 36个全基因序列的核苷酸同源性为94.0%～99.9%,与国产疫苗株核苷酸同源性为94.7%～98.5%,与参考株核苷酸同源性为92.9%～99.8%;遗传进化分析显示PCV2 36个全基因序列可分为3个基因型,其中11株为PCV2a型,8株为PCV2b型,17株为PCV2d型,PCV2d为优势基因型;ORF2基因全长分别为705 bp(16株)和702 bp(20株),...     

猪圆环病毒3型分子生物学检测方法研究进展

猪圆环病毒3型感染猪后能引起猪厌食、皮炎和肾病综合征、母猪繁殖障碍、仔猪先天性震颤、多系统衰竭综合征等多种疾病,是一种新发的猪传染病,未来可能会给养猪业造成巨大的经济损失。文章综述了6种猪圆环病毒3型分子生物学检测方法,主要包括核酸探针、常规PCR法、套式PCR法、多种PCR、荧光PCR方法、环介导等温扩增技术等。     

检测猪圆环病毒2型的一种PCR方法

参照genbank已发表的猪圆环病毒2型的基因序列，设计l对2型特异的引物，对广东省20个猪场送检的患病断奶仔猪的病料进行PCR扩增，并将PCR产物连接到pMDl8-T载体上，对重组质粒进行PCR、酶切鉴定及测序，最后发现PCR检测均为阳性。     

检测猪圆环病毒2型PCR方法的建立

[目的]为快速诊断猪圆环病毒病提供参考。[方法]根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)的核苷酸序列设计并合成1对特异性引物,建立诊断PCV-2地方分离株的PCR方法。[结果]各物质在PCR反应中最佳浓度分别为:dNTP 220 pmol/ml,Taq酶0.1 U/μl,引物20 pmol/μl。从PCV-2阳性病料中提取DNA,在优化条件下进行PCR扩增,获得预期的494 bp特异性条带。用该PCR方法对PCV-2、PRRSV、HCVS、IV、PPV进行检测,PCV-2为阳性,而PRRSV、HCV、SIV、PPV检测均为阴性,未出现交叉反应,说明该PCR方法对PCV-2具有良好的特异性。该PCR方法可检出1.25 ng模板DNA,具备较高的敏感性。[结论]使用该PCR方法检测PCV-2是切实可行的。     

猪圆环病毒2型和3型双重PCR方法的建立及在藏猪猪圆环病毒检测中的应用

为同时并快速检测和鉴别猪圆环病毒2型(PCV-2)与猪圆环病毒3型(PCV-3),并调查西藏林芝地区猪圆环病毒的感染情况,根据笔者所在实验室PCV-2和PCV-3单重PCR方法,建立检测PCV-2和PCV-2双重PCR的方法,构建标准质粒并经优化反应条件和反应体系后进行特异性和灵敏性的测定,并对西藏林芝周边地区藏猪粪便...     

猪圆环病毒3型PCR诊断方法的建立及初步应用

为屠宰环节PCV3分子流行病学调查诊断提供参考,根据猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)特异性序列设计引物,通过敏感性试验、特异性试验、重复性试验及测序验证,建立的PCR方法能扩增出649bp的目标片段,其具有较好的敏感性,可扩增的最低模板浓度为0.143ng/μL;并用建立的PCR方法对屠宰场送检的376份组织样品进行检测结果表明,PCV3平均阳性率为12.9%。     

猪圆环病毒3型研究进展

2016年,美国堪萨斯州立大学科研人员利用宏基因组测序技术,从患有皮炎肾病综合征(PDNS)和繁殖障碍母猪及其流产胎儿体内首次鉴定出一种新型猪圆环病毒,命名为猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3,PCV3)。流行病学调查发现PCV3感染多见于具有PDNS和繁殖障碍症状猪群,目前已于美国多个州猪群内普遍流行。同时,美国旧金山血液系统研究所科研人员从3头不明病因导致的心脏和多器官炎症仔猪体内也检测出PCV3。随后,我国湖北、广东等多个省市猪群中也检测出PCV3。近来,波兰和韩国相继报道存在PCV3感染猪群。作为一种新发现病原体,PCV3对猪致病性及在猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)中作用以及现有商品化PCV2疫苗对其免疫效力等有待进一步研究。文章综述PCV3最新进展,以期为后续研究提供参考。     

广东省猪圆环病毒2型毒株分离 及全基因序列分析

为了解广东省猪圆环病毒2 型(PCV2）的流行、变异及进化情况,对2013 年广东省多个猪场发生PCV2 感染的病猪血清进行PCV2 病毒分离,参考GanBank 上已发表的PCV2 全基因序列,设计3 对引物,用PCR 方法扩 增其全基因序列,测序并进行序列分析。结果分离到9 株PCV2 毒株,全基因序列长度都为1 767 bp。同源性分析表 明,9 株PCV2 分离株核苷酸同源性为93.6%~99.4%,与2012 年分离株同源性为94.5%~99.7%,与2011 年分离株同 源性为94.2%~99.7%,与GenBank 中其他PCV2 分离株的同源性为93.2%~99.7%。9 株PCV2 的ORF2 核苷酸及其推 导的氨基酸序列同源性分别为89.0%~99.9%和86.4%~100%,存在一定的变异。基因型分析表明,有5 株属于 PCV2d,3 株属于PCV2b,1 株属于PCV2a。对2011要2013 年分离的PCV2 基因组特征进行分析,发现PCV2 核苷酸序 列比较稳定,与世界其他分离株也具有较高的同源性。     

2010-2012年陕西地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查

【目的】调查陕西地区猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)的分子流行病学变化趋势,为进一步预防和治疗猪圆环病毒病提供参考。【方法】于2010-2012年采集陕西西安、咸阳、宝鸡、榆林和延安等地区发病猪群中的141份样品。首先,采用PCR检测样品中PCV2感染情况;然后,通过基因型特异的PCR,检测PCV2阳性样品中PCV2a和PCV2b亚型的感染情况;最后,扩增、克隆和测序PCV2 ORF2基因编码序列,并通过生物信息学软件统计分析所获得基因序列的进化情况。【结果】141份样品中,117份检测为PCV2阳性,阳性率达82.9%,其中的33份病死猪样品中有32份检测为PCV2阳性。基因型特异的PCR检测结果显示,117份PCV2阳性样品中单感染PCV2b的为59份,单感染PCV2a的为11份,另外47份样品为PCV2a和PCV2b混合感染。对32份病死猪PCV2阳性样品的PCV2 ORF2基因序列进行比对分析,结果表明,12份为PCV2b-1A/1B亚型,16份为PCV2b-1C亚型,4份为PCV2a亚型。对各亚型ORF2氨基酸序列的分析结果表明,氨基酸的变异位点主要存在于8-47,59-101,134-169,180-210这4个区域。【结论】陕西地区猪群PCV2感染严重,并且PCV2b-1A/1B和PCV2b-1C亚型是主要流行毒株,氨基酸变异位点主要存在于Cap蛋白潜在表位区。     

陕西省PCV2感染的血清学调查

2004-01~2005-06,从陕西榆林、宝鸡、西安、渭南、汉中、商洛、安康等7个地区的猪场采集不同日龄猪血清样品237份,用间接EL ISA方法进行猪圆环病毒2型(PCV 2)感染的血清抗体检测,并用阻断EL ISA方法对部分血清样品进行了猪伪狂犬病毒(PRV)gE基因蛋白的抗体检测。结果表明,未断奶仔猪PCV 2血清抗体阳性率为0%(0/40),断奶仔猪为28.6%(2/7),肥育猪为43.7%(31/71),种公猪为7.7%(1/13),后备母猪为15.6%(7/45),经产母猪为60.4%(29/48),临床上有多系统衰竭综合征(PMW S)疑似症状的13头断奶仔猪的阳性率为61.5%(8/13),237份血清的总阳性率为32.9%(78/237);PCV 2与PRV混合感染率为21.7%(5/23)。     

猪圆环病毒病的血清学调查及防治措施

猪圆环病毒病是由猪圆环病毒引起的一种新的病毒性传染病.自1974年Tischer首次发现猪圆环病毒以来,随着对该病毒研究的深入,根据其致病性和基因组的差异,将其分为无致病性型PCV-1和有致病性型PCV-2.     

猪圆环病毒3型衣壳蛋白的原核表达和鉴定

[目的]表达出猪圆环病毒3型(PCV3)衣壳蛋白(Cap),为PCV3免疫学检测方法建立基础.[方法]用PCR技术扩增PCV3-Cap基因片段,与pET-32a原核表达载体定向连接,构建重组原核表达质粒.经大肠杆菌表达后,通过SDS-PAGE来检测目的蛋白的大小与存在方式,并用小鼠抗PCV3-Cap抗体进行Western blot检测.[结果]用pET-32a原核表达系统成功表达出重组PCV3-Cap融合蛋白,其多以包涵体形式存在,纯化后的融合蛋白能与小鼠抗PCV3-Cap血清发生特异性结合,显示出良好的免疫反应性.[结论]原核表达出具有良好免疫反应性的PCV3 Cap.     

猪圆环病毒2型的分离与鉴定

以PCR方法,从疑似断奶猪多系统衰竭综合征(PMWS)自然病例的淋巴结和脾脏中扩增出预期长度的猪圆环病毒2型(PCV 2)的DNA片段,测序PCR产物,并对部分序列进行了同源性分析。结果显示,扩增产物与标准毒株的序列同源性均在98%左右,说明扩增产物具有良好的特异性,由此表明分离出的病毒为猪圆环病毒2型。对沪、苏、鲁、浙等地5个猪场进行检测,证实了猪圆环病毒2型的存在。     

猪圆环病毒2 型疫苗研究进展

疫苗免疫接种是防控猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)的主要方式,PCV-2疫苗的研究与开发已成为国内外兽医工作者的关注热点.在国际市场上销售的商品化PCV-2疫苗主要包括亚单位疫苗、嵌合病毒疫苗和灭活疫苗,其中PCV-2灭活疫苗已在我国规模化猪场中广泛使用.综述了近年来国内外各类PCV-2疫苗研究进展及存在的问题,以期为猪圆环病毒病的防制与PCV-2新型疫苗的研发提供参考.     

猪圆环病毒3型微滴式数字PCR检测方法的建立与应用

为建立能灵敏、高效、准确诊断猪圆环病毒3型(PCV3)的检测方法,并运用该方法研究PCV3传播特性及组织嗜性,根据GenBank中PCV3 ORF2基因(MF631813.1)的核苷酸序列,设计合成PCV3的引物和探针,通过退火温度以及引物、探针用量和特异性等优化,建立了PCV3微滴式数字PCR检测方法.试验结果表明建立的猪圆环病毒3型微滴式数字PCR检测方法具有较好高的灵敏性、重复性和特异性,最低能检测到1μl 16.35拷贝的质粒标准品,可用于猪圆环病毒3型的早期诊断.     

2011—2015 年我国南方地区PEDV 分子流行病学调查及S 基因遗传变异分析

应用RT-PCR方法对南方地区五省(广东、广西、福建、四川、江苏)18个猪场7日龄以内发病仔猪的小肠组织和粪便样本进行猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测,对9个猪场进行为期5年的动态监控,并对2011-2015年期间分离的35个PEDV流行株的S基因进行测序,与GenBank中的PEDV参考序列进行比较,并绘制了系统进化树.结果显示,上述地区五省存在Group1和Group 2两种类型毒株.Group1与美国、韩国毒株较为接近,可分为G1-1、G1-2、G1-3和G1-4等4个亚群,Group 2与2004年国内分离毒株较为接近,可分为G2-1、G2-2两个亚群.25个中国南方地区毒株集中于G1-2和G1-3,而另外8株与2004年国内毒株(JS-2004-2)同属G2-2亚群.不同类型的毒株引发的PEDV临床表现及死亡率不同,G2-2亚群的毒株引发的PED相对缓和,死亡率较低且病程较短,而位于G1-2和G1-3亚群(尤其是G1-3)的毒株则引起大规模急性暴发,病程较长,死亡率较高.     

猪圆环病毒2型LAMP检测方法的建立

基于猪圆环病毒2型(porcine circocirus type 2,PCV-2)的ORF2基因建立了一种便捷、灵敏而又特异的可视化环介导等温核酸扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法。该方法通过针对PCV-2 6个位点的4条特异性引物,在Bst DNA聚合酶的作用下对PCV-2靶序列进行等温核酸扩增。经过对LAMP反应体系和反应条件的优化,所建立方法在61℃反应1 h能够成功的检测出PCV-2基因组DNA,且操作简单,不需要PCR仪等复杂仪器,结果可经电泳检测及肉眼观察;敏感性和特异性试验表明,所建立的方法能特异地检测PCV-2并且其敏感度可以达到0.5 pg的DNA分子;所建立LAMP方法的阳性检出率与国标PCR的阳性检出率符合度为100%。该研究为PCV-2的现场快速检测提供更加简便、快捷的方法,可以满足基层检疫的需要。