鸡贫血病毒衣壳蛋白基因的PCR扩增和克隆

通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ）扩增鸡贫血病毒（ＣＡＶ）衣壳蛋白基因（１，４ｋｂ），并将此基因克隆进ＰＵＣ－１８载体中。通过原位杂交、酶切分析、Ｓdisplay statusdisplay status     

传染性支气管炎病毒T株核衣壳蛋白（N）基因的克隆及部分序列分析

人工合成一双对应于ＩＢＶ－Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ株Ｎ基因ＯＲＦ两侧序列的引物,应用ＲＴ－ＰＣＲ方法,获得肾型传染性支气管炎病毒Ａｕｓｔｒａｌｉａ－Ｔ株核衣壳蛋白基因,长度１．２３ｋｂ,利用引物设计中的ＥｃｏＲ Ｉ位点将其克隆至载体ｐＳＫ（＋）中,对该基因进行限制性酶切分析。结果与已报道的相一致。通过Ｎ基因的Ｃ端部分序列分析及与Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ株、Ｍ４１标准株和日本分离株相比较,结果表明该部分的序列有     

病毒外壳蛋白基因在马铃薯基因组中的整合与转录表达

以表达马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲＶ）外壳蛋白（ＣＰ）基因的转基因马铃薯植株为供试材料,在接种病毒后续发感染条件下提取转基因植株ＤＮＡ和ＲＮＡ,用克隆的病毒ＣＰ基因ｃＤＮＡ为探针进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交分析,结果表明,外源ＣＰ基因稳定整合于马铃薯基因组内,并在转录水平上高效表达．     

猪繁殖和呼吸综合征病毒（PRRSV）M和N蛋白基因扩增与克隆

猪繁殖和呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）Ｍ和Ｎ蛋白基因扩增与克隆蔡家利姜平简中友马志勇蔡宝祥（南京农业大学畜禽传染病研究室，南京２１００９５）ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮＡＮＤＣＬＯＮＩＮＧＯＦＭＡＮＤＮＰＲＯＴＥＩＮＧＥＮＥＯＦＰＯＲＣＩＮＥＲＥＰＲＯ...     

芜菁花叶病毒外壳蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

本文报道采用反转录酶—聚合酶链式反应，体外扩增芜菁花叶病毒（ＴｕＭＶ）外壳蛋白基因及其克隆，并在大肠杆菌中获得表达的结果；从抗州市郊区感病的油菜上分离到一株致病力极强的芜菁花叶病毒分离物，提纯后，经５０ｎｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ和０．５％ＳＤＳ处理，苯酚／氯仿和氯仿抽提两次，酒精沉淀，获得了纯化的病毒ＲＮＡ，该ＲＮＡ与ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）＿（１５）退火后，在ＡＭＶ反转录酶的作用下合成了单链ｃＤＮＡ，然后加入用以扩增ＴｕＭＶ－ＣＰ基因的上下游引物，３５个循环后，得到了一条长约０．８５ｋｂ的片段，将该片段克隆到ｐＵＣ１８质粒的ＳａｌⅠ限制性酶切位点，分析了限制性酶切图谱，分析表明该片段含有ＥｃｏＲⅠ和ＸｂａⅠ以及引物设计时带人的ＭｃｏⅠ三个酶切位点，该片段克隆到大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）原核表达载体ｐＫＫ２３３－２质粒的ＮｃｏⅠ和ＨｉｎｄⅡ位点后，经ＩＰＴＧ诱导，以该病毒的抗血清为第一抗体，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测该基因的表达产物，结果表明该基因的表达产物为ＴｕＭＶ－ＣＰ蛋白，因而认为所获得的扩增片段确为芜菁花叶病毒外壳蛋白基因。     

马立克氏病病毒Ⅰ型疫苗毒克隆株pp38基因同源物的扩增和克隆

用 Ｐ Ｃ Ｒ 技术,从马立克氏病病毒（ Ｍ Ｄ Ｖ） Ｃ Ｖ Ｉ９８８／ Ｃ 株感染的鸡胚成纤维细胞（ Ｃ Ｅ Ｆ）基因组 Ｄ Ｎ Ａ 中扩增出含起始密码子的 Ｍ Ｄ Ｖ ｐｐ ３８ 基因同源物编码序列。在以 Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ （ Ｄｉｇ．）标记的 ｐｐ３８ 基因作为探针,在 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ中,该探针能识别该 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增片段。将该 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增片段在 Ｂａｍ ＨⅠ和 ＰｓｔⅠ位点克隆进 ｐ Ｕ Ｃ１８ 质粒载体,酶切分析筛选到含 ｐｐ３８ 基因同源物的重组质粒并进行了全序列分析,证明该重组质粒是 ｐｐ ３８ 基因同源物克隆。     

TMV蚕豆株系CP基因及3‘端非编码区序列分析与表达

根据烟草花叶病毒Ｕ１株系ＴＭＶ－Ｕ１序列，人工合成引物，通过ＰＣＲ扩增并克隆了烟草花叶病毒蚕豆株系（ＴＭＶ－Ｂ）的外壳蛋白（ＣＰ）基因和３＇端非编码区。ＤＮＡ全序列测定结果表明，外壳蛋白基因全长４５９个碱基，编码１５１个氨基酸，３＇端非编码区全长２２４个碱基。与ＴＭＶ－Ｕ１株系相比，ＴＭＶ－Ｂ仅在ＣＰ基因上有一个碱基缺失，并导致ＣＰ基因提前终止，使其编码的氨基酸少７个。将ＣＰ基因及３＇端非编码区插     

鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体的研制与鉴定

用经蔗糖密度梯度离心纯化的鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ，Ｍ４１）作为抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，通过常规淋巴细胞发校瘤技术产生杂交瘤细胞，经ＥＬＩＳＡ筛选，获得了４株能分泌特异性抗ＩＢＶ单克隆抗体的细胞系，分别命名为４ＡＣ、４ＡＦ１、６ＤＨ及２ＤＨ１０。４株单抗的亚类都属于ＩｇＧ２ｂ，在Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ试验中，４ＡＦ１、６ＤＨ６２株单抗牧场卉性地识别ＩＢＶ的核衣壳蛋白（Ｎ）；经ＥＬＩ     

马立克病毒糖蛋白D基因转入感染细胞DNA的研究

用ＥｃｏＲＩ，ＰｓｔＩ内切酶将已分离和克隆的马立克氏病病毒（ＭＤＶ）糖蛋白Ｄ（ｇＤ）基因从重组ｐＭｇＤ１８质粒中切出，克隆进反转录病毒质粒载体（ＲＣＡＳ）的连接质粒载体ｐＵＣＣｌａ１１２Ｎ的相同位点。用Ｃｌａｌ再将ｇＤ重组ｐＵＣＣｌａ１１２Ｎ中的ｇＤ基因切出，用ＣｌａＩ将ＲＣＡＳ载体切开，将ｇＤ基因构建于ＲＣＡＳ的ＣｌａＩ位点。通过原位杂交筛选重组ＲＣＡＳ，并结合酶切分析鉴定出ｇＤ插入方向正确的重组ＲＣＡＳ。用磷酸钙沉淀法将ｇＤ重组ＲＣＡＳ转染鸡胚成纤维细胞。收集转染后第９天的细胞上清，并用其感染原代ＣＥＦ，在感染后第４天和第６天收集ＣＥＦ。提取ＣＥＦ基因组ＤＮＡ，用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（ｄｉｇ）标记ｇＤ基因片段作为探针，通过ｄｏｔｂｌｏｔ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测基因转移情况。结果表明，转染的重组ＲＣＡＳ不仅在细胞内变成有传染性的完整病毒，而且成功地将ｇＤ基因与病毒前ＤＮＡ一起整合在ＣＥＦＤＮＡ中     

马立克氏病病毒（MDV）B抗原基因的克隆及鉴定

将ＭＤＶＧＡ株ＢａｍＨＩ基因文库中含Ｉ３片段的质粒ｐＡＣＹＣ１８４和Ｋ３片段的质粒ｐＨＣ７９扩增，用碱裂解法抽提质粒后，利用相应的限制性内切酶切出目的基因片段，连接到合适的载体上，构建了完整的ＭＤＶＢ抗原基因克隆载体。通过内切酶分析，地高辛（ＤＩＧ）－探针原位杂交，ＤＮＡ序列预测，确认克隆的Ｂ抗原基因正确。     

用PCR、斑点杂交及间接免疫荧光试验诊断鸡传染性贫血的初步研究

利用地高辛标记的０８５ ｋｂ 的鸡传染性贫血病毒 （ Ｃ Ａ Ｖ） 核酸探针, 对江苏某地区疑为 Ｃ Ａ Ｖ 的１５～３０日龄病鸡的肝 Ｄ Ｎ Ａ 样品进行斑点杂交。结果在被检的２０份样品中有６份为阳性,阳性率为３０％ 。对相同样品根据已知引物（特异性扩增出 Ｃ Ａ Ｖ 的０５８ ｋｂ Ｄ Ｎ Ａ） 进行 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增, 所得结果与斑点杂交相同。对应的病鸡血清经间接免疫荧光试验 （ Ｉ Ｆ Ａ）, 有７份为 Ｃ Ａ Ｖ 抗体阳性, 与 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增结果的符合率为８３％ 。初步结果表明, 江苏某地区存在 Ｃ Ａ Ｖ 感染。     

雏鸡感染鸡传染性贫血病病毒分布情况研究

将鸡传染性贫血病毒强毒株C364和弱毒株C545分别接种1日龄鸡传染性贫血病毒抗体阴性的健康雏鸡,于接种后第7天和14天每组抽查3只测定血球压积值,并在接种后第1、3、5、7、10和14天各组分别宰杀3只雏鸡,取胸腺、肝脏和骨髓组织,用竞争性PCR测定其病毒含量.结果表明,雏鸡感染CAV,后表现为血球压积值下降,其中强毒感染鸡较弱毒感染鸡的红细胞压积值下降幅度大;病毒能够在雏鸡胸腺、肝脏和骨髓内繁殖,其中胸腺内病毒增殖最快,病毒滴度最高,肝脏其次,骨髓最低.     

CAV和ALV混合感染病例的诊断

本实验从10羽130日龄发病海兰白蛋鸡中分离组织病料,并进行药敏试验及PCR诊断。根据CAV、ALV已有引物,通过PCR方法检测,结果显示:样本均能扩增出584bp和1260bp的片段,即CAV和ALV均为阳性,确诊为CAV与ALV混合感染。测序结果显示,同源率分别可达97.3%～99.1%和98.3%～99.4%。     

应用PCR对来源于AA肉种鸡的鸡胚、雏鸡进行CAV和ALV检测

应用PCR方法,对来源于山东省3个不同AA肉种鸡场的鸡胚、1日龄雏鸡中的CAV和ALV进行检测,从而了解CAV和ALV在此阶段对肉鸡的感染情况。试验直接采集样品的肝脏、胸腺、骨髓、脾脏、肾脏、法氏囊等组织提取DNA,进行PCR扩增及PCR产物的克隆和序列测定。结果显示,被检的3个肉种鸡场均有这两种病毒的阳性检出,其中CAV的阳性率是20.18%;ALV的阳性率13.49%,二者共感染的阳性率是6.24%。而且感染鸡各组织含量也有所差异,其中CAV以脾脏的最多,ALV以肾脏最多。同时对肝脏进行细菌分离培养时发现存在大肠杆菌、沙门氏菌和霉形体的混合感染。由此可见,在鸡胚和雏鸡体内存在CAV、ALV的感染以及与细菌性疾病的共感染。     

用PCR检测肉种鸡的鸡胚、雏鸡和子代肉鸡CAV和ALV

为了解CAV和ALV在不同阶段对肉鸡的感染情况,应用PCR方法,对山东省某3个中小型AA肉种鸡场的鸡胚、1日龄雏鸡和子代肉鸡中的CAV和ALV进行检测,试验直接采集样品的不同组织提取DNA,进行PCR扩增及PCR产物的克隆和序列测定。结果显示,被检的3个肉种鸡场及商品肉仔鸡均有这两种病毒的感染,其中CAV的阳性率24.22%;ALV的阳性率17.56%,两者共感染的阳性率8.89%。而且感染鸡各组织病毒含量也有差异,CAV以脾脏最多,ALV以肾脏最多。同时对肝脏进行细菌分离培养,并对40日龄子代商品肉鸡进行ND血凝抑制(HI)抗体效价检测,发现大肠杆菌等细菌感染阳性率较高,ND-HI抗体效价显著偏低。由此可见,鸡胚、雏鸡和子代肉鸡体内存在CAV、ALV的感染以及与细菌性疾病的共感染,造成机体免疫力下降。     

肉鸡及其鸡胚中CAV和ALV的PCR检测

应用PCR技术对山东省3个中小型AA肉种鸡场的鸡胚、1日龄雏鸡和子代肉鸡CAV和ALV的感染情况进行了检测。用相同的方法直接采集样品的不同组织提取2种病毒DNA,进行PCR扩增及PCR产物的克隆和序列测定。结果表明:被检的3个肉种鸡场均有这2种病毒的感染,其中CAV的阳性率24.22%,ALV的阳性率17.56%,二者共感染的阳性率8.89%。感染鸡各组织中病毒含量也有差异,CAV以脾脏最多,ALV以肾脏最多。对肝脏进行细菌分离培养,并对40日龄商品肉鸡进行ND血凝抑制(HI)抗体效价检测,发现大肠杆菌等细菌感染阳性率较高,ND-HI抗体效价显著偏低。说明该地区肉种鸡场和商品鸡场均存在严重的CAV和ALV感染以及与细菌性疾病的共感染,并导致鸡只的机体免疫力下降。     

鸡贫血病毒安徽分离株感染性克隆的构建及其感染特性

鸡贫血病毒（chicken anemia virus,CAV）是诱导雏鸡发生免疫抑制的重要病原之一。应用PCR方法从安徽某鸡场送检病鸡肝组织中检测并鉴定CAV,扩增病毒全基因组序列插入pcDNA3.1(+)载体,并引入含Kpn I （GGTACCCAG）酶切位点的9 bp外源性标签,获得顺次连接的双拷贝CAV基因组的重组质粒,通过脂质体介导转染鸡MDCC-MSB1淋巴细胞并拯救出CAV感染性克隆毒株。经动物试验,感染性克隆毒株在接种1日龄健康雏鸡后15 d,对胸腺等免疫器官指数影响较小,胸腺病变不明显,表明其感染能力减弱,为进一步分析CAV致病机制和筛选疫苗候选株奠定基础。     

基于虚拟仪器的粮食水分在线检测系统设计

分析了电容式传感器的工作原理,并在此基础上设计了一种基于专用集成芯片CAV424的粮食水分检测电路。测量时,CAV424将传感器电容变化量转换成电压信号,经AD620放大后送MSP430单片机进行处理并将结果通过串口送上位机。上位机软件采用Lab-VIEW编程,可实现检测结果的图形化显示、数据库存储和报表打印等。整个系统具有电路简单、检测精度高、稳定可靠等优点。     

整体荧光原位杂交用于检测水稻特异DNA程序的研究

文章报道了整体荧光原位杂交应用于检测水稻特异ＤＮＡ的实验程序。利用该实验方法,以经地高辛（ＤＩＧ）标记的ｒＤＮＡ作为探针,成功地在水稻根尖和花药内部组织检测与探针互补的片段。对于实验方法,结果表明,整体荧光原位杂交的成功与否受到多种因素的影响,包括组织的种类、固定剂的种类以及固定后的处理方法（主要是酶解与否）等。检测根尖ＤＮＡ可以采用φ（福尔马林）＝１％固定加上酶解;检测花药（花粉发育处于单核期）     

鸡贫血因子病的免疫病理学变化

 用鸡贫血病毒（CAV）感染1日龄健康AA雏鸡，以未感染同龄雏鸡为对照，在感染后7、14、21、28、35、42和49d检测其免疫器官与体重比值，胸腺、脾脏T细胞白细胞介素2（IL-2）和干扰素（IFN）诱生活性，胸腺、法氏囊、脾脏T、B细胞增殖反应，胸腺、法氏囊、脾脏、盲肠扁桃体及哈德尔腺中α-萘酚酯酶阳性[ANAE#+（+）]T细胞、IgG、IgM、IgA抗体生成细胞数量，外周血液中T、B细胞数量，血清、泪液、气管液、肠液、胆汁中IgG、IgM、IgA含量的动态变化。揭示了感染鸡细胞因子IL-2、IFN的免疫调节发生障碍、中枢与外周免疫器官的细胞免疫和体液免疫功能呈现抑制，呼吸道与消化道的局部免疫防御功能降低。