猪EST序列的微卫星标记定位

通过对 Gen Bank中猪的表达序列标签数据库进行序列扫瞄 ,结果检测到大约 10 0个包含一个微卫星重复或简单重复 (SSR)的序列文件。这些重复单元多数是二核苷酸(CA/GT)重复 ;而且检测到 3～ 6个核苷酸的重复序列。通过 6个二核苷酸和 14个中度串联重复序列的初步分析 ,仅二核苷酸重复序列标记产生丰富的标记信息。 (二核苷酸为10 0 % ,中度串联重复序列为 14 % )。另外对 5 0个二核苷酸和 1个三核苷酸 SSRs设计了几对引物 ,结果在 MARC的参考家系中 ,发现 4 2个标记具有多态性 ,17个标记不具有多态信息 ,12对引物没有扩增产物。通过二核苷酸和 3～ 6个核苷酸重复单元的比较 ,二核苷酸标记 72 %能够反映标记信息 ,而其它重复单元仅有 7%。不同的是 ,在 3～ 6个碱基重复单元中 ,非多态标记占较高的比率 (6 4 % ) ,而 2个碱基重复单元仅 14 %。这或许是因为在猪基因组 DNA中 ,中度重复单元的多态性较少 ;或是由于我们选择 17个以上连续重复碱基长度的标准太低。本研究将定位的微卫星标记加入猪的遗传图谱上 ,并为人和猪的基因组之间提供了有用的联系     

EST规模测序在家蚕功能基因组中的应用

EST(Expressed Sequence Tag)指的是一组cDNA的部分序列，一般长度为300-500bp，是由大规模随机取出的cDNA克隆一次测序得到的组织或细胞基因组的表达序列标签。一个EST代表生物某一时期的某种组织或细胞的一个表达基因。对整个基因组表达基因的功能及调控研究就称为功能基因组研究。     

牛乳腺EST分析和牛基因索引功能的注释

乳腺功能基因组学研究需要收集一些合适的cDNA序列来对各种亚细胞不同发育和运作阶段的基因表达形式进行评估。为了更好的捕捉基因表达的范围，我们用混合的牛乳腺细胞建立了1个标准化的cDNA文库，产生了23202个EST，存放的基因库中。这些在牛基因索引中带有序列的EST集形成当前23883个试验性分析序列中的5751个。5751个中的87％仅含有1－3个乳腺来源EST。相反，18％的乳腺EST有12个基因与TC序列相似，这些结果说明标准化文库仅有部分作用，因为EST中，能在泌乳过程中大量转录的基因的减少可能是由于合并引起的。为了更好的评价乳腺文库中的新内容，并把它们增加到现存的注释中（包括牛序列元件、基因一致性序列和人类基因组序列），我们对人和鼠基因诱变和在TOGA的基因非线性化进行测试，并把其结果增加到现有BtGI注释中。35000多个牛元件明显超过了人类基因组序列，而且一些与人类表达序列相关的排列（3％）的位置是独立的。由于3445TC序列与任何数据无明显相似性，代表这些元件中的23种乳腺源cDNA克隆被进一步进行分析用于表达和新异。其只驻有一个克隆符合标准，这相相应基因是一个分化的异端或表达对牛来说是特异的。结果说明，用作标志哺乳动物的转座轴和鉴定这些基因的牛序列表达数据仅针对反刍动物。     

牛BMP4基因部分cDNA的克隆和序列分析

参考人和老鼠BMP4基因序列信息,选取保守基因序列设计上下游引物,扩增牛的BMP4基因部分cDNA序列。将该片段重组到栽体中,筛选阳性克隆,提取质粒DNA,并进行序列测定,首次获得了牛BMP4基因的部分外显子序列。序列分析比较发现,牛与羊、人、小鼠、大鼠等动物的BMP4基因序列同源性分别为99％、93％、93％、91％。该研究结果反映了BMP4基因在进化过程中是高度保守的。     

牛病毒性腹泻病毒基因Ⅱ型HLJ-10分离株全基因组克隆及其序列特征分析

为研究牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的分子特征,本研究参考GenBank中登录的BVDV基因Ⅱ型病毒株全基因组序列,设计多对引物,通过RT-PCR方法,对一株分离自某商品化血清中的BVDV分离株HLJ-10全基因组进行分段克隆及序列测定,获得了该分离株的全基因组序列。生物信息学分析表明,该分离株为BVDV基因Ⅱ型,全长12 284 nt,编码区为11 694 nt,共编码3 897个氨基酸,5’和3’非编码区分别为385 nt和205 nt。与其它BVDV参考株序列比对分析表明,HLJ-10与SH-28和KZ91CP进化关系较密切,预测该分离株含有22个潜在糖基化位点,氨基酸差异性分析表明E2蛋白的氨基酸序列在瘟病毒属中变异性较大。     

鸡类KISS-1基因克隆及EST序列表达验证分析

性成熟启动是一个复杂的生理过程,受"下丘脑-垂体-性腺"轴控制。决定性成熟启动的关键性事件是下丘脑促性腺激素释放激素(GnRH)脉冲式释放增加,KISS-1基因编码产物Kisspeptin通过其受体GPR54能够直接刺激GnRH释放,进而启动性成熟进程,KISS-1/GPR54系统被认为是性成熟启动的关键看门基因。禽类的KISS-1基因在GenBank中尚未被清晰注释。本文以文昌鸡为素材,采用比较基因组学方法分析了不同物种KISS-1及其上、下游基因在染色体上的分布,确定了鸡chr26:1522493-1532710区域为候选片段,通过PCR扩增和克隆测序获得了该候选片段完整序列(命名为类KISS-1序列);同时,采用BLAST程序搜索出9个同源性在50%~85%的EST序列,通过拼接得到3个延伸EST序列。表达验证分析表明,3个延伸EST序列在文昌鸡下丘脑组织cDNA文库中均有表达。     

江西省急性腹泻牛源的BHoV JX株全基因组序列测定及其分析

为了掌握牛香港病毒(Bovine Hokovirus,BHoV)江西株(JX)的全基因组序列特征,本研究以江西宜春某牛场急性腹泻BHoV阳性粪便为材料,通过比对GenBank中已登录的8株Bovine Hokovirus全基因组序列,利用Primer Premier 5.0设计了首尾重叠的5对特异性引物,对BHoV-J...     

牛分枝杆菌Ag85A基因的克隆及序列分析

以牛分枝杆菌Valleelll染色体DNA为模板，以Ag85A成熟蛋白基因特异性引物进行PCR扩增，获得了900bp的DNA片段。通过T-A克隆技术，将PCR产物克隆至pGEM-T载体。经鉴定，成功地构建出了克隆载体pGEM-T-85A。     

牛CD14结构基因的PCR扩增及序列分析

在用牛肺巨噬细胞构建了ｃＤＮＡ基因文库的基础上,参照人和小白鼠ＣＤ１４的基因序列设计一对引物,用ＰＣＲ方法成功地扩增出编码牛ＣＤ１４的特异性ＤＮＡ片段,并进行了序列分析。结果表明,牛ＣＤ１４基因的核苷酸在相同区域内与人ＣＤ１４的同源性为７９％,推导氨基酸序列的同源性为７３％,而与小白鼠的核苷酸和氨基酸的同源性分别为７５％和７１％。     

牛冠状病毒河北流行株部分基因全序列测定及分子特征分析

牛冠状病毒（BCoV）是引起新生犊牛腹泻的重要病原之一,在世界范围内广泛分布,严重影响养牛业的健康发展。为确定河北省BCoV流行毒株的基因遗传进化特征,本研究对从河北省某牛场腹泻犊牛的粪便和肠内容物中鉴定出的1株BCoV流行毒株（BCoV/CH/HB-BD/2019）,进行了S、N、HE基因的全序列扩增及测定,并与GenBank中的51株牛冠状病毒参考株进行了各基因的同源性和遗传进化分析。结果显示：BCoV/CH/HB-BD/2019与BCoV参考株相比,S基因具有2个独特的氨基酸变异位点（N311S、D1276Y）;在HE基因中HB-BD株出现2个独特的氨基酸变异位点,分别为G400V、D423H;虽然在基因的重组分析中,HB-BD株HE基因序列并没有检测到基因重组信号,但通过检测我们发现,HB-BD株HE基因序列为其新疆毒株（KU886219.1）推测的主要亲本毒株;进化分析发现,BCoV HB-BD株与人冠状病毒（HCoV-OC43）均属于β类冠状病毒属2a亚群,且同源性高达96.0%,而正在全世界范围内传播的SARS-CoV-2属于β类冠状病毒属2b亚群病毒,BCoV与SARS...     

基因组预测的序列数据在家畜育种中的应用

全基因组序列数据的使用在家畜育种计划中具有巨大的潜力,可以提高发现变异基因的能力,同时能更准确和更持久地预测育种值而不是标记阵列。要了解家畜基因组序列数据的全部潜力,需要从大量的个体,甚至要从数百万个个体上获得基因组序列和表型数据,从而准确地估测构成数量性状基础的大量致病变异的影响。     

分子标记在牛育种中的应用

牛在畜牧业中占有重要地位,对牛的育种改良一直是科研人员工作的重点。随着分子遗传学和分子生物技术的发展,大量DNA水平上的分子遗传标记及其检测技术的出现,为牛育种高效而精确地选择目标基因型开辟了新道路,也使传统的育种工作跨上了新台阶。根据遗传标记进行选种可识别具有优良基因的种牛,从而提高选择强度,缩短世代间隔,获得最大的遗传进展。     

牛Nramp 1基因5'调控区序列的克隆及序列分析

采用LA-PCR技术扩增牛Nrampl基因2 515 bp的5'调控区序列,构建了重组克隆载体pEASY-T3-Nrampl,对阳性克隆进行了PCR扩增、限制性酶切鉴定,DNA测序及生物信息学分析.结果表明,试验成功构建了包含Nrampl基因5'调控区的重组质粒.经同源性比对发现,Nrampl基因5'调控区在不同物种中具有一定的保守性,在转录起始位点近端的启动子区域,牛与人、鼠、猪、羊的同源性分别是60.50%.58.52%,72.18%,81.95%.经预测,该调控区富含GR、SP1、c-Ets-1、NF-W2等转录因子结合位点.本研究为进一步确定牛Nrampl基因核心启动子区域及该基因的表达调控奠定了理论基础.     

布莱凯特牛心脏脂肪酸结合蛋白基因的序列测定及分析

根据GenBank发表的牦牛心脏脂肪酸结合蛋白(heart fatty acid-binding protein,H-FABP)基因的序列设计13对引物,分13段扩增出布莱凯特牛H-FABP基因,采用PCR产物直接测序的方式对各个片段进行测序,使用生物信息学软件对各个片段的测序结果进行拼接,得到布莱凯特牛H-FABP基因的全序列,并对其进行序列分析。结果表明,布莱凯特牛的H-FABP基因(GenBank登录号:FJ756345)是由4个外显子(73、173、102和54 bp)和3个内含子(3463、1892和1494 bp)组成;布莱凯特牛与牦牛、普通牛、山羊、猪、马、人、大鼠、小鼠和鸡等9个物种之间的核苷酸同源性大小依次为99.3%、99.0%、96.3%、92.5%、89.8%、88.3%、83.3%、82.8%、75.6%,其氨基酸的同源性为99.2%、99.2%、96.2%、93.2%、91.7%、88.7%、86.5%、86.5%、77.4%;系统发生树将这些物种总体上分成2支,鸡为独立的一支,布莱凯特牛、牦牛、普通牛、山羊、猪、马、人、大鼠、小鼠为另一独立的大分支。因此,渤海黑牛H-FABP基因具有很强的保守性,其进化树符合物种进化规律。     

促卵泡生成素受体基因的SNP对牛双胎性状的标记研究

以秦川牛和荷斯坦奶牛的双胎母牛和单胎母牛为实验材料，以牛的FSHR基因的第10个外显子作为标记牛双胎性状的候选基因，用SNP法进行了多态检测。结果发现，在秦川牛的双胎母牛中突变率为60％（6／10），而在单胎母牛中突变率为20％（2／10）；在荷斯坦奶牛中，双胎母牛突变率为31.25％（5／16），单胎母牛突变率为6.67％（1／15）；由此可见双胎牛和单胎牛二者之间FSHR基因的第10个外显子的突变率差异明显。这表明选择FSHR基因的10个外显子有可能作为双胎性状的候选基因。经序列分析发现在FSHR基因的第1506个碱基发生了突变（T→C），但氨基酸没有发生变化。     

牛Nramp1基因5′调控区序列的克隆及序列分析

采用LA—PCR技术扩增牛Nramp1基因2515bp的5′调控区序列,构建了重组克隆载体pEASY—T3-Nramp1,对阳性克隆进行了PCR扩增、限制性酶切鉴定、DNA测序及生物信息学分析。结果表明,试验成功构建了包含Nramp1基因5′调控区的重组质粒。经同源性比对发现,Nramp1基因5′调控区在不同物种中具有一定的保守性,在转录起始位点近端的启动子区域,牛与人、鼠、猪、羊的同源性分别是60．50％,58．52％,72．18％,81．95％。经预测．该调控区富含GR、SP1、c—Ets-1、NF—W2等转录因子结合住点。本研究为进一步确定牛Nramp1基因核心启动子区域及该基因的表达调控奠定了理论基础。     

利用聚合酶链反应技术新发现的牛雄性特异性DNA片段

我们依据牛Y染色体特异性DNA探针ES8的第1—20bp和541—560bp的碱基顺序,合成一对引物,用PCR方法扩增公牛和母牛染色体DNA,在扩增公牛DNA时发现四种前所未知的DNA片段,即使扩增的雄性DNA量为10~(-6)μg时,也可得到这些片段。用双脱氧末端终止法分析这些DNA片段的碱基顺序时,发现没有一个片段能与ES8完全配对,而只能与ES8部分配对。四个片段与ESg序列的一致率分别为:92bp片段(I0—1)为65％;142bp片段(I0—2)为51%;170bp片段(I0—3)为57％;224bp片段(I0—4)为84％。与公牛和母牛DNA杂交结果证明这些片段的雄性特异性,结果表明,本研究得到的这四种DNA片段可用作牛雄性特异性DNA片段。