鉴别牛早期胚胎性别PCR方法引物的设计与筛选

根据牛Y-染色体特异重复序列、睾丸特异蛋白基因以及性别决定基因序列设计合成5对公牛Y-染色体特异引物，依据牛骨胳肌α肌动蛋白前体基因和微卫星DNA序列设计合成4对牛DNA特异引物(内标引物)。单重PcR扩增牛基因组DNA，筛选出4对牛Y-染色体特异引物和1对牛DNA特异内标引物。将不同的Y-染色体特异引物与内标引物组合，多重PCR扩增牛基因组DNA、已知性别的牛成纤维细胞和克隆胚胎，筛选出2个可用于牛早期胚胎性别鉴别的PCR引物组合：B34／A12和B78／A12。     

牛X染色体的辐射杂交图（BTAX）

本研究构建了一个详尽的牛X染色体辐射图谱，其含有微卫星和表达基因在内的20个新标记。以5000rad处理90个杂交细胞系，构建了全基因组辐射杂交板。各个标记的保留频率范围从XIST基因的7％～8％到TGLA325基因的31．1％。在6．0 LOD分数标准下把所有位点定位在5个连锁群中，从X染色体标记分析连锁图可以看出连锁群包含重复的微卫星位点，因此，这些连锁群可以被相应定位。这张RH图和牛细胞遗传图的标记序列是一致的。因此，牛与人的比较图谱包括5个区段的基因，而且其序列是保守的(虽然其反向在带有长短臂的染色体模式图中不同)，3个区段的颠倒解释了2个X染色体全 部基因顺序的差异。     

秦川牛CDH11基因外显子多态性分析

牛CDH11基因位于第18号染色体,含有丰富的SNP突变。本实验以247头秦川牛为样本,研究位于第2外显子的一个SNP(g.32935629CT)分布情况。根据NCBI给出的序列信息(NC_007316.6),设计引物,采用混合池DNA进行PCR扩增,并对PCR产物进行酶切,酶切结果进行分型。结果表明,该突变位点存在3种基因型,即TT、CC、TC。其中纯合子突变的基因型频率很低。研究发现中国秦川牛CDH11基因g.32935629CT位点是低度多态(PIC0.25),χ2检验显示,所检测的秦川牛品种处于哈代-温伯格平衡状态(P0.05)。该实验结果可以为肉牛选育开发生长发育分子标记提供基础数据。     

牛早期胚胎的性别鉴定PCR技术的研究

根据牛SRY(Y-染色体性别决定基因)基因序列自行设计合成3对常规PCR引物作为牛性别鉴定特异性引物,对15头公牛、20头母牛的样品进行检测.结果表明,第2对引物可清晰扩增出公牛基因组DNA750 bp左右条带,而母牛基因组DNA无此扩增条带,证明这条引物可以应用于牛的早期胚胎性别鉴定研究与应用.     

高密度SNP芯片及其对肉牛育种影响的研究进展

近年来先进的测序和基因分型技术促进了肉牛育种方法的革新。从过去低通量、耗时的限制性片段多态标记(RFLP)到如今高通量、高密度的单核苷酸多态性(SNP)标记,基因检测效率大幅提高。随着肉牛基因组序列图谱及SNP图谱的完成,基于高密度SNP标记的牛全基因组选择成了牛育种的新热点。作者立足高密度SNP芯片对肉牛育种的影响,综述高密度SNP芯片及和下一代测定技术及肉牛全基因组选择的研究进展,阐明高密度SNP芯片对多品种全基因组选择的模型的建立及准确的预测基因组育种值极其重要。     

应用AML基因进行牛性别鉴定的研究

本文以染色体牙釉蛋白基因(AML)对牛肌肉基因组进行性别鉴定，为应用此基因进行胚胎鉴定提供理论依据。本研究应用奶牛染色体牙釉蛋白基因的DNA序列，设计了牛染色体特异性引物P1和P2，并通过聚合酶链反应(PCR)扩增牛肌肉组织中的X和Y染色体上的牙釉蛋白基因内第五内含子。最后依据其分子量的差异对电泳后的性染色体所呈现的不同区带进行区分，从而达到性别鉴定的目的，具有很高的应用价值。     

牛基因组研究进展

本文分牛基因组遗传图谱、物理图谱、全基因组序列图与转录组研究四个部分介绍了牛基因组学研究进展.最新的牛遗传连锁图谱由4 585个标记组成,平均图距精确到1.2 cM,是研究牛数量性状位点、定位克隆生产性状相关基因进行分子辅助育种的蓝图.基于限制性酶切指纹图与末端测序技术对294 651个BAC克隆分析拼接成的物理图谱,覆盖约15.8倍基因组,为牛全基因组测序和组装提供了框架.融合了全基因组鸟枪法和逐步克隆法绘制的牛基因组草图,包含了26 052 388个可用测序读长,覆盖约7.0倍基因组,拼接成2.87 Gb的基因组序列.牛各个组织器官的cDNA文库构建和EST测序以及基因芯片方面的基因转录和表达的研究,将阐释更多的泌乳、繁殖、产肉和疾病抵御力等重要性状相关功能基因,从而将更多的基因应用到牛的分子辅助育种上.     

家蚕scaffold中新微卫星标记的获得与Dll基因的遗传连锁分析

在进行家蚕遗传连锁图谱的整合过程中,需要寻找两个作图群体中都有多态的共有标记,但这种共有标记数量较少。为此,利用已有的简单重复序列(SSR)与家蚕基因组进行比对,寻找到匹配的scaffold,再采用SS-RHunter1.3搜索其中的SSR区域,排除掉原有SSR序列,选择重复次数在6～23之间的微卫星区域设计引物,用BC1群体的亲本及F1进行多态性的筛选,选择有多态性的标记用7019×(F50B×7019)BC1群体进行基因型分析。结果显示:根据原家蚕第2连锁群上SSR位点新设计的邻近的7对引物中,有6对引物在BC1群体的亲本中有多态性,选择其中2个进行遗传连锁分析,作图结果与原有相应SSR标记的作图结果基本保持一致,其中根据S0207所在scaffold上开发的NS02071和NS02072之间的图距达到6.9 cM;根据家蚕大造和C108的回交一代初步定位的D ll基因的位置与后来在其所在scaffold上所设计的临近引物D ll1和D ll2的定位一致,且这两个标记在遗传连锁图上的图距为0.0 cM,表明这两个标记在遗传图上的位置重叠。由此,在较短的DNA区域内(在遗传连锁图上表现1个位点)便有多个SSR标记可供使用,将为定位家蚕重要经济性状基因、分子辅助育种及功能基因研究等提供更多有价值的信息。     

牛遗传图谱的研究进展

20世纪90年代以来,牛遗传图谱发展非常迅速。到目前为止,已经公布了几个版本的遗传图谱。在图谱上DNA标记不断增加,标记间隔越来越小,但是目前图谱还是存在着标记密度不均匀等问题。随着牛基因组计划的完成,基因组学和QTL定位的发展,尤其是表达序列标签（EST）在图谱构建中的应用,牛的遗传图谱将更加完善,为重要经济性状的基因定位和基因克隆奠定了基础。     

牙釉质基因巢式扩增鉴定牛早期胚胎性别的研究

根据牙釉质基因在牛X染色体和Y染色体上存在的差异设计巢式引物,对牛静脉血基因组DNA样本以及10枚牛早期胚胎DNA样本进行巢式扩增和电泳分析,以鉴定性别。结果表明:利用此方法能够对牛10 pg量血液基因组DNA进行扩增鉴定性别,雌性产生1条片段长度为311 bp的源于X染色体的条带,雄性产生1条源于X染色体的条带(311 bp)和1条片段长度为251 bp的源于Y染色体的条带,对10枚胚胎进行鉴定,6枚为雄性,4枚为雌性。说明牙釉质基因巢式PCR扩增鉴定牛早期胚胎性别方法可靠,准确性和敏感性较高。     

牛FABGL基因的分离与染色体RH定位

以中国西门塔尔牛血样为材料,提取基因DNA,运用同源序列克隆技术对牛FABGL基因DNA序列进行了克隆与分析,应用SUNbRH7000型辐射杂种板（RH）对分离的牛FABGL基因进行了染色体定位。结果显示,本研究所获得的长为1 925 bp的DNA序列为牛FABGL基因的包含全部9个外显子的基因组序列。该序列与人（NM-014234）和猪（AF-146398）的FABGL基因序列的相似性分别为84%和90%;牛FABGL基因被定位于牛的23号染色体上,与该染色体上的标记BM47的距离为1.71 cR,两点评分值为31.05。     

牛γ-干扰素基因的克隆及序列分析

根据GenBank中已公布的牛γ-干扰素(BovIFN-γ)基因序列设计引物,应用一步法逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,以从牛外周血淋巴细胞提取的总RNA为模板,扩增出γ-干扰素成熟肽基因片断,并对其进行了克隆、测序及序列分析.结果表明,试验所设计引物可以成功用于扩增牛γ-干扰素成熟肽基因片段,所扩增序列与GenBank中已有序列同源性达99.77%.     

2个印记的基因间lncRNAs位于牛Dlk1-Dio3印记区域

旨在鉴别牛Dlk1-Dio3印记区域内的新印记lncRNAs。本研究选取位于Meg8与Meg9基因间的2组表达序列标签(EST),通过RT-PCR克隆序列并进行分析,结果发现其具有lncRNA的特征,命名为Linc24062和Linc24063。分析Linc24062和Linc24063在牛8个组织(心、肝、脾、肺、肾、骨骼肌、皮下脂肪和大脑)中的表达,发现2个lncRNAs在被检测的组织中均表达。利用基于单核苷酸多态性(SNP)位点的直接测序法,通过比较杂合子牛中SNP位点处基因组PCR扩增产物与RT-PCR扩增产物的测序峰图分析Linc24062和Linc24063的印记状态,发现Linc24062和Linc24063在牛被检测组织中均为单等位基因表达,说明Linc24062和Linc24063在牛中是印记的。     

不同物种Y染色体特异基因产物的研究

根据牛Y染色体3个特异基因设计3对引物，分别对牛、牦牛、绵羊、山羊、猪、小鼠基因组进行PCR扩增。3对引物在牛和牦牛基因组中都得到了扩增产物，在绵羊的扩增中只检测到了1个性别决定基因的扩增产物，在其他物种中均没有检测到扩增产物。将其扩增产物进行克隆测序，并采用DNAMAN软件对测定序列进行比对分析，结果表明：3对引物的扩增结果在牦牛和牛的同源性分别达到了99％以上，性别决定基因的扩增产物在绵羊和牛间的同源性达到了94％。     

高丹草SSR引物设计及分子遗传框架图谱构建

利用高粱EST序列和BAC克隆,以Primer 5.0程序设计了10对高丹草SSR引物,结果发现有3对引物在皖草2号高丹草的亲本间表现多态性,其中2对来自BAC的引物可用于遗传连锁图谱构建.除以上10对SSR引物外,再选取已公布的245对高粱SSR引物,以180个皖草2号(TX623A×S722)的F2代单株作为构图群体,构建了一个包括4个连锁群、33个SSR标记的高丹草遗传图谱,图谱覆盖基因组长度458.5cM,平均图距13.8cM.     

牛乳头瘤病毒基因1型贵州GZLZ流行株全基因组序列测定及分析

为了解牛乳头瘤病毒(BPV)GZLZ流行株全基因组序列、结构特征及遗传变异情况,本研究首先提取贵州六枝患病牛皮肤肿瘤样品DNA,以BPV L1基因的简并引物对其进行PCR扩增,测序并构建BPVL1基因进化树确定其为BPV1基因型。根据GenBank中BPV1参考株设计7对特异性引物,经扩增、测序、拼接后获得BPV流行株全基因组序列。序列分析显示,贵州六枝GZLZ流行株基因组全长为7 946 bp,具有BPV1基因型的结构特征。本研究为贵州地区的牛乳头状瘤的病原鉴定、流行规律以及科学的防控提供依据。     

牛γ干扰素基因的表达及其多克隆抗体的制备

为了获得牛γ干扰素表达产物及其多克隆抗体,利用分子生物学软件分析GenBank公布的牛γ干扰素的氨基酸序列,针对这一基因序列设计了一对特异性引物,并从牛脾脏淋巴细胞提取基因组总RNA,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增出IFN-γ基因,与pMD18-T载体连接后进行酶切、PCR扩增以及序列测定和分析,并将...     

信阳水牛GHRH基因第二外显子的SNPs检测

[目的]检测信阳水牛群体GHRH基因的SNP多态性。[方法]以56头信阳水牛为材料,采集血样,提取基因组DNA,以GenBank公布的牛GHRH基因(gi:194719389)序列作为参照序列,设计PCR引物,采用PCR-SSCP和DNA测序方法对该基因第二外显子的进行突变检测。[结果]经SSCP分析发现,这些个体总共出现六种不同的带型。测序结果表明:位于GHRH基因的4 461bp、4 529bp、4 845bp、5 053bp和5 058bp处分别存在C→T、T→G、G→A、G→A和G→T五个单核苷酸突变。[结论]表明该基因在信阳水牛群体中单核苷酸多态较为丰富。     

布莱凯特黑牛心脏脂肪酸结合蛋白基因单核苷酸多态性的研究

利用PCR-SSCP方法测定96头布莱凯特黑牛H-FABP基因外显子2和内含子2的部分序列多态性,并对含有多态序列的片段进行了序列分析。结果表明,引物1、3的扩增序列不存在多态性,引物2、4的扩增序列存在多态性;引物2在内含子第323位点处存在G→A突变,在群体中产生了AA、AB、BB 3种基因型,基因型频率分别为0.448、0.146、0.406,多态信息含量(PIC)为0.375,属于中度多态(0.25χ²检验该位点基因型频率不处于Hardy-Weinberg平衡状态;引物4在内含子2第872位点处存在C→G的突变,产生了HH、Hh、hh3种基因型,基因型频率分别为0.104、0.417、0.479,多态信息含量(PIC)为0.337,为中度多态(0.25χ²检验该位点基因型频率达到Hardy-Weinberg平衡状态。     

南阳牛生长性状相关基因组区域全基因组关联分析

本研究旨在筛选和鉴定与南阳牛生长性状相关的基因组区域和候选基因,从而更好地了解牛生长性状的遗传机制。试验共采集71头南阳牛母牛血样并提取基因组DNA,利用SLAF-seq(specific-locus amplified fragment sequencing)技术获得全基因组SNP标记并对试验个体基因型进行分型。对每头个体初生重及不同月龄(6、12、18、24、36)的体重、体高、体斜长、胸围和坐骨端宽及每6个月体增重等生长性状进行全基因组关联分析;获得显著相关的基因组区域后,对其中基因进行功能注释以筛选候选基因。结果显示,共获得141 755个筛选后的SNPs,通过全基因组关联分析鉴定出5个分别与12月龄体重(8号染色体:17 320 634～17 347 720 bp)、12月龄胸围(2号染色体:15 063 190～15 155 309 bp)、24月龄体斜长(11号染色体:60 727 342～81 425 987 bp)、36月龄坐骨端宽(14号染色体:15 635 762～15 643 272 bp)和12～18月龄体增重(26号染色体:40 456 192～40 456 477 bp)等生长性状显著相关的基因组区域(LOD≥6.35)。通过对5个基因组区域内的186个基因进行功能注释,共筛选得到11号染色体上的8个基因(BMP10、IFT172、SDC1、TCF23、TRIM54、RAB1A、VPS54和GDF7)与骨生长、肌肉发育和生长调控有关,建议其可优先作为牛生长性状相关候选基因进行进一步验证。