玉米褪绿斑驳病毒实时荧光RT-PCR检测方法研究

玉米褪绿斑驳病毒(Maize chlorotic mottle virus,MCMV)是我国对外公布的检疫性有害生物。本研究根据该病毒外壳蛋白基因的保守序列,设计得到特异性引物及Taqman荧光探针,建立了MCMV的实时荧光RT-PCR方法,并对其灵敏度与特异性进行了研究。该方法针对2个不同来源的毒株均能得到典型扩增曲线,而没有从小麦线条花叶病毒、玉米粗缩病毒和玉米矮花叶病毒的RNA得到扩增曲线,表明引物与荧光探针具有良好的特异性。针对玉米褪绿斑驳病毒RNA不同稀释度样品,实时荧光RT-PCR检测低限达到10-5稀释度,检测灵敏度要比普通RT-PCR高出100倍。因此,本研究建立的MCMV实时荧光方法具有特异性强、灵敏度高和快速有效的优点。     

北京怀桑地区李矮缩病毒的检测鉴定

在北京怀柔地区核果类果树病毒疫情调查中,对樱桃树上有矮缩、斑驳、皱缩等症状的叶片样品,通过酶联免疫检测为阳性反应,进行RT-PCR鉴定、外壳蛋白基因扩增片段测序,发现该序列与李属坏死环斑病毒(PDV)ch株系分离物(L28145.1)序列的同源性为100%,与分离物(AF208746.1,AF208747.1,AF208743.1)序列的同源性大干97%,说明被检测样品感染有PDV.这是PDV病毒在北京地区发生的首次报道,对该病毒来源及其流行趋势也进行了分析.     

烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的半巢式RT-PCR检测

烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)和番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV)是我国禁止入境的检疫性有害生物。采用半巢式RT-PCR方法对这两种病毒进行了检测,用Trizol快速提取病毒总RNA,并根据TRSV和ToRSV的外壳蛋白基因设计特异性引物,经过第一轮RT- PCR和第二轮半巢式PCR扩增,TRSV样本分别得到359 bp和206 bp特异性片段,ToRSV样本分别得到340 bp和219 bp特异性片段。半巢式RT-PCR扩增产物的测序表明,TRSV产物序列与GenBank中登录的外壳蛋白基因存在88%～97%的同源性,ToRSV产物序列与GenBank中登录的外壳蛋白基因存在96%～100%的同源性。研究显示,DAS-ELISA与RT-PCR的检测灵敏度相近,而半巢式RT-PCR的检测灵敏度比这两种方法高出10~3倍以上。     

河南甜樱桃病毒病害调查及病原检测

在河南省郑州市、巩义市、荥阳市、新郑市选择具有代表性的甜樱桃生产园对病毒病发生情况进行调查,采集表现为疑似病毒病症状的样本65份,利用7种病毒引物进行RT-PCR检测。5种病毒检测结果呈阳性,分别是李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)、李矮缩病毒(Prune dwarf virus,PDV)、樱桃绿环斑驳病毒(Cherry green ring mottle virus,CGRMV)、樱桃坏死锈斑病毒(Cherry necrotic rusty mottle virus,CNRMV)及樱桃病毒A(Cherry virus A,CVA);序列分析结果表明,5种病毒扩增片段与GenBank中注册的相应病毒核苷酸序列均具有较高的一致性;样本病毒检出率为100%,其中13份样本为单独侵染,其余52份样本均为多病毒复合侵染,占比高达80%,复合侵染比例随着侵染病毒种类的增多逐渐降低;病毒侵染组合与叶片表型症状无明显对应关系。     

马铃薯4种病毒多重PCR检测体系的建立

我国马铃薯病毒主要有马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯卷叶病毒(PLRV),常发生复合侵染。根据GenBank中4种马铃薯病毒的外壳蛋白(coat protein,CP)基因全长设计引物,通过RT-PCR扩增得到4种病毒CP基因全长片段,测序结果显示序列同源性96%以上;针对4种病毒CP基因的保守序列分别设计引物,在一个PCR体系中同步对4种病毒进行扩增,得到421、202、516、330bp的特异性条带,优化建立了能同步检测PVY、PVX、PVS和PLRV的多重RT-PCR检测体系。检测结果证明优化后的多重RT-PCR体系能在田间样品中快速、高效地检测出4种病毒。     

地被菊CVB病毒基因的RT-PCR检测

为建立可靠、灵敏且高效的地被菊中菊花B病毒(Chrysanthemum virus B,CVB)的检测方法,利用特异性CVB基因引物,通过RT-PCR技术进行了特异性、重复性和灵敏度测试,最终利用优化的RT-PCR体系对地被菊植株感染CVB病毒情况进行了检测。结果显示,以染病地被菊植株的总RNA为模板扩增出的特异性片段编码211个氨基酸,与基因数据库中其它来源的CVB基因外壳蛋白同源性为96%~99%,可确定为菊花B病毒外壳蛋白基因;重复性和灵敏度检测中均获得了清晰的目标条带,且1 ng的总RNA即可扩增出特异性片段;对7个地被菊品种共32个植株的检测中,CVB的检出率为56.2%,检测的准确率为68.75%。表明建立的地被菊CVB基因的RT-PCR检测体系可有效用于地被菊植株感染病毒情况的鉴定。     

三种甘薯病毒多重RT-PCR检测技术的建立

本文根据GenBank中甘薯G病毒(SPVG)、甘薯卷叶病毒(SPLCV)和甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)外壳蛋白(CP)基因序列设计特异引物,对多重RT-PCR退火温度、延伸温度、模板浓度、引物浓度进行改良优化,建立能同时检测3种甘薯病毒的多重RT-PCR方法。该方法能同时扩增出SPVG、SPLCV和SPFMV特异片段,其大小分别是800、276和570bp。测序结果表明,扩增出的3种病毒序列与相应参考序列相似性达到98%以上。灵敏度分析结果表明,多重RT-PCR方法能够检测cDNA的量为0.1ng。应用建立的多重RT-PCR检测方法对田间样品进行检测,结果显示该方法可以特异、快速、灵敏地同时检测3种甘薯病毒。这些研究结果可为甘薯病毒检测提供参考。     

SYBR GreenⅠ实时定量RT-PCR技术在甜樱桃病毒定量分析中的应用

为了探讨SYBR Green Ⅰ实时定量RT-PCR技术在甜樱桃病毒粒子定量分析中的应用前景,以复合感染李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)、李矮缩病毒(Prune dwarf vi-rus,PDV)、樱桃病毒A(Cherry virus A,CVA)、樱桃小果病毒-2(Little cherry virus-2,LChV-2)的甜樱桃"红灯"Prunus avium cv.Red Lamp植株为研究对象,采用相对定量方法,分析各病毒的外壳蛋白基因的表达,用以指示病毒的增殖量。在花、幼叶、功能叶、衰老叶中均能检测到4个基因,但各基因表达量在各器官中存在差异。PNRSV-CP与CVA-CP表达模式相似,功能叶中明显高于其它器官,衰老叶中急剧降低。PDV-CP与LChV2-CP表达模式类似,幼叶中的表达量较高,功能叶片中较低。PNRSV-CP在花、功能叶中的表达显著高于其它3个病毒基因。LChV2-CP在各器官中的表达量均低于其余3个基因。该方法适用于植物组织内多种甜樱桃病毒增殖量的分析。     

双重RT-PCR同步检测马铃薯A病毒和马铃薯卷叶病毒

根据马铃薯A病毒全基因序列和马铃薯卷叶病毒衣壳蛋白区序列分别设计PVA和PLRV的特异性引物,应用双重RT-PCR同步检测马铃薯A病毒和马铃薯卷叶病毒,分别得到300bp和222bp大小的扩增片段.试验从反转录、PCR等方面对双重RT-PCR同步检测2种病毒进行了探索和优化.结果表明反转录反应中dNTPs浓度、2种病毒下游引物浓度比例以及PCR反应中Mg2+浓度对双重RT-PCR同时检测PVA和PLRV有较大的影响.     

大麦黄矮病毒GPV株系外壳蛋白基因在E.coli中的表达及抗血清制备

 病毒外壳蛋白基因经适当引物逆转录成cDNA后,应用聚合酶链反应(PCR)扩增,得到大麦黄矮病毒(BYDV)GPV株系的外壳蛋白(CP)基因。将此基因克隆至表达载体pMal,转化E.coli TB1,诱导表达了携带外壳蛋白的融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白量的7%,此融合蛋白的分子量约为60kD,经亲和层析纯化后免疫家兔,获得BYDV-GPVCP的抗血清。