蕙兰B类MADS-box基因的克隆及表达分析

 采用RT-PCR结合RACE技术从蕙兰（Cymbidium faberi）中分离到3个B类MADS-box基因CfGLO、CfDEF1和CfDEF2,分别编码210、222和227个氨基酸。系统进化树分析显示,CfGLO属于PI/GLO类基因,CfDEF1和CfDEF2分别属于PaleoAP3组基因的PeMADS2类基因和PeMADS3类基因。RT-PCR和实时荧光定量表达分析表明,CfDEF1在2、3轮花器官侧瓣、唇瓣和蕊柱中强烈表达,在萼片中不表达;CfDEF2在1、2、3轮花器官中都表达,在营养组织中不表达;而CfGLO在所有组织中都表达,说明3个基因在蕙兰花器官的形成过程中可能扮演着不同的角色。此外,3个基因都在蕙兰幼嫩子房中有表达,显示其可能在蕙兰子房的形成过程中起一定作用。     

建兰AP1基因的克隆、表达及其与MADS-box转录因子相互作用的分析

 为研究APl/SQUA类MADS-box基因在建兰花发育中作用,以‘四季大青’建兰花芽为材料,用RT-PCR和RACE技术获得AP1基因,命名为CeAP1。序列分析表明,CeAP1基因cDNA全长866 bp,其开放阅读框编码一个含241个氨基酸的蛋白质。通过蛋白序列比对发现CeAP1与兰科植物的AP1蛋白质同源性较高。荧光定量PCR分析表明,CeAP1基因在建兰花发育初期高水平表达,同时在营养器官中也表达。酵母双杂交试验分析显示,CeAP1能自身形成同源二聚体,同时也能与除CeAG1外的其他MADS-box发生相互作用。     

蜡梅CpAGL6基因启动子的克隆及功能初步分析

利用hiTAIL-PCR法,从蜡梅（Chimonanthus praecox）基因组中克隆到花发育相关基因CpAGL6翻译起始位点上游1 266 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,该启动子序列中存在启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box及多个与植物非生物胁迫相关的响应元件。为进一步分析CpAGL6启动子的功能,构建该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体,并用农杆菌介导法转化烟草。对转基因烟草进行GUS组织化学染色及GUS酶活性定量检测,结果显示,CpAGL6基因启动子能够驱动GUS基因在转基因烟草的叶、茎、花中表达,并且在不同花期表达强度存在差异,在根中几乎不表达。转基因植株经黑暗、赤霉素和4 ℃低温处理后,GUS酶活性均有所增加。结果表明,CpAGL6启动子主要驱动GUS报告基因在花器官和绿色器官组织中表达,推测其在抵抗非生物胁迫中具有重要作用。     

基于EST库的枳APETALA2基因cDNA克隆及其表达分析

 根据物种间同源基因相对保守的特点,利用生物信息学方法以拟南芥APETALA2 cDNA序列作为模板,对柑橘EST数据库进行同源检索筛选,克隆了柑橘APETALA2基因的cDNA序列,并以枳[Poncirus trifoliata (L.) Raf.]花cDNA为模板,根据以上cDNA序列设计特异引物,利用RACE技术分别获得该基因的5'和3'末端,序列拼接后获得枳的APETALA2 cDNA全长。该cDNA全长为1 980 bp,命名为Pt-AP2。Pt-AP2核苷酸序列有一个1 539 bp完整的开放读码框(ORF),5'末端起始密码子ATG其始于290 bp,3'末端非翻译区为152 bp,其中含有27 bp的Ploy⁺(A)。该基因已在GenBank基因数据库注册,注册号为EU883665。推导该cDNA编码512个氨基酸,与苹果、矮牵牛和拟南芥中相应序列同源性分别为59.1%,59.7%和63.8%。序列分析表明, Pt-AP2除了具备完全保守的核定位信号序列（KKSR）外,还具有两个高度保守的重复序列即AP2结构域。分别采用半定量RT-PCR和SYBR Green I实时定量RT-PCR方法分析Pt-AP2在枳叶、茎、根、花和果等不同器官中的表达水平,结果一致表明Pt-AP2在各个器官中的表达水平不同, 花中的表达量最高,果实中的表达量最低。     

龙眼ELF4同源基因的克隆与功能研究

以‘红核子’龙眼（Dimocarpus longan）叶芽为材料,克隆了ELF4同源基因DlELF4-1和DlELF4-2的cDNA全长序列,对序列进行了生物信息学分析,并通过转化拟南芥以及实时荧光定量PCR研究基因功能。蛋白序列比对结果表明,DlELF4-2与AtELF4-L1有较高相似度,而DlELF4-1与AtELF4相似度更高;构建两个基因的植物表达载体转化拟南芥,转基因植株都表现出延迟开花以及不定根生长的现象,表明DlELF4-1和DlELF4-2可能有抑制开花和促进生长素合成功能;DlELF4-1和DlELF4-2在龙眼花芽分化过程的表达模式不同,推测其在龙眼花芽分化过程中有不同的功能。     

白菜多聚半乳糖醛酸酶基因B cM F6的克隆、序列分析及其表达

 从白菜(Brassica campestris L. ssp. chinensis Makino) 核隐性不育两用系‘Bajh97201A /B’可育株中分离得到的一个cDNA-AFLP差异片段入手, 利用RACE技术成功克隆了一个花粉特异的多聚半乳糖醛酸酶( PG) 基因BcMF6的DNA和cDNA全长序列, 并对其序列进行了分析。结果表明, 该基因包含4个外显子和3个内含子, 最大开放阅读框为1 194 bp, 编码397个氨基酸序列, 对推导的氨基酸序列进行分析, 1到22个氨基酸是1信号肽序列, 其后有4个平行β螺旋重复( PbH1) 结构, 该序列包含3个N -糖基化位点, 4个蛋白激酶c磷酸化位点, 5个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点, 10个N - 豆蔻酰化位点, 1个PG活性位点(²²⁷RVTCGPGHGIS1 IGS²⁴⁰ ) 等。将B cM F6基因氨基酸序列与数据库中的其他PGs基因进行同源序列比对, 构建系统进化树, 发现该基因具有所有PGs基因特有的4个保守结构域, 并且与花粉中特异表达的PG基因聚为一类, 表明该基因是与花粉发育相关的多聚半乳糖醛酸酶基因。RT-PCR对其表达的研究表明, 该基因在可育株(野生型) 的中大蕾、开放花和短角果中特异表达, 进一步表明该多聚半乳糖醛酸酶基因与白菜的花粉发育相关。     

墨兰、春兰变种和品种间同工酶分析

 通过酯酶( EST) 、苹果酸酶(ME) 、磷酸葡萄糖异构酶;PGI ( NADP) 、磷酸葡萄糖变位酶PGM( NAD) 、超氧化物歧化酶( SOD) 5 种酶系统研究墨兰和春兰17 个变种及品种的同工酶多样性, 并探讨这些材料间的亲缘关系。5 种酶系统所得的11 个位点中7 个是多态性位点。EST、PGM( NAD) 和SOD具有多态性。上述5 种酶系统能够把供试品种和变种区分开, 并划分为墨兰和春兰类。     

秦岭地区春兰和蕙兰的花挥发性成分研究

采用顶空固相微萃取和气相色谱-质谱联用技术（HS–SPME–GC–MS）对原产于秦岭不同地点的春兰和蕙兰的鲜花进行了挥发性成分测定。结果表明该地区春兰的花中挥发性成分有40多种,主要成分有3–乙基–2–甲基–1,3–己二烯、(E)–2–辛烯醛和2–壬烯醛等;不同产地的春兰花中主要的挥发性物质构成比较类似,花香类型比较单一,且多数为无香型。而该地区蕙兰的花中挥发性成分多达50种以上,主要成分有(E)–橙花叔醇,二十二碳六烯酸和[1à,2à(Z)]–茉莉酸甲酯等。蕙兰花中挥发性成分中大多为有芳香味的物质,从而使得蕙兰的花具有更浓郁的香味。此外,蕙兰花挥发性成分构成也比春兰复杂,因此比春兰具有更多的花香类型。     

春兰炭疽病致病菌Colletotrichum boninense的鉴定及生物学特性分析

以湖南野生春兰(Cymbidium goeringii)引种驯化过程中发生的炭疽病病株为试验材料,分离、鉴定病原菌,分析营养因子和非营养因子对病原菌生长的影响。结果表明:春兰炭疽病病原菌为博宁炭疽菌(Colletotrichum boninense Moriwaki,SatoTsukiboshi);适合生长的培养基有PDA、PSA和CSA;能有效利用多种碳源,最适合的为葡萄糖,有利生长的有机氮为酵母膏和蛋白胨,无机氮为硝酸钾;光照与黑暗对菌丝生长的影响无显著性差异;适宜p H 5.0~8.0;在10~35℃均能生长,最适温度为25℃;处理20 min,菌丝和孢子的致死温度分别为48和50℃。     

秦岭野生春兰组织培养过程中的褐化控制研究

以秦岭野生春兰为材料,选花梗和花萼作为外植体,以1/2MS作为基本培养基,运用L9(34)正交实验研究处理对褐化的影响。结果表明:处理4是控制春兰外植体褐化的最佳的方法,即1/2MS+活性炭(AC)1 g/L+PVP 5 g/L+暗培养10 d。     

植物生长调节剂对线艺春兰根状茎的增殖与分化的影响

 以线艺春兰‘绿云’的类原球茎为材料, 研究了植物生长调节剂等因素对根状茎的增殖与分化的影响。结果表明: 长期继代培养及保存宜选用1 /2MS固体培养基。细胞分裂素6-BA浓度为1.0 mg·L ^{- 1}时根状茎的增殖效果最佳。0～3.0 mg·L ^{- 1}范围内IBA促进根状茎的生长较NAA效果好。1/2MS + 6-BA 1.0 mg·L ^{- 1} + IBA 1.0 mg·L ^{- 1}培养基最利于根状茎的分化, 芽分化率达到36.9%。培养基添加芋艿糊可显著促进根状茎的增殖与生长。根状茎分割以掰开方式且接种团块带有3～5条根状茎较适宜。线艺春兰叶片上的腹轮艺通过组培可以稳定遗传。     

黄瓜MADS-box基因家族生物信息学分析及CsMADS-box AGL62的克隆

分别以全雌系D1104-2-4、强雌系D1158♀-2、雌雄异花同株D0528-2为母本,与1个雌雄异花同株父本D0708-2杂交获得杂种一代,调查开花初期、根瓜期、盛果期3个时期雌性相关农艺性状,筛选出差异显著的组合进行转录组测序分析进而分析黄瓜杂交组合间MADS-box家族的差异基因。结果表明:以全雌系D1104-2-4为母本的杂种一代C15-114在雌花数、雌花节率上均具有超亲优势,3个杂交组合F1均具有早熟的中亲优势。转录组分析结果发现,以全雌系D1104-2-4为母本的杂种一代基因表达情况显著的偏向母本,挑选的37个黄瓜MADS-box家族基因只有6个与母本有表达差异,17个与父本有表达差异。生物信息学分析并命名了1个差异最显著的基因Cs MADS-box AGL62,该基因全长745 bp,编码187个氨基酸,编码的蛋白属于线粒体中不稳定的亲水性跨膜蛋白,NCBI比对结果表明该蛋白是1个转录因子,系统进化分析发现其与甜瓜中AGL62同源性最高,在黄瓜中该蛋白和其他黄瓜AGL62亚型属于同一分支并且属于I型。     

薄壳山核桃MADS-box基因CiMADS9的克隆与功能分析

以薄壳山核桃（Carya illinoinensis）‘马罕’雄花为材料,利用获得的MADS-box基因保守片段设计特异引物,通过RACE技术克隆MADS-box家族基因的cDNA序列,命名为CiMADS9。该基因长为1 077 bp,开放阅读框（ORF）768 bp,编码255个氨基酸残基。生物信息学分析表明该基因具有典型的MADS-box结构域和半保守的K区,是MIKC型MADS-box基因。聚类分析分析表明该基因属于AGL15亚家族。实时荧光定量PCR结果表明,CiMADS9在生殖器官（雄花、雌花、幼果）中的表达量高于营养器官（叶、枝条）中的,并且在雄花中的表达量最大。将目的基因通过农杆菌介导法转化拟南芥,获得了转基因植株。与对照相比,转基因拟南芥中过量表达该基因使植株开花延期,基生叶增加。     

青花菜开花促进因子AGL19与整合子AGL24和SOC1的互作研究

为阐明青花菜(Brassica oleracea var.italica)开花促进因子AGL19与开花整合子AGL24和SOC1蛋白的互作机制,从青花菜中克隆了AGL19、SOC1及AGL24基因。它们分别编码221、221和214个氨基酸,均为MIKC型蛋白,并且与甘蓝、油菜、大白菜等亲缘关系较近,AGL19与SOC1同属TM3/SOC1亚家族成员。酵母双杂交表明:AGL19与AGL24蛋白能互作,激活酵母报告基因AUR1-C、HIS3、ADE2和MEL1,在QDO/X-α-Gal/Ab A平板培养基上长出蓝斑;但与SOC1蛋白不能相互作用,说明AGL19的直接靶蛋白是AGL24而非SOC1。此外,青花菜SOC1也能与AGL24蛋白互作,说明AGL19可以通过AGL24间接与SOC1相互作用。