黄瓜绿斑驳花叶病毒分子检测方法的建立与评价

以接种黄瓜绿斑驳病毒的黄瓜种子为材料,分别建立了快速检测黄瓜绿斑驳病毒的多种PCR方法.实验结果表明,这些方法的灵敏度都比DAS-ELISA的灵敏度高,其中实时荧光RT-PCR的灵敏度最高,可检测到2 ng黄瓜种子中的黄瓜绿斑驳花叶病毒.普通RT-PCR最低可检测到200 ng黄瓜种子中的黄瓜绿斑驳花叶病毒,免疫捕获RT-PCR(IC-RT-PCR)的灵敏度是普通RT-PCR的2倍,而免疫磁珠RT-PCR(IMS-RT-PCR)是普通RT-PCR的4倍.     

香石竹环斑病毒多种PCR检测方法的建立与评价

以香石竹环斑病毒(Carnation ringspot virus,CRSV)的5个分离物为研究对象,分别建立了快速检测香石竹环斑病毒的多种PCR方法。结果表明,这些方法的灵敏度都比DAS-ELISA的灵敏度高,其中SYBR Green RT-PCR的灵敏度最高,可检测CRSV RNA的最低量是6.4pg。免疫磁珠RT-PCR(IMS-RT-PCR)和普通RT-PCR最低可从400ng的带毒叶片中检出CRSV,而免疫捕获RT-PCR(IC-RT-PCR)最低灵敏度可从40ng的带毒叶片中检出CRSV,是普通RT-PCR的10倍。     

TC/IC-RT-PCR检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

根据GenBank上登录的黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)外壳蛋白基因保守序列,设计特异性引物,利用试管捕捉RT-PCR(TC-RT-PCR)和免疫捕捉RT-PCR(IC-RT-PCR)技术对黄瓜绿斑驳花叶病毒进行检测.结果表明,TC-RT-PCR和IC-RT-PCR均具有良好的特异性,检测灵敏度分别比DAS-ELISA高10和100倍;通过对一批进境黄瓜样品的检测,验证了2种检测技术的实际应用效果.因此,本研究建立的TC-RT-PCR和IC-RT-PCR检测技术,可有效应用于CGMMV的快速检测.     

云南食用百合病毒病的发生与检测

通过田间调查、血清学技术、电镜技术、RT-PCR技术对侵染云南食用百合的主要病毒进行调查和研究,结果表明,食用百合病毒病的症状类型多为花叶,斑驳或者无症等类型. 病毒种类主要是黄瓜花叶病毒(CMV),百合无症病毒(LSV)和百合斑驳病毒(LMoV). 其中通过ELISA检测,CMV的检出率达到53.3%,LSV的检出率达到46.7%;通过RT-PCR检测,CMV的检出率达到60%,LSV的检出率达到50%,LMoV的检出率达到30%.     

兰州百合病毒RT-PCR检测技术建立及应用

病毒病是引起兰州百合产量下降、品种退化的主要原因,准确、高效的病毒检测技术在百合脱毒种球生产和推广应用中十分重要.根据CMV、LSV和LMoV病毒外壳蛋白基因序列设计引物,以百合18S rRNA为内参照,建立兰州百合病毒RT-PCR、二重RT-PCR检测体系.对兰州百合主栽区病毒病的抽样调查发现,CMV、LSV带毒率分...     

百合无症病毒的RT-PCR检测

以百合病株为材料,针对百合无症病毒(LSV)的CP基因序列,设计合成了一对特异引物,并通过RT-PCR技术扩增出与预期大小相一致的870 bp片段,而对照无任何产物,应用该方法对田间百合中的LSV的带毒情况进行检测,检出率达80%,检测灵敏度高,专一性强,为百合的病毒检测提供了一种分子生物学检测方法.     

延庆地区侵染百合的病毒检测与序列分析

利用DAS-ELISA和RT-PCR等检测方法,对北京市延庆地区疑似感染病毒的百合植株进行了检测,并将RT-PCR扩增到的产物进行克隆及序列分析验证。DAS-ELISA结果表明：百合叶片的粗汁液与TuBV的抗体呈现阳性,初步确定北京市延庆地区百合感染郁金香杂色病毒（TuBV）。RT-PCR检测结合克隆测序结果表明：郁金香碎色病毒CP基因的核苷酸序列与GenBank上已登录的（AB090385.1,AB078007.1和S44147.1）郁金香碎色病毒的核苷酸序列的同源性均为100%,与已登录的（qb｜AAB19407.1｜,dbj｜BAD02938.1｜和dbj｜BAB83899.1｜）氨基酸序列同源性均在95%以上,同源性较高,进一步证明北京市延庆地区百合感染有郁金香杂色病毒（TuBV）。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒的鉴定及分子检测

【研究目的】黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)的快速鉴定检测是控制该潜在危险性有害生物蔓延的有效途径。【方法】通过汁液摩擦接种、透射电镜观察、双抗夹心酶联免疫吸附测定法(DAS-ELISA)和RT-PCR方法对该病毒进行鉴定;同时对RT-PCR反应体系及扩增程序进行优化,建立CGMMV免疫捕获RT-PCR(IC-RT-PCR)检测方法。【结果】血清学、生物学、电镜观察和分子生物学方法证明供试样本为黄瓜绿斑驳花叶病毒引致。IC-RT-PCR方法可以简化RNA的提取,降低对试验材料要求。【结论】IC-RT-PCR的建立为CGMMV的检测提供了操作更为简便、特异性更强的快速、准确的检测方法。     

建兰花叶病毒检测标准方法的建立

经过2004￣2005两年对上海口岸进境和进境后种植的260个兰花品种上建兰花叶病毒(CyMV)检测方法的研究,分别建立了检测和鉴定兰花上建兰花叶病毒的DAS-ELISA、电镜观察、鉴别寄主反应、RT-PCR和IC-RT-PCR的方法。     

秦巴山区六种野生百合感染3种病毒病鉴定及其田间抗病性初步评价

【目的】对来自秦巴山区6种野生百合（岷江百合（Lilium regale）、卷丹（Lilium tigrinum）、野百合（Lilium brownii）、大花卷丹（Lilium leichtlinii var. maximowiczii）、山丹（Lilium pumilum）、宜昌百合（Lilium leucanthum））的病毒病危害程度进行调查,并对黄瓜花叶病毒（cucumber mosic virus,CMV）、百合斑驳病毒（lily mottle virus,LMoV）和百合无症病毒（lily syptomless virus,LSV）3种病毒进行检测,旨在确定野生百合是否感染病毒及感染种类,并初步判断不同种对病毒的抗性。【方法】采用发病率和病情指数统计方法调查野生百合病毒病发病情况,采用RT-PCR检测和克隆测序等分子生物学方法对不同发育时期野生百合黄瓜花叶病毒（CMV）、百合斑驳病毒（LMoV）和百合无症病毒（LSV）进行鉴定。【结果】异地栽培条件下,6种野生百合中除岷江百合外,其它5种野生百合都不同程度表现出花叶、斑驳等病毒病症状。经RT-PCR检测结果显示,岷江百合无病毒侵染,卷丹感染百合斑驳病毒（LMoV）,野百合、大花卷丹、山丹和宜昌百合均被黄瓜花叶病毒（CMV）和百合斑驳病毒复合侵染。【结论】岷江百合、山丹、野百合、大花卷丹和宜昌百合在原生地不带病毒。在异地保存且有毒源存在的条件下,野生百合易感染病毒。不同种野生百合的抗病毒特性不同,岷江百合对病毒病的综合抗性最强,抗病程度为免疫;大花卷丹和宜昌百合,属中感类型;山丹、卷丹和野百合对病毒病抗性为高感类型。     

利用DAS-ELISA检测侵染观赏百合黄瓜花叶病毒的研究

从制备的黄瓜花叶病毒———观赏百合分离物(CMV-Li)抗血清中提纯了IgG,并用过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶(HRP)标记,建立了检测CMV-Li的DAS-ELISA(double antibody sandwich-enzyme-linked immumnosor-bent assay)系统,利用此检测系统并结合生物学方法,对临洮切花百合田间病样和百合不同部位带毒量进行了检测,结果发现CMV-Li的侵染率为23.81%,叶片的带毒量明显高于花和鳞茎.     

库尔勒香梨上苹果茎沟病毒的三种分子生物学检测技术比较研究

采用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、试管捕捉反转录聚合酶链式反应（TC-RT-PCR）及免疫捕捉反转录聚合酶链式反应（IC-RT-PCR）技术对20份库尔勒香梨样品进行苹果茎沟病毒（Apple stem grooving virus,ASGV）检测,结果显示RT-PCR检测出7份样品感染ASGV,再使用TC-RT-PCR与IC-RT-PCR进行复检,有6份样品检测到ASGV,说明TCRT-PCR与IC-RT-PCR不如RT-PCR的灵敏度高,但是TC-RT-PCR与IC-RT-PCR不需要提取总RNA,操作简便,且减少有毒有机溶剂的危害与污染。TC-RT-PCR与IC-RT-PCR相比,检测得到的特异性带较清晰。     

进境唐菖蒲种球携带南芥菜花叶病毒的检测

利用DAS-ELISA对荷兰进境的唐菖蒲培育叶片进行南芥菜花叶病毒检疫,再对血清呈阳性的种球进行培育,以长出的叶片作为检测材料,采用RT-PCR方法进行南芥菜花叶病毒的检测,并对PCR产物进行克隆与测序.结果表明,从唐菖蒲种球上发现了我国进境植物检疫二类危险性有害生物南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus,ArMV).     

侵染观赏百合病毒寄主范围研究

通过对5个观赏百合品种样品ELISA检测,发现甘肃省观赏百合主要受黄瓜花叶病毒(CMV-Li)和百合无症病毒(LSV)的侵染,并且两种病毒存在复合侵染现象.5品种中CMV-Li和LSV检出率分别为40%和80%,复合侵染率为40%.侵染观赏百合的病毒寄主范围较窄,CMV-Li不能侵染CMV的常规鉴别寄主普通烟、心叶烟和苋色藜,但可侵染黄瓜、曼陀罗、菜豆(美国),侵染后植株可产生明脉、花叶、皱缩等症状,接种发病的菜豆和黄瓜经ELISA检测,可以作为CMV-Li鉴别寄主以及CMV-Li和LSV分离寄主.     

Development and detection application of monoclonal antibodies against Zucchini yellow mosaic virus

Aphid-borne Zucchini yellow mosaic virus(ZYMV) is one of the most economically important viruses of cucurbitaceous plants.To survey and control this virus,it is necessary to develop an efficient detection technique.Using purified ZYMV virion and the conventional hybridoma technology,three hybridoma cell lines(16A11,5A7 and 3B8) secreting monoclonal antibodies(MAbs) against ZYMV Zhejiang isolate were obtained.The working titers of the ascitic fluids secreted by the three hybridoma cell lines were up to 10~(-7) by indirect enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).All MAbs were isotyped as lgG1,kappa light chain.Western blot analysis indicated that the MAb 3B8 could specifically react with the coat protein of ZYMV while MAbs 5A7 and 16A11 reacted strongly with a protein of approximately 51 kDa from the ZYMV-infected leaf tissues.According to this molecular weight,we consider this reactive protein is likely to be the HC-Pro protein.Using these three MAbs,we have now developed five detection assays,i.e.,antigen-coated-plate ELISA(ACP-ELISA),dot-ELISA,tissue blot-ELISA,double-antibody sandwich ELISA(DAS-ELISA),and immunocapture-RT-PCR(IC-RT-PCR),for the sensitive,specific,and easy detection of ZYMV.The sensitivity test revealed that ZYMV could be readily detected respectively by ACP-ELISA,dot-ELISA,DAS-ELISA and IC-RT-PCR in 1:163840,1:2560,1:327680 and 1:1 310720(w/v,g mL~(-1)) diluted crude extracts from the ZYMV-infected plants.We demonstrated in this study that the dot-ELISA could also be used to detect ZYMV in individual viruliferous aphids.A total of 275 cucurbitaceous plant samples collected from the Zhejiang,Jiangsu,Shandong and Hainan provinces,China,were screened forthe presence of ZYMV with the described assays.Our results showed that 163 of the 275 samples(59%) were infected with ZYMV.This finding indicates that ZYMV is now widely present in cucurbitaceous crops in China.RT-PCR followed by DNA sequencing and sequence analyses confirmed the accuracy of the five assays.We consider that these detection assays can significantly benefit the control of ZYMV in China.