龙山卷丹百合无症病毒的检测

以龙山卷丹百合的病叶作为试材,采用DAS-ELISAS检测法对样品进行百合无症病毒的检测,检出率为58.3%;提取总RNA为模板,通过RT-PCR扩增其外壳蛋白基因,大小为287 bp,和预期条带大小一致。经Blast比对发现,该基因片段与Genbank上发表的LSV CP基因序列同源性达92%以上。     

百合无症病毒的RT-PCR检测

以百合病株为材料,针对百合无症病毒(LSV)的CP基因序列,设计合成了一对特异引物,并通过RT-PCR技术扩增出与预期大小相一致的870 bp片段,而对照无任何产物,应用该方法对田间百合中的LSV的带毒情况进行检测,检出率达80%,检测灵敏度高,专一性强,为百合的病毒检测提供了一种分子生物学检测方法.     

百合无症病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立

百合无症病毒(Lily symptomless virus,LSV)是侵染百合科植物的主要病毒之一。根据该病毒不同分离株外壳蛋白基因(coat protein,CP)的保守序列,设计特异性引物与荧光探针,建立了LSV的实时荧光RTPCR检测方法。利用该方法检测LSV的2个阳性样品,均能够得到典型扩增曲线,而在百合斑驳病毒、烟草环斑病毒、番茄环斑病毒等其他病毒阳性样品中没有典型的扩增曲线,表明了该方法的特异性。与普通RTPCR法相比,此方法灵敏度提高10倍。应用该方法,2012年6月至今,宁波出入境检验检疫局从荷兰进境的67批百合种球样品中检出53批百合无症病毒阳性,检出率为93%。     

百合无症病毒的ELISA检测

对两个百合品种应用ELISA检测法进行百合无症病毒检测,发现样品、阳性对照与底物的反应均表现出阳性,结果表明样品100%带有LSV病毒.     

百合病毒的高通量测序鉴定和RT-PCR检测

为明确百合在生产中被病毒侵染的情况,利用高通量测序技术对云南、浙江等地的百合染病样品进行病毒鉴定,通过序列比对和拼接,获得了车前草花叶病毒(plantago asiatica mosaic virus,PlAMV)、百合斑驳病毒(lily mottle virus,LMoV)、大丽花花叶病毒(dahlia mosaic virus,DMV)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)、玄参花叶病毒(figwort mosaic virus,FMV)、玫瑰黄脉病毒(rose yellow vein virus,RYVV)、大丽花普通花叶病毒(dahlia common mosaic virus,DCMV)、木薯脉花叶病毒(cassava vein mosaic virus,CsVMV)等8种已知病毒和2种未知病毒的序列信息。对从云南、浙江、江西、上海、广东、湖南6个省(市)采集的48份百合样品进行了上述8种病毒的RT-PCR检测。结果显示,在百合样品中,DMV、RYVV、PlAMV和LMoV发生普遍,检出率均高于95%,FMV检出率高于85%,CMV检出率最低,且...     

百合无症病毒检测方法研究进展

综述了百合无症病毒病原学、病害流行学和分子生物学的研究进展;系统总结了目前常用的百合无症病毒快速检测方法和技术——免疫电镜法、酶联免疫吸附法、核酸分子杂交技术、反转录PCR技术等。     

百合无症病毒CP基因在大肠杆菌中的表达

应用RT-PCR 方法从感病百合总RNA中扩增出百合无症病毒的外壳蛋白基因片段,连接到原核载 体pUC19,转化大肠杆菌DH5α并用IPTG诱导表达。SDS—PAGE及Western blot分析表明,CP基因在大肠肝 菌中获得了特异性表达,融合蛋白分子量约为35kD。     

龙山卷丹百合黄瓜花叶病毒的检测

以龙山卷丹百合的病叶为试材,采用DAS-ELISAS检测法对样品进行百合黄瓜花叶病毒的检测,检出率为75%;提取总RNA为模板,通过RT-PCR扩增其外壳蛋白基因大小为514 bp,和预期条带大小一致。经Blast比对发现,该基因片段与Genbank上发表的CMV CP基因序列同源性达96.7%。     

万载龙牙百合主要病毒的检测及其检测技术的建立

采用RT-PCR法,检测了万载龙牙百合的主要病毒;通过RT-PCR反应条件的确定,建立了万载龙牙百合主要病毒的RT-PCR检测技术。结果表明:万载龙牙百合感染了百合斑驳病毒,没有感染黄瓜花叶病毒和百合无症病毒;百合斑驳病毒的RT-PCR检测技术为:50℃逆转录30 min;94℃预变性5 min;94℃变性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,30个循环;72℃最后延伸7 min。     

万载龙牙百合主要病毒的检测及其检测技术的建立

采用RT-PCR法,检测了万载龙牙百合的主要病毒;通过RT-PCR反应条件的确定,建立了万载龙牙百合主要病毒的RT-PCR检测技术。结果表明:万载龙牙百合感染了百合斑驳病毒,没有感染黄瓜花叶病毒和百合无症病毒;百合斑驳病毒的RT-PCR检测技术为:50℃逆转录30 min;94℃预变性5 min;94℃变性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,30个循环;72℃最后延伸7 min。     

TC/IC-RT-PCR检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

根据GenBank上登录的黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)外壳蛋白基因保守序列,设计特异性引物,利用试管捕捉RT-PCR(TC-RT-PCR)和免疫捕捉RT-PCR(IC-RT-PCR)技术对黄瓜绿斑驳花叶病毒进行检测.结果表明,TC-RT-PCR和IC-RT-PCR均具有良好的特异性,检测灵敏度分别比DAS-ELISA高10和100倍;通过对一批进境黄瓜样品的检测,验证了2种检测技术的实际应用效果.因此,本研究建立的TC-RT-PCR和IC-RT-PCR检测技术,可有效应用于CGMMV的快速检测.     

云南食用百合病毒病的发生与检测*

 通过田间调查、血清学技术、电镜技术、RT PCR技术对侵染云南食用百合的主要病毒进行调查和研究,结果表明,食用百合病毒病的症状类型多为花叶,斑驳或者无症等类型。 病毒种类主要是黄瓜花叶病毒（CMV）,百合无症病毒（LSV）和百合斑驳病毒（LMoV）。 其中通过ELISA检测,CMV的检出率达到53.3%,LSV的检出率达到46.7%;通过RT PCR检测,CMV的检出率达到60%,LSV的检出率达到50%,LMoV的检出率达到30%。     

香石竹坏死斑点病毒的鉴定与检测

调查表明云南省昆明市团结乡香石竹普遍发生病毒病。电镜负染检测采自团结乡香石竹病毒病病样,病叶汁液中观察到弯曲长线型的病毒粒体,长度约1000~1600 nm,直径约12 nm。对这些病样的叶片进行间接ELISA检测,所有样品与香石竹坏死斑点病毒抗血清都呈阳性反应。按照报道的长线形病毒属简并引物合成引物,采用RT-PCR法对血清反应呈阳性的香石竹总RNA扩增了1059ntsHSP70基因部分编码序列,将其克隆到pMD18-T载体上,并进行序列分析。根据测序结果设计引物建立RT-PCR扩增检测方法并测定其灵敏度。结果表明,使用简并引物和新设计的引物均能从CNFV感病香石竹组织中扩增出与预期大小一致的目标片段,而健康组织无此扩增产物。灵敏性测定结果表明该特异性引物RT-PCR可从稀释106植物总RNA中检测出病毒。     

烟草环斑病毒的RT-PCR和IC-RT-PCR检测方法研究

根据TRSV CP基因的保守序列设计引物,RT-PCR和IC-RT-PCR能从TRSV的2个分离物中分别扩增到与预期大小相同的DNA条带,序列测定和分析表明所扩增序列为TRSV CP基因的部分序列,在系统关系树上与TRSV的其他分离物形成一簇,表明所建立的RT-PCR和IC-RT-PCR检测方法是可靠的。     

建兰花叶病毒检测标准方法的建立

经过2004￣2005两年对上海口岸进境和进境后种植的260个兰花品种上建兰花叶病毒(CyMV)检测方法的研究,分别建立了检测和鉴定兰花上建兰花叶病毒的DAS-ELISA、电镜观察、鉴别寄主反应、RT-PCR和IC-RT-PCR的方法。     

甘蔗黄叶病毒的RT-PCR检测技术

以甘蔗黄叶病毒(ScYLV)特异性引物YLSF111和YLSR462为引物,对福建蔗区8个罹病品种的疑似病株进行RT-PCR检测,扩增出352 bp特异性片段.将PCR产物克隆后测序,序列分析表明,该片段是ScYLV外壳蛋白(CP)基因的一部分,核苷酸和氨基酸序列同源性达95%以上,与美国、印度、巴西等国家ScYLV分离物(GeneBank登录号分别为AF157029、AY236971、AF141385)CP基因同源性达100%,证实我国福建地区甘蔗黄叶综合症的病原体为ScYLV.本研究同时建立了ScYLV的RT-PCR检测技术.     

小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)的RT-PCR检测

小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV）是葫芦科作物上的一种重要病毒,近几年来已成了我国葫芦科作物上的一种重要病原物。根据已知的ZYMV基因组序列分别设计了2对特异性引物,在优化RT—PCR条件的基础上,成功建立了ZYMV的RT—PCR检测方法。引物ZYM1／ZYM2用于扩增整个CP基因序列（片段长度949bp）,而引物ZYM3／ZYM4用于扩增部分CP基因序列（片段长度449bp）,其中,引物ZYM3／ZYM4的检测灵敏度比引物ZYM1／ZYM2的检测灵敏度高。把所建立的方法用于南瓜（Cucurbita moschata）、丝瓜（如如cylindrica）病叶的检测,结果在这些病叶中也检出ZYMV。因此,该方法可用于ZYMV的快速、灵敏检测及分子流行病学的调查研究。     

菜豆荚斑驳病毒免疫捕获一步RT-PCR检测

【研究目的】建立快速、准确、简便的检测大豆种子上菜豆荚斑驳病毒的免疫捕获一步RT-PCR方法(一步IC-RT-PCR)。【方法】采用抗原捕获和一步RT-PCR相结合的方法,并通过反应条件优化,确定一步IC-RT-PCR的反应程序,同时对该方法的特异性及实际检测效果进行验证。【结果】成功建立了一步IC-RT-PCR检测菜豆荚斑驳病毒方法,能够从感染菜豆荚斑驳病毒的大豆种子上扩增出预期大小的特异性片段,而对其他病毒及健康大豆无特异性反应;应用该方法对不同产地大豆种子样品进行检测,结果从来自美国的大豆样品中检出菜豆荚斑驳病毒,检出率为50%。【结论】一步IC-RT-PCR方法可以快速、准确地检测大豆种子上的菜豆荚斑驳病毒,适用于口岸检验检疫。