鸡白介素18与鸡γ干扰素基因融合表达载体构建

为了研究新型细胞因子制剂,构建鸡白细胞介素18和鸡干扰素γ的基因融合表达载体。无菌提取鸡脾细胞的总RNA,以其为模板经过RT-PCR的方法分别扩增出Ch IL-18和Ch IFN-γ基因片段,并连接到p MDTM18-T克隆载体上,构建重组质粒p MDTM18-T-Ch IL-18和p MDTM18-T-Ch IFN-γ。以重组质粒p MDTM18-T-Ch IL-18和p MDTM18-T-Ch IFN-γ为模板,利用多肽氨基酸接头和overlap技术,获得Ch IL-18-Ch IFN-γ融合基因并连接到克隆载体p MDTM18-T上,经PCR、酶切及测序鉴定正确后连接到p ET32a原核表达载体中。构建Ch IL-18-Ch IFN-γ原核表达载体。为下一步研究二者之间的作用关系及抗病毒功能奠定了基础。     

鸡α干扰素/白细胞介素18基因的融合表达及抗病毒活性研究

【目的】构建原核表达载体p ET28a-r Ch IFN-α-Ch IL-18、大肠埃希菌Escherichia coli表达及产物纯化与活性检测,研究高效广谱鸡基因工程重组复合抗病毒制剂,以对鸡的病毒性疾病进行防治.【方法】采用融合PCR(Fusion PCR)方法,利用具有互补末端的引物,形成具有重叠链的PCR产物,通过PCR产物重叠链的延伸将鸡α干扰素(Chicken interferon alpha,Ch IFN-α)与鸡白细胞介素18(Chicken interleukin-18,Ch IL-18)基因构建Ch IFN-α-Ch IL-18融合基因并克隆入p ET-28a原核表达载体中进行原核表达.通过镍柱亲和层析法纯化可溶性蛋白,并进行SDSPAGE分析、Western-blot鉴定.采用细胞病变抑制法检测r Ch IFN-α-Ch IL-18蛋白在细胞上抑制水泡性口炎病毒(VSV)及新城疫病毒(NDV)增殖活性.【结果和结论】成功构建并克隆了p ET28a-r Ch IFN-α-Ch IL-18融合基因.融合基因在大肠埃希菌中表达的r Ch IFN-α-Ch IL-18蛋白相对分子质量约为38 000,蛋白经纯化后纯度在90%以上.r Ch IFN-α-Ch IL-18蛋白在鸡胚成纤维(CEF)细胞上具有明显抗病毒活性,其抗VSV和NDV的活性明显高于单一r Ch IFN-α、r Ch IL-18蛋白的抗病毒活性.     

肺炎支原体肺炎患儿血清IL-4、IL-18及IFN-γ检测及意义

目的：探讨小儿肺炎支原体肺炎（Mycoplasmal pneumonia．MPP）血清IL-4、IL-18及IFN-γ的变化及其临床意义。方法：住院确诊的MPP患儿24例及正常对照组儿童21例。用ELISA测定MPP急性期、恢复期、正常对照组血清IL-4、IL-18及IFM-γ。结果：MPP患儿血清IL-4、IL—18含量急性期明显高于恢复期和正常对照组．差异有非常显著意义（P〈0．01）；恢复期和正常对照组比较．无统计学意义（P〉0．05）；重症组明显高于轻症组（P〈o．05）；血清IFN-γ含量急性期轻度高于恢复期和正常对照组，但无统计学意义；血清IL-4／IFN-γ比值急性期高于恢复期和正常对照组，差异有显著意义；MPP患儿急性期血清IL-4含量重症组E日显高于轻症组。急性期IFN-γ含量重症组稍高于轻症组，但无统计学意义；恢复期IFN-γ、IL-4、IL-4／IFN-γ重症组和轻症组比较无统计学意义；MPP忠儿血清IL-4，IL-8呈显著正相关（P〈0．001）。结论：MPP患儿存在TH1／TH2失衡。TH2反应占优势，IL-4及IFN-γ参与MPP患儿的免疫状态改变，在MPP发病机制中起一定作用。IL-18在肺炎支原体肺炎患儿血清中明显增高．且与IL-4呈正相关，IL-18可能在促进IL-4的分泌中起到一定的作用。     

孟鲁司特对哮喘患儿血清IL-4、IL-5和IFN-γ的影响

目的观察孟鲁司特对哮喘患儿血清IL-4、IL-5和IFN-γ的影响。方法 83例支气管哮喘患儿随机分为实验组（43例）和对照组（40例）。两组均予常规综合治疗,实验组在此基础上每晚睡前加服孟鲁司特5mg,治疗6个月后检测两组患儿血清IL-4、IL-5和IFN-γ水平的变化。结果实验组治疗后血清IL-4和IL-5水平较对照组明显下降（P〈0.01）,而IFN-γ水平则明显上升（P〈0.01）。结论孟鲁司特能降低哮喘患儿血清IL-4和IL-5水平,增高血清IFN-γ水平,减轻免疫炎症反应,在哮喘治疗中起重要作用。     

白细胞介素18和鸡白细胞介素18

白细胞介素 18是一种新发现的细胞因子 ,主要由单核巨噬细胞系统的细胞分泌。目前在分子水平上已经证明 ,人、哺乳动物和某些鸟类中都有 IL- 18存在。IL- 18在结构上属于 IL- 1家族 ,在功能上它与 IL- 12相似 ,且二者有协同效应。 IL- 18具有多种生物学功能 ,它不仅可以增强 Th1型免疫反应 ,而且在 Th2型免疫反应中也发挥一定的作用。人类医学研究证明 IL- 18在抗微生物感染、抗肿瘤免疫中具有应用潜力。在集约化畜禽养殖业中 ,包括白细胞介素 18在内的细胞因子作为天然的免疫调节剂 ,目前已被公认为是一种可以替代传统疗法的新型治疗剂。鸡 IL- 18基因是最近才被发现的 ,由于它具有与人和哺乳动物相似的生物学功能 ,因而鸡 IL- 18在比较免疫学研究和禽病治疗中具有重要意义。     

鸡IFN-γ表达载体的构建

[目的]构建鸡IFN-γ的表达载体。[方法]采用PCR方法从pcDNA-ChIFN-γ重组质粒中扩增得到鸡IFN-γ基因,将目的基因定向克隆至能够在大肠杆菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞中表达的pQE trisystem载体内,转化大肠杆菌M15菌株,以IPTG诱导表达8×H is-tag标签蛋白并对其进行纯化。[结果]通过SDS-PAGE检测方法表明,ChIFN-γ基因片段成功表达。[结论]鸡IFN-γ的表达载体成功构建。     

肺炎支原体感染患儿急性期血清IFN-γ和IL-4水平的变化

目的：探讨肺炎支原体（MP）感染患儿急性期血清细胞因子即干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素-4（IL-4）水平的变化。方法：选择某中医医院儿科门诊和住院疑诊为MP感染的患儿,采用明胶颗粒凝集试剂检测其血清MP抗体,将滴度为1∶160以上的60例患儿以及30例健康儿童采用酶联免疫吸附试验检测血清IFN-γ和IL-4浓度。结果：与对照组比较,患儿组血清IFN-γ和IL-4水平均明显升高,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：MP患儿血清急性期IFN-γ和IL-4均升高,提示MP患儿发病可能与免疫功能紊乱相关。     

乙型肝炎患者外周血IL-2、可溶性IL-2受体、IFN-γ检测的意义

目的：探讨乙型肝炎患者外周血白细胞介素2（IL-2）、可溶性IL-2受体（sIL-2R）和γ-干扰素（IFN-γ）变化与肝功能的关系。方法：测定乙型肝炎患者72例（肝功能正常者33例,异常者39例）和健康成年人35例血清IL-2和sIL-2R及IFN-γ。结果：乙型肝炎患者肝功能异常组和对照组的IL-2、sIL-2R、IFN-γ差异有统计学意义（P〈0.01）,而肝功能正常组与健康对照组比较,差异无统计学意义。结论：乙型肝炎肝功能异常患者存在一定程度的T细胞功能障碍与缺陷,这种障碍与缺陷与其肝功能状态有密切关系。     

鸡IL-18原核表达工程菌遗传稳定性与表达产物的生物学活性检测

通过对鸡白介素18(IL-18)原核表达工程菌BL21-ChlL-18遗传稳定性、表达产物的Western-blot及其经Sephadex G-100纯化后的ELISA和淋巴细胞转化试验分析,以检测其遗传稳定性及其表达产物的生物学活性.结果表明,该重组工程菌能稳定地表达鸡IL-18,表达产物不仅能够与抗鸡IL-18的多...     

萨福克羊发育过程中外周血IFN-γ、IgG和IL-2质量浓度的变化

为分析萨福克羊生长发育中部分免疫分子的分泌特点,探讨萨福克羊的免疫学特征。以萨福克羔羊为研究对象,应用ELISA方法检测全年12个月和全天24h绵羊外周血中γ干扰素(IFN-γ)、免疫球蛋白G(IgG)和白细胞介素-2(IL-2)的质量浓度,分析其年周期和昼夜节律变化。结果表明,从初生到周岁的17个时间点,萨福克羔羊外周血中IFN-γ质量浓度变化不显著(P0.05);羔羊吮吸初乳以后外周血中IgG和IL-2质量浓度迅速升高;IgG质量浓度在羔羊吮吸初乳以后显著高于2月龄、3月龄、4月龄、5月龄、6月龄、8月龄、10月龄、11月龄和12月龄(P0.05);IL-2质量浓度在7月龄显著高于羔羊初生未吮吸初乳、7日龄、1月龄、2月龄、3月龄、4月龄、5月龄和12月龄(P0.05);全年羔羊外周血中IgG和IL-2质量浓度变化趋势一致。在6月龄羔羊全天4个时间点,其外周血IgG、IFN-γ和IL-2的质量浓度变化均不显著(P0.05)。说明,初乳能显著提高羔羊的免疫水平,季节转换影响羔羊免疫分子的分泌,萨福克羊免疫分子的分泌具有年周期和昼夜节律变化特征。     

鸡白细胞介素18基因的克隆与原核表达

白介素18(IL-18)最早被称为干扰素诱导因子(interferon-γ-inducing factor,IGIF),是近年发现的一种重要的免疫调节因子。该实验根据Gen Bank中已公布的鸡IL-18的基因序列,设计并合成了一对特异性引物,应用RT-PCR方法扩增出IL-18基因,并将该基因克隆到p MD18-T载体中,经过质粒酶切、PCR和测序鉴定,阳性克隆命名为Chp MD18-T-IL-18。将Chp MD18-T-IL-18双酶切后与p ET32a表达载体连接,转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中,经IPTG诱导表达鸡IL-18蛋白,结果表明,在28k D左右出现了目的条带,经west-ern blot检测确定该蛋白获得高效表达,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

猪IL-18成熟蛋白基因重组真核表达载体的构建及其抗病毒作用研究

应用RT-PCR方法从三元猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素-18成熟蛋白(pmIL-18)基因,经克隆测序表明,pmIL-18基因长474bp,编码157个氨基酸。序列分析发现,与已发表的pmIL-18基因序列同源性很高,均为99%以上。将pmIL-18基因插入表达载体pcDNA3.1,成功构建了pmIL-18基因的重组真核表达载体pcD-NA3/pmIL-18。将重组质粒转染COS7细胞,经SDS-PAGE及Western-blotting分析表明,pmIL-18基因在COS7细胞中获得了瞬时表达。收集转染细胞培养上清,检测pmIL-18抗病毒活性,结果表明,转染上清对猪繁殖与呼吸综合征病毒没有明显的抑制作用。     

乙型肝炎患者血清IL-2、IL-12和IL-18水平的检测及临床意义

目的：探讨血清IL-2，IL-12、IL-8水平与乙型肝炎病变的关系。方法：运用ELISA法检测不同类型乙型肝炎患者血清IL-2、IL-12、IL-18的水平，观察患者细胞因子水平与肝炎发展的关系。结果：慢性及重型肝炎患者血清IL-2水平出现显著性下调（P〈0．01），而急性、慢性及重型肝炎患者的IL-12、IL-18的水平均显著高于正常对照组（P〈0．01），升高程度与病情相关。结论：血中细胞因子水平是判断乙肝患者免疫状态及进行治疗的重要指标。     

鸡IL-18基因的克隆表达及对新城疫疫苗诱导的HI抗体变化的研究

通过RT-PCR方法从新城疫Ⅰ系疫苗诱导的11日龄鸡胚脾脏细胞中扩增出鸡白细胞介素18(Chicken interleukin-18,ChIL-18)成熟蛋白基因的cDNA,并将其克隆到pMD18-T载体上。DNA序列测定表明,克隆得到ChIL-18全基因,其编码区大小为597bp,编码198个氨基酸多肽。将该基因片段克隆到原核表达载体pProEXTMHTb构建重组质粒pProEXTMHTb-ChIL-18转化大肠杆菌DH5α中,并用IPTG诱导。重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子量为28.6ku的重组蛋白。观察ChIL-18蛋白对新城疫疫苗诱导的HI抗体动态变化。结果表明,同时接种ChIL-18蛋白和活疫苗的免疫鸡在接种后,所产生的HI抗体效价高于PBS和活疫苗免疫组,并且,HI抗体效价在15d及热应激24h时表现差异显著(P<0.05)。表明ChIL-18蛋白对新城疫疫苗诱导的HI抗体有增强作用。     

弓形虫代谢分泌抗原对仔猪IL-2、IL-4、IFN-γ和TNF-α表达水平的影响

通过免疫后攻毒的方法研究了弓形虫代谢分泌抗原(E/SA)免疫后对不同免疫组仔猪机体白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量的影响.结果表明:免疫后各免疫组仔猪的IL-2、IL-4、IFN-γ含量均不同程度的升高;其中E/SA组IL-2、IL-4和IFN-γ的水平显著升高,与对照组差异显著(P0.05),其含量分别由免疫前的105.05、105.33、67.50pg.mL-1升高到免疫后的194.03、342.50、296.50pg.mL-1;TNF-α水平变化不显著.试验证实弓形虫代谢分泌抗原疫苗能够促进仔猪IL-2、IL-4、IFN-γ的分泌,并引起宿主抗弓形虫感染的免疫应答.     

鸡γ-干扰素的克隆·表达和序列分析

[目的]为鸡γ-干扰素的进一步研究奠定基础。[方法]根据GenBank发表的鸡γ-干扰素核苷酸序列,设计1对特异性引物。利用RT-PCR技术从ConA诱导培养的鸡脾脏淋巴细胞中克隆鸡γ-干扰素基因,并在IPTG诱导下在大肠杆菌中表达重组菌。[结果]克隆的鸡γ-干扰素基因全长495bp,编码165个氨基酸,与国外克隆的鸡γ-干扰素基因序列的同源性为100%。鸡γ-干扰素蛋白含有12个α螺旋,3个β折叠,7个β转角。它具有强抗原性,而第16～23位氨基酸无抗原性。重组蛋白的分子量约18kD,其经IPTG诱导表达4h后,表达量最高,表达产率高达25%。[结论]鸡γ-干扰素具有一定的抗原性,预示其在免疫反应中起一定作用。     

鸡IL-18重组真核表达载体的构建及其对ND灭活苗的佐剂作用

从pGEM-ChIL-18克隆质粒扩增获得鸡IL-18(ChIL-18)全基因片段,并将其重组到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/ChIL-18(简称pChIL-18).经PCR、酶切和基因测序证实,所获重组质粒含有目的片段,且连接、构建正确.pChIL-18转染Cos7细胞,转染细胞中含ChIL-18基因的mRNA,表达产物对鸡淋巴细胞具有明显诱导转化作用.pChIL-18对ND灭活苗免疫增强作用的研究表明pChIL-18能够提高ND灭活苗诱发的细胞免疫应答,为后续基因疫苗的研究奠定基础.     

乙型肝炎肝硬化患者血清IL-18、IL-18结合蛋白a亚群水平的检测及临床意义

目的探讨乙型肝炎肝硬化患者血清白细胞介素18（IL-18）和白细胞介素18结合蛋白（IL-18BP）的水平变化及其与病情的关系。方法用ELISA法检测75例乙型肝炎肝硬化患者（Child—PughA级、Child—PughB级、Child-PughC级各25例）和25例正常对照血清IL-18、IL-18BPa亚群（IL-18BPa）水平。结果乙型肝炎肝硬化患者血清IL-18、IL-18BPa水平均明显高于正常对照（P〈0．01）,并且Child—PughA、B、C三级IL-18、IL-18BPa的水平依次递增,各级间差异有统计学意义（P〈0．01或0．05）。结论检测血清IL-18、IL-18BP水平有助于判断乙型肝炎肝硬化病情的严重程度,IL-18BP可能不足以中和IL-18。     

鸡白细胞介素18研究进展

鸡白细胞介素(IL-18)是一种新发现的细胞因子,其cDNA全长597 bp,编码198个氨基酸的前体多肽,分子量约为23 kDa,IL-18氨基端的29个氨基酸残基起胞内定位作用;鸡IL-18是IFN-γ诱生剂,通过IFN-γ发挥抗感染、促生长等作用,参与对微生物感染诱导产生细胞和体液免疫反应的初次免疫应答;鸡IL-18作为免疫佐剂,具有增强免疫和治疗作用,还具有抗肿瘤免疫作用。     

哮喘及肺炎患儿血浆白细胞介素-18、白细胞介素-16、 白细胞介素-4及γ-干扰素水平的相关性及临床意义

目的 探讨哮喘及肺炎患儿血浆白细胞介素(IL)-18、IL-16、IL-4及γ-干扰素(IFN-γ)水平的相关性及临床意义。方法 研究对象为哮喘患儿(哮喘组)33例,肺炎患儿(肺炎组)38例,健康小儿40例(对照组),采用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定研究对象血浆IL-18、IL-16、IL-4及IFN-γ水平,并比较各指标的相关性。结果 哮喘患儿急性发作期和非发作期血浆IL-16、IL-4水平与对照组比较,差异有统计学意义(F=15.687、18.359,P<0.05),血浆IL-18和IFN-γ水平,在急性发作期、非发作期与对照组相比,差异无统计学意义(F=3.025、4.367,P>0.05)。肺炎患儿急性期和恢复期血浆IL-18、IL-16水平与对照组相比,差异有统计学意义(F=24.386、31.256,P<0.05),血浆IL-4和IFN-γ水平,在急性期、恢复期与对照组相比,差异无统计学意义(F=5.328、5.587,P>0.05)。哮喘患儿血浆中IL-18与IL-4、IFN-γ之间,IL-16与IL-18、IL-4、IFN-γ之间显著正相关(P<0.05);IL-4与IFN-γ之间存在显著负相关(P<0.05)。肺炎患儿血浆中IL-18与IL-16、IL-4、IFN-γ之间,IL-16与IFN-γ之间显著正相关(P<0.05)。结论 IL-18、IL-16、IL-4、IFN-γ参与了小儿哮喘和肺炎的免疫反应过程。