禽流感病毒PB2亚单位抗血清的制备

采用RT-PCR方法分段扩增PB2基因,将目的基因定向克隆至含HisTAG的原核表达载体pET-32a,经序列验证正确后,转化BL21大肠杆菌,诱导表达重组蛋白。靶蛋白经Ni+柱纯化后与弗氏免疫佐剂混合免疫新西兰大耳白兔,获得高效价的抗PB2的抗血清。Western-blot检测结果证实制备的抗血清可与PB2蛋白发生特异性反应。进一步将PB2全长基因准确插入真核表达载体pCAGGS,转染293T细胞表达PB2蛋白,通过IFA检测发现,抗血清与细胞表达的PB2蛋白发生反应,出现特异性荧光,经激光共聚焦检测PB2亚单位只在细胞核中出现荧光,说明PB2亚单位单独表达仅限于细胞核内。上述研究为进一步探索PB2亚单位的生物学特性及其结构与功能研究打下基础。     

犬细小病毒特异性抗血清的制备及应用研究

为制备犬细小病毒特异性抗血清,用犬细小病毒DD株免疫健康易感比格犬,无菌采血后分离血清制备犬抗CPV-2血清。通过SN、ELISA、IFA、HI方法对制备的血清进行检测,未检出犬类常见的5种病毒抗体,说明该血清特异性良好。经测定,该血清中和抗体效价为1∶512;HI效价为1∶1280。应用结果表明,该血清对不同犬细小病毒毒株中和能力相当,对CPV-2感染犬有良好的治疗效果。     

鸡Mx基因的表达及其抗血清的制备

Mx蛋白已被证明具有抗A型流感病毒、Thogoto病毒和水泡性口膜炎病毒等的生物活性.本研究通过PCR扩增,将Mx基因克隆至pMD18-T载体;经测序验证后将Mx基因克隆到原核表达载体pProExHTa和pcDNA3.1中.以构建的重组质粒pProExHTa-Mx转化大肠杆菌BL21,进行诱导表达,以切胶纯化方式回收了Mx融合蛋白,加佐剂乳化,免疫新西兰白兔制备抗血清;SDS-PAGE和western blot分析表明:Mx基因在大肠杆菌中以融合蛋白形式稳定表达,表达产物的相对分子量约80 ku,与预期值相符;抗血清能与Mx蛋白发生特异性反应.以真核表达重组质粒pcDNA3.1-Mx转染293T细胞,间接免疫荧光试验结果表明:原核表达蛋白免疫动物制备的抗血清与真核表达的Mx蛋白发生良好的免疫反应,表明用原核表达的Mx蛋白具有真核表达Mx蛋白相似的免疫学活性.抗血清的制备为鸡Mx蛋白的功能研究、Mx蛋白在转基因动物机体中表达的检测奠定了基础.     

鸡PPAR-γ基因表达载体构建及抗血清制备

为构建鸡PPAR-γ基因的原核和真核表达载体并制备鸡PPAR-γ的抗血清,根据鸡PPAR-γ基因cDNA序列设计一对引物,采用RT-PCR的方法扩增鸡PPAR-γ基因的cDNA片段并将其分别插入到原核表达载体pGEX-4T-1和真核表达载体pcDNA3中;进而诱导重组原核表达载体pGEX-4T-1/PPAR-γ在大肠杆菌BL21中表达;同时利用重组真核表达载体pcDNA3/PPAR-γ免疫注射小鼠使其产生免疫应答。SDS-PAGE结果显示pGEX-4T-1/PPAR-γ在大肠杆菌BL21中得到了高效的表达。ELISA和Western blot结果表明,pcDNA3/PPAR-γ免疫小鼠产生了效价较高和特异性较强的抗体。本研究所构建的真核表达载体pcDNA3/PPAR-γ为在细胞水平上研究鸡PPAR-γ基因超表达提供了有力的工具;所获得的重组蛋白和抗血清为在蛋白水平上研究鸡PPAR-γ基因的功能奠定了基础。     

兔病毒性出血症抗血清的制备及效价测定

本试验采用兔病毒性出血症灭活疫苗、兔病毒性出血症灭活疫苗和兔病毒性出血症病毒强毒两种不同的免疫程序来免疫家兔．采用血凝及血凝抑制试验检测血清的抗体效价。结果表明：经3次免疫后,疫苗免疫程序组免疫家兔的抗血清平均效价为9log2,未免疫家兔的抗体平均效价为2log2。     

鲁西黄牛α干扰素基因的原核表达及其抗血清的制备

采用PCR方法从鲁西黄牛基因组DNA中克隆了α干扰素(BoIFN-α)基因,并插入到pET32a+中,构建成重组原核表达质粒pET32a+/BoIFN-α,进行测序和诱导表达.测序结果表明,鲁西黄牛IFN-α基因全长498 个核苷酸,含1个开放阅读框(ORF),编码166 个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的牛α干扰素C亚型氨基酸组成同源性为97.6%.表达产物经SDS-PAGE分析,表达出40 ku的融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的26.7%.表达产物经镍离子螯合次氨基三乙酸(Ni-NTA)亲和层析纯化,纯化产物进行复性后免疫昆明系小鼠2次,制备高滴度的牛IFN-α抗血清.结果从鲁西黄牛中克隆了IFN-α基因的一种新亚型,即BoIFN-α C2,实现了高效表达和纯化,并制备了鼠抗牛IFN-α,为重组牛干扰素的开发奠定了基础.     

流感病毒RNA聚合酶串联亲和纯化方法的建立

为建立流感病毒RNA聚合酶的串联亲和纯化方法,本实验由鸡胚尿囊液中提取病毒核酸,经过RT-PCR和常规PCR方法扩增禽流感病毒株A/Duck/Guangxi/35/01 (H5N1)的PB1、PB2和PA的cDNA.分别将PB2基因连接于pcDNATAP载体中,PB1和PA基因连接于pcDNA3A载体中构建了pcDNA-35PB2TAP、pcDNA-35PB1和pcDNA-35PA重组质粒.将构建的真核表达重组质粒共转染293T细胞,经过串联亲和纯化方法获得流感病毒依赖RNA的RNA聚合酶复合体(RdRp).利用RNA体外合成试验验证获得的RdRp具有生物学活性.     

猪IgM的分离纯化及其抗血清的制备

经硫酸锌盐析沉淀、Sephadex G-200凝胶过滤层析,分离纯化猪血清中IgM,得到了均一性较好的IgM,用此IgM免疫家兔制备了与IgG、IgA无交叉反应的特异性较强的抗IgM血清。     

鸡产蛋下降综合症病毒快速纯化及其抗血清制备

为研制鸡产蛋下降综合症病毒（ EDS-76）检测用标准抗原及标准多抗血清,以EDS-76国际通用毒株AV-127株为抗原,进行了EDS-76病毒抗原纯化及多抗血清制备。研究表明,经氯仿抽提,并经PEG浓缩处理病毒的尿囊液可获得良好的纯化效果,纯化病毒背景干净,血凝效价达19Log2。以此研制出的鸡抗 EDS-76多抗血清血凝抑制效价达13Log2,间接免疫荧光效价达1∶2000,Western-blot试验分析表明该多抗血清可以识别两个分子大小在50 kD至85 kD之间的蛋白抗原,HI及IFA 试验发现所制备的特异性,多抗血清与12种常见禽病病原（ NDV、AIV-A、ALV-J、ALV、GPV、REV、MDV、IBV、CAV、IBDV、TMUV、REOV）均不反应。本研究建立的快速简便的EDS-76病毒纯化方法以及获得的抗EDS-76多抗血清,为进一步研制EDS-76标准抗原以及标准多抗血清提供了有效的方法与材料。     

家蚕病毒性软化病病毒抗血清的研制及应用

从蚕区农户分离了一株家蚕病毒性软化病病毒,暂命名为BmIFV-CHN001。利用蔗糖密度梯度及差速离心法提纯该病毒,将提纯病毒免疫家兔3次,得到BmIFV抗血清。所制备的抗血清采用琼脂双扩散法检测养蚕农户家蚕样本,调查该病毒病在浙江蚕区的感染现状,调查显示农村饲养家蚕具有较高的感染率。     

禽安卡拉病毒Hexon蛋白多克隆抗体的制备

为进一步建立Ⅰ群血清4型禽腺病毒(FADV-4)的特异性检测方法,根据本实验室分离鉴定的安卡拉病毒的基因组序列,设计针对六邻体蛋白(Hexon)基因的特异性引物,经PCR扩增,连接至p ET-28a中,构建原核表达载体p ET-28a-Hexon。将其转化感受态BL21中,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,SDS-PAGE分析,获得重组蛋白大小为49 ku。Western blot分析纯化后重组蛋白能与FAd V-4阳性血清发生特异性反应。将纯化后的重组蛋白免BALB/c小鼠,制备了六邻体蛋白多克隆抗体,采用间接ELISA方法测定效价表明制备的血清效价大于1∶64 000。     

禽流感病毒NS2蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为制备禽流感病毒(AIV)NS2蛋白的多克隆抗体,本研究将人工合成的NS2基因克隆至表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达His-NS2重组蛋白。SDS-PAGE和western blot试验表明,该重组蛋白获得大量表达,可溶性高,并且具有较好的反应原性。将纯化后的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,并通过间接ELISA检测其效价达1∶20 000以上。Western blot和间接免疫荧光试验显示,多克隆抗体能够与NS2蛋白特异性结合。     

禽流感病毒NP基因的真核表达及抗体检测芯片的建立

为建立一种检测A型禽流感病毒(AIV)抗体的蛋白芯片,本研究以AIV总RNA为模板,RT-PCR方法扩增NP基因,与真核表达载体pFastBacHTa连接,并在昆虫细胞中表达.重组蛋白经纯化及western blot鉴定,点样于醛基包被的载玻片上,制备检测AIV抗体的蛋白芯片.确定芯片反应最佳条件为:点样浓度2 mg/mL,固定24 h,1%BSA进行封闭,一抗稀释度1:100,二抗稀释度1:2000.利用蛋白芯片分别对15个亚型流感病毒免疫血清、SPF鸡血清、抗新城疫病毒血清、抗法氏囊病毒血清和现地血清样品进行检测,通过与血凝抑制试验比较,表明建立的蛋白芯片方法具有良好的灵敏性和特异性,为AIV抗体检测及制备检测AIV不同亚型或多种病原抗体的蛋白芯片提供方法.     

禽流感病毒H9亚型血凝素特异性单克隆抗体的制备和鉴定

以常规方法纯化H9亚型禽流感病毒，制备了两株分泌抗禽流感病毒H9亚型血凝素特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞11A5和1182，其上清ELISA效价均为1：10^4，腹水效价为1：10^7和1：10^6，HI效价上清分别为8、7log2，腹水效价均为15log2。采用HI方法证明其对禽流感病毒H9亚型的特异性，通过Western blot方法证明两株单抗都针对H9亚型禽流感病毒HA1蛋白。     

Evaluation of a competitive ELISA for antibody detection against avian influenza virus

Active serologic surveillance is necessary to control the spread of the avian influenza virus (AIV). In this study, we evaluated a commercially-available cELISA in terms of its ability to detect AIV antibodies in the sera of 3,358 animals from twelve species. cELISA detected antibodies against reference H1- through H15-subtype AIV strains without cross reactivity. Furthermore, the cELISA was able to detect antibodies produced following a challenge of the AIV H9N2 subtype in chickens, or following vaccination of the AIV H9 or H5 subtypes in chickens, ducks and geese. Next, we tested the sensitivity and specificity of the cELISA with sera from twelve different animal species, and compared these results with those obtained by the hemagglutination-inhibition (HI) test, the "gold standard" in AIV sera surveillance, a second commercially-available cELISA (IZS ELISA), or the agar gel precipitation (AGP) test. Compared with the HI test, the sensitivities and specificities of cELISA were 95% and 96% in chicken, 86% and 88% in duck, 97% and 100% in turkey, 100% and 87% in goose, and 91% and 97% in swine, respectively. The sensitivities and specificities of the cELISA in this study were higher than those of IZS ELISA for the duck, turkey, goose, and grey partridge sera samples. The results of AGP test against duck and turkey sera also showed significant correlation with the results of cELISA (R-value >0.9). In terms of flock sensitivity, the cELISA correlated better with the HI test than with commercially-available indirect ELISAs, with 100% flock sensitivity.     

H9亚型禽流感病毒血凝素特异性单因子血清制备

为制备特异性的H9亚型禽流感病毒(AIV)单因子血清,本研究分别将6株不同亚群的H9亚型AIV的血凝素(HA)基因以鸡偏嗜的密码子进行优化,经全基因合成插入高效真核表达载体pCAGGS中,构建的真核重组质粒转染293T细胞进行瞬时表达,间接免疫荧光试验结果表明,重组质粒中的HA目的基因获得表达.将重组质粒以200μg/只的剂量免疫1月龄SPF鸡,6周后采血分离血清.交叉微量血凝抑制试验结果表明,血凝抑制效价可达8 long2～12 log2,灵敏度高,与其他AIV亚型抗原无交叉反应,型特异性强.     

禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体的制备与初步应用

利用提纯的禽脑脊髓炎病毒（AEV）Van Roekel株作为免疫原，免疫6周龄BALB／c小鼠，采取其脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞融合，用间接ELISA法筛选，间接免疫荧光法（IFA）和免疫组织化学法鉴定，经3次亚克隆得到了稳定分泌抗AEV单克隆抗体的杂交瘤细胞株F11和G2，制备了腹水，并利用该单克隆抗体初步建立了Dot—ELISA、间接ELISA和IFA等特异性检测AEV抗原的方法。     

An enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of antibody against avian influenza virus

An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was developed for detecting antibody to type A avian influenza (AI) virus. The sensitivity and group specificity of the AI-ELISA were compared with those of the agar-gel-precipitin test (AGPT) and the hemagglutination-inhibition (HI) test under conditions of both controlled and field exposure. During the course of temporal experimental infection (0-76 days) of specific-pathogen-free (SPF) chickens with AI subtype Hav9N2, the AI-ELISA was able to detect specific AI antibody as early as 8 days postinoculation (PI), and it measured rising levels of antibody through 35 days PI, at which time the chickens were re-exposed to AI virus. Conversely, AGP tests were negative through 35 days PI, and HI tests began to detect low levels of AI antibody only at 21 days PI. Following a secondary infection at 35 days PI with the same AI subtype, all tests measured rising levels of AI-specific antibody (35-76 days PI). However, the AGP test was positive at only the 7- and 14-day samplings postsecondary immunization. Under field conditions, the AI-ELISA was able to detect serum AI antibody in flocks from which highly pathogenic AI was isolated, but the AGP tests of these sera were negative.