甘蔗NBS-LRR类抗病基因同源序列的分离与鉴定

根据已知植物(拟南芥、烟草和亚麻)抗病基因(RGAs)保守序列设计简并引物, 从甘蔗高抗黑穗病品种NCo376的基因组DNA和cDNA中扩增出11条抗病基因同源序列, 其中5条来自基因组DNA(EF059973, EF059974, EF059975, EF059976和EF059977), 6条来自cDNA(EF155648、EF155649、EF155650、EF155651、EF155652和EF155653)。序列分析表明, 这些RGAs均含有典型的NBS-LRR类抗病基因所拥有的保守结构域P-loop, Kinase-2a, Kinase-3a 和疏水结构域。聚类分析表明, 11条RGA同RPS2和XA1聚为一类, 而N和L6则单独聚为一类。所有11条抗病基因同源序列中, kinase-2(LLVLDDVW/D)最后一个氨基酸皆为色氨酸。定量PCR分析表明, 编号为EF059974的PIC基因的表达不仅受黑穗病菌胁迫的影响, 而且受水杨酸的诱导和过氧化氢的抑制, 也具有抗病基因组织特异性和组成型表达特性。     

蓖麻类钙调蛋白基因RcCML42克隆与表达载体构建

为了探究类钙调蛋白基因家族成员在蓖麻体内的作用及表达模式,在蓖麻体内挖掘家族基因CML42,并对其进行克隆与表达分析。以哲蓖三号植株为试验材料,克隆获得RcCML42完整编码区序列(CDS),利用生物信息学方法对RcCML42基因序列进行分析,包括编码氨基酸、蛋白分子量及等电点、跨膜结构域、氨基酸序列一致性等内容。通过荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,检测RcCML42基因在蓖麻植株根、茎、叶位置不同时间点的特异性表达情况。结果显示,RcCML42 CDS长度为597 bp,编码198个氨基酸,含有3个EF-hand钙结合结构域。蛋白分子量为22.27 ku,等电点为4.55,不存在跨膜结构域。氨基酸序列一致性分析表明,RcCML42与巴西橡胶树一致性最高,达86.84%。qRT-PCR结果显示,RcCML42基因在蓖麻根、茎、叶组织中均有表达,在经NaCl处理后,RcCML42在根中的表达量呈现先下降后上升的趋势。RcCML42在茎中12 h高度表达,在叶中为8 h高度表达。且在茎中的表达量显著高于其在根、叶中的表达。CML是植物体内最重要的一类钙感受器,通过与钙调素结合蛋白结合...     

丹参钙调蛋白cDNA的克隆及其反义表达载体的构建

丹参是著名的传统中药,对心血管疾病和癌症有广泛的疗效。钙调蛋白是细胞信号转导途径中的重要蛋白,在各种生理活动中起着重要的作用,其序列比较保守。国内外对中药丹参的分子学研究很少,本文利用分子生物学手段克隆了丹参钙调蛋白基因。从丹参成熟叶片中提取总RNA,cDNA第一链经反转录合成,利用设计的引物,PCR扩增,得到丹参钙调蛋白基因,测定其全序列。在GeneBank进行了注册。其次构建了丹参钙调蛋白基因反义表达载体,以后可进行基因敲除。通过Southern杂交,进行拷贝数推测,丹参钙调蛋白cDNA至少为2个拷贝。序列分析结果表明:得到的丹参钙调蛋白基因具有完整地读码框,由454个核苷酸组成,编码150个氨基酸。与别的植物钙调蛋白基因相比有很高的同源性,核苷酸序列同源性在80%以上,编码的氨基酸序列同源性在80%以上。以上结果能使我们更加深入地研究和了解钙调蛋白。     

UV-B辐射对小麦根茎叶中钙调蛋白含量的影响

以荧光图谱法探讨增强UV-B辐射对钙调蛋白的影响。以8.00kJ/(m2.d)、10.08kJ/(m2.d)、12.00kJ/(m2.d)3种不同剂量UV-B辐射的小麦为材料,经过多次离心、(NH4)2SO4盐析沉淀法、透析法、疏水层析等步骤得到了钙调蛋白的提取液,通过SDS-PAGE测定钙调蛋白的相对分子质量,并检验纯度。结果显示:分离纯化的钙调蛋白分子量为16000左右,电泳图谱为一条带。用荧光分光光度计绘制钙调蛋白的荧光图谱,同时设置多组对照试验。结果显示:根茎叶中钙调蛋白的含量不同,而且增强UV-B辐射后小麦中整体钙调蛋白含量呈现增加趋势,根茎叶中钙调蛋白受到不同的UV-B处理后变化程度不同,茎中钙调蛋白随着UV-B辐射的影响变化最为明显,根中钙调蛋白的变化次之,叶片中钙调蛋白变化最少。     

钙调蛋白在PC12细胞分化和迁移中的作用

PC12 细胞经神经生长因子 (NGF)作用后,利用免疫荧光染色、单个细胞迁移率检测等方法,研究了钙调蛋白在PC12 细胞中的分布以及钙调蛋白对PC12 细胞分化和迁移的影响.免疫荧光染色结果表明,钙调蛋白在PC12细胞突起的顶端处呈密集分布.加入钙调蛋白抑制剂W7的细胞仅有少量长出突起.单个细胞迁移率检测表明钙调蛋白...     

一个小麦ω-醇溶蛋白基因同源序列克隆

The gliadins, which termed 琢,茁,酌and 棕gliadins, are very important to the viscoelastic properties that confer the unique processing properties to weight doughs. In wheat, genes encoding gliadins are highly conserved in terms of chromosomal location and function. The nucleotide sequence of 棕-gliadin gene was cloned by PCR ap-proach from local common wheat cultivar named Jinan 177 (TriticumastivumL.) and has been registered in the GenBank. The sequence has 1440bp length containing 1065 C…     

转ScMV-CP基因甘蔗的分子生物学分析与鉴定

采用改良的CTAB方法提取转基因甘蔗幼苗的基因组DNA,核酸蛋白测定仪分析及凝胶电泳结果表明,提取的DNA具有典型的DNA分子的标准紫外吸收光谱特点,DNA产量为45～60μg／100mg。同时根据质粒载体设计合成了2对引物,分别扩增新霉素磷酸转移酶(nptⅡ)基因和甘蔗花叶病毒外壳蛋白(ScMV-CP)基因。PCR检测结果表明,在53株待检测的样品中有24株同时含有这2种转基因成分,其中13株在Southern杂交中有杂交信号出现,其拷贝数为1～3个。     

狗头枣GSTU基因的克隆及其序列分析

为探索红枣GSTU类基因在红枣抗逆中的分子作用机制,本研究以狗头枣枣树叶片的DNA为模板,根据枣GSTU基因的序列(HM345954.1)设计引物,采用PCR方法获得GSTU基因序列,并利用生物信息学手段对其所对应蛋白的结构域、功能域、理化特性、跨膜区、二级结构及亚细胞定位等进行分析。结果表明:克隆到的DNA序列全长838 bp,具有2个外显子和1个内含子,内含子在292~460 bp碱基处,该序列与GenBank中枣的GSTU核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别为99.85%和100%,表明成功的克隆了狗头枣的GSTU基因。该序列编码222个氨基酸,分子量为25.268 kD,理论等电点(pI)为6.10;亲水性的平均数为-0.242,表明该蛋白是亲水性蛋白。二级结构主要以α-螺旋为主,其次是无规则卷曲,不存在信号肽,表明该蛋白可能为非分泌性蛋白,该蛋白可能位于内质网(膜)和质膜上。本研究获得的狗头枣GSTU基因在基因结构上含有1个内含子,在核酸序列及氨基酸序列上与GenBank中枣的GSTU基因同源性高,并对其理化性质、结构等进行了预测与分析,为进一步研究红枣抗逆分子机制提供理论基础,同时为红枣品种的选育提供理论支持。     

华山新麦草籽粒硬度吲哚蛋白基因的分离与序列分析

采用AS-PCR技术,从华山新麦草基因组DNA中分离获得了其籽粒硬度吲哚蛋白Pina(HM 448475)和Pin b(HM448476)的基因序列.DNA序列分析显示,这2条序列相似性仅为69.25％,它们与小麦、山羊草、黑麦、燕麦和大麦亲缘种属植物等的Pin a和Pin b基因序列具有93％以上的一致性;推导的氨基酸序列分析显示,序列HM 448475(Pin a)和HM 448476(Pin b)都具有籽粒硬度吲哚蛋白基因的19个氨基酸残基组成的信号肽,与脂类易于结合的色氨酸结构域WRWWKWWK( Pin a)或WPTKWWK( Pin b),以及位置固定的10个半胱氨酸残基等典型结构特征,同时,这2条序列与小麦、山羊草等亲缘植物的Pin a和Pin b基因氨基酸相比,分别有15个和8个主要位点的差异;系统进化树分析显示,序列( HM 448475)可能为Pin a基因家族中的一个新类型,而序列(HM 448476)与智利大麦的Hordoindoline b基因具有相对较近的亲缘关系.研究表明,华山新麦草含有与麦类作物差异较大的控制籽粒硬度的等位基因.该研究对保护利用华山新麦草、丰富小麦籽粒硬度基因资源具有一定的理论意义和应用价值.     

甘蔗宿根矮化病菌PCR检测及目的片段核苷酸序列分析

根据甘蔗宿根矮化病（Ratoon Stunting Disease, RSD）病原细菌（Leifsonia xyli subsp. xyli，Lxx）16S-23S rDNA基因间隔区核苷酸序列设计的一对特异性引物，建立了甘蔗宿根矮化病PCR检测方法；同时对PCR扩增的目的片段核苷酸序列进行测定与分析。结果表明广东湛江蔗区RSD病菌16S-23S rDNA基因间隔区核苷酸序列与巴西、澳大利亚及美国路易斯安娜州RSD株系基因组相应区段核苷酸同一率接近100%，病菌高度的同源。而与近缘的木质部赖氏杆菌狗牙根变种（Leifsonia xyli subsp. Cynodontis，Lxc）和形态上相近的马铃薯环腐病菌（Clavibacter michiganensis subsp. Michiganensis）基因组相应区段核苷酸同一率较低，存在明显的分化。     

木薯内标准基因定性PCR方法分析

内标准基因对于转基因植物及其产品的定性定量PCR检测起着决定性的作用,木薯内标准基因的系统研究是木薯转基因成分检测的基础。在木薯的DFCI（http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/plant.html）数据库中,选择了有可能作为木薯内标基因的一些EST序列,包括亲环蛋白2（cyclophilin type 2,DB934316）、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因B亚单位（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase B subunit,TC445）GAPDH、Actin 基因（TC2158与 TC3381的拼接序列）、Alpha-tubulin （TC8072）基因,Polyubiquitin（TC9946）,亚麻苦苷酶 （linamarase,TC1540）六个基因序列,设计了7对定性PCR的引物（CP2、Actin、GAPDH、PUBQ2、Tublinα1、Tublinα2和 LAM1）,并进行了种内一致性、稳定性和种间特异性测试分析。结果表明只有木薯的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因B亚单位的GAPDH定性PCR引物扩增系统在木薯的22个不同品种中都能够得到一致性稳定性的扩增结果,在大戟科其它植物及其它非大戟科植物没有发现非特异性扩增产物。另外六个基因（CP2、Actin、PUBQ2、Tublinα1、Tublinα2和 LAM1）的定性PCR引物扩增系统在大戟科其它植物及非大戟科植物中都有非特异性的扩增产物。因此GAPDH定性PCR引物扩增系统初步符合内标准基因的种内一致性,稳定性,种间特异性的特点,可应用于转基因木薯成分定性PCR检测。     

应用复合PCR检测水稻种子的转基因成分

根据转基因水稻中常用的花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子、胭脂碱合成酶（NoS）终止子、β-葡萄糖苷酸酶基因（GUS）、潮霉素磷酸转移酶基因（Hpt）、新霉素磷酸转移酶基因（Nptn）和Bt毒蛋白基因（Bt Cry 1 Ab）的序列，设计合成6对不同的引物，用简单PCR方法检测了水稻种子中的转基因成分，同时建立应用一班PCR反应同时扩增检测两种或多种外源基因的复合PCR方法。通过对水稻样品进行PCR扩增，分析、比较复合PCR的检测结果与简单PCR的扩增结果。发现两者结果完全一致。表明复合PCR方法不但可以提高检测效率、降低检测成本，还可以有效防止假阳性，是一种值得推广的方法。     

甘蔗中一个NBS-LRR类基因的全长克隆与表达分析

采用RACE技术, 从甘蔗高抗黑穗病品种NCo376中克隆了一个NBS-LRR类基因的cDNA全长序列, 命名为SNLR。生物信息学分析显示, 甘蔗SNLR基因的cDNA全长为2 985 bp (Accession No. EF155654), 包括一个2 661 bp的完整开放读码框以及一个典型的29 bp poly-A。同时, 还具有NBS-LRR类抗病基因的所有保守结构域, 包括4个NBS区域保守结构域和6个潜在LRR结构域;蛋白疏水性分析和二级、三级结构分析表明, 该基因编码的蛋白质为弱碱性蛋白, pI为7.76, 无明显的疏水结构域, 以卷曲结构和螺旋结构为骨架, 三级结构未见明显的跨膜信号蛋白区。定量PCR分析表明, 甘蔗SNLR基因的表达受到黑穗病菌、水杨酸和过氧化氢的影响, 分别表现出“抑-扬”、“全程抑制”和“扬-抑”的表达模式, 也具有抗病基因组成型和组织特异性表达的特点。推测甘蔗SNLR基因可能为抗病相关基因。     

转Cry2A基因抗虫甘蔗植株的培育

Bt基因具有广谱杀虫性,培育转基因抗虫品种为甘蔗病虫害防治提供了新思路。为了检验Cry2A基因对甘蔗螟虫的防治效果,本研究构建了由玉米Ubi启动子驱动的Cry2A基因高效植物表达载体Cry2A-3300,利用农杆菌介导技术,对甘蔗胚性愈伤组织材料进行遗传转化,经过筛选培养及再生培养共得到46株抗性植株。对抗性植株进行PCR扩增检测,15株呈阳性;进一步利用RT-PCR,表明外源基因Cry2A在转录水平上得到有效表达。室内抗虫鉴定的结果表明Cry2A基因可有效抑制害虫的生长,这将有利于后期进行田间防治。     

传染性喉气管炎病毒河南株ILTV-CG GX基因的克隆与序列分析

根据GenBank中收录的鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)GX基因核苷酸序列,设计并合成了1对引物,应用PCR技术扩增ILTV河南株(ILTV-CG)GX基因。将ILTV-CG接种10日龄鸡胚,提取ILTV基因组DNA进行PCR扩增。将回收的PCR产物与pGEM-T Easy载体进行连接,转化JM109感受态细胞,经蓝白斑筛选,对菌液PCR和酶切鉴定为阳性的菌株进行测序。测序结果表明,所克隆的GX基因全长为950 bp,含有一个开放阅读框,编码299个氨基酸的多肽。推导的氨基酸有4个潜在的N-糖基化位点,有11个与二硫键形成有关的半胱氨酸。序列分析表明,克隆的ILTV-CGGX基因与GenBank中发表的ILTV-SA2株GX基因核苷酸同源性为97.2%,变异点为第124位插入1个碱基G,第136位又插入2个碱基C,从而引起该毒株GX基因推导的氨基酸序列在第33位插入1个亮氨酸,还存在多处氨基酸发生变化,氨基酸同源性为95.3%。GX基因的成功克隆为构建ILTVGX基因缺失的病毒活载体奠定基础。     

甘蔗CIPK基因的同源克隆与表达

CIPK(calcineurin B-like-interacting protein kinase)是植物特有一类的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,该蛋白在植物响应逆境胁迫中发挥着重要的作用,尤其与非生物逆境胁迫(干旱、高盐、ABA等)的信号传导密切相关。根据玉米CIPK15基因(EU957447.1,2247 bp)核酸序列保守区域设计1对同源克隆PCR引物,以甘蔗品种崖城05-179的c DNA为模板,通过RT-PCR扩增得到甘蔗CIPK基因的一条全长c DNA序列(Gen Bank登录号为KM114052)。序列分析结果表明,甘蔗Sc CIPK基因全长1782 bp,具有完整的开放阅读框(ORF,91~1631 bp),编码513个氨基酸,该基因具有CIPK基因的2个特征结构域(Kc-like superfamily和AMPKA-C-like superfamily)。生物信息学分析显示该基因编码的蛋白定位于内质网,为可溶性蛋白,不存在信号肽,二级结构元件多为α-螺旋,含有多个保守功能域,主要参与中间代谢。实时定量PCR表达分析表明,该基因表达具有组织特异性,虽在甘蔗各组织中均有表达,但在芽中的表达量最高。该基因在PEG、Na Cl、ABA、SA和Me JA的胁迫诱导过程中,受ABA胁迫后表达量最高,约为对照的5.3倍,推测该基因的表达与甘蔗抗干旱和抗渗透胁迫有关。     

甘蔗CDK基因的cDNA全长克隆与表达分析

植物细胞周期依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,与周期蛋白(Cyclins)协同作用,是重要的细胞周期性调控因子。本研究从甘蔗受花叶病毒侵染的转录组数据库中获得一条与高粱(Sorghum bicolor)CDK基因(Gen Bank登录号为XP_002466536.1)高度同源的Unigene序列,通过RT-PCR扩增获得长度为1799 bp的甘蔗Sc CDK基因(Gen Bank登录号为KR258796)。序列分析显示Sc CDK基因含一个完整的开放阅读框(65~1603 bp),编码512个氨基酸,且具有CDK典型保守结构域,如ATP结合位点、磷酸结合位点及活化环A-loop。此外,生物信息学预测显示该基因编码的蛋白定位于细胞核,为可溶性蛋白,不存在信号肽,二级结构元件多为无规则卷曲,主要参与蛋白翻译。实时荧光定量PCR分析表明,Sc CDK基因的表达具有组织特异性,其在蔗芽上的表达量最高,其次是在蔗肉、蔗根、叶鞘和蔗皮中;在PEG、Na Cl和ABA的胁迫诱导过程中,Sc CDK均表现上调作用,且受ABA胁迫后表达量最高,约为对照组的1.9倍。推测该基因的表达与甘蔗抗干旱和抗渗透胁迫有关,同时受ABA的诱导,参与细胞周期分裂。     

绿脓杆菌ATCC27853外毒素PE40基因的扩增与测序

目的 扩增绿脓杆菌ATCC27853外毒素基因PE40，并对PCR产物进行测序鉴定，为获得用于构建分子导向药物的毒素弹头基因PE40奠定基础。方法 采用PCR技术，以绿脓杆菌ATCC27853基因组DNA为模板，扩增PE40基因并测序。用DNASTAR软件将测得的序列与GenBank中的国际标准产毒株PA103的PE40基因序列进行比较。结果 扩增出目的基因片断，长度为1231bp。测序表明，ATCC27853与PA103核苷酸同源性为98%，产生了7个碱基的突变，突变碱基导致第364位的天冬酰胺变成丝氨酸，第506位的丝氨酸变成色氨酸，第515位的丝氨酸变成甘氨酸。但产生变化的3个氨基酸均不是文献报道中的重要活性位点。结论 产生变化的3个氨基酸不会对PEA的酶活性及细胞毒性产生很大影响，绿脓杆菌ATCC27853的PE40基因可用作分子导向药物的弹头。