贵州马铃薯Y病毒外壳蛋白基因的克隆与遗传分析

本研究从中国贵州不同海拔地区采集感染马铃薯Y病毒(PVY)病害叶片,利用试管捕捉RT-PCR(TC-RT-PCR)方法克隆到长度为804 bp的8个目的片段,序列分析表明为PVY外壳蛋白(PVY-CP)基因.通过与已经发表的PVY-CP基因序列进行比较和遗传分析,并根据PVY的CP基因全长和5'端序列构建系统发育树,结果表明,本研究分离的PVY,7株为O株系,1株为NTN株系.     

灵芝金属硫蛋白基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR和3′-RACE相结合的方法获得了灵芝（Ganoderma lucidum）金属硫蛋白的cDNA序列。该序列全长为315bp,5′-端非翻译区为47bp,3’端非翻译区具有166bp,开放阅读框长度为102bp（包括一个终止密码子）,可编码33个氨基酸。在其编码的氨基酸序列中半胱氨酸（Cys）含量最高,占21.2%,其次是丝氨基酸Ser(S)和丙氨基酸Ala(A),均占12.1%。对其编码的氨基酸序列进行分析发现该序列具有金属硫蛋白的保守序列模式,是金属硫蛋白家族的成员。     

紫杆柽柳cDNA文库构建与硫氧还蛋白基因的克隆

以NaHCO3胁迫的紫杆柽柳(Tamarixandrossowii)为材料建立了cDNA文库。经检测,文库的初始滴度为5.7×105pfu,重组率为96%,插入片段的长度在0.3~3.0kb之间,平均长度为1.2kb,扩增后文库的滴度为4.0×109pfu/ml。对文库克隆进行随机测序,获得了紫杆柽柳的硫氧还蛋白(Thioredoxin)基因序列。生物信息学分析表明获得的硫氧还蛋白基因全长683bp,其中5'非翻译区长56bp,3'非翻译区长204bp,开放读码框长423bp,编码140个氨基酸,蛋白的分子量为15.1kD,理论等电点为5.59,其氨基酸序列中具有硫氧还蛋白的保守活性位点“WCGPC”序列,Clustal分析表明该硫氧还蛋白与蓖麻(Ricinuscommunis)的硫氧还蛋白氨基酸序列同源性高,达65%。本研究构建的cDNA文库为柽柳基因克隆和系统研究柽柳抗逆分子机理奠定了基础。     

柽柳冷适应蛋白基因

冷适应蛋白(CAP)是指生物体受到寒冷刺激后,诱导表达的一类特异蛋白质,由冷诱导有关的基因在冷诱导过程中启动转录和翻译的。低温条件下,冷适应蛋白表达量在持续不断增加,对低温条件下蛋白质合成的调节以及mRNA的折叠起重要作用。是一类重要的与细胞耐寒相关基因。我们从构建的紫杆柽柳(Tamarixandrossowii)cDNA文库中分离得到了冷适应蛋白基因片段,并应用RACE技术获得其全长cDNA序列,该基因cDNA序列长度为1176bp,其中开放读码框(ORF)从49到663碱基位置,长度为615bp,编码204个氨基酸组成的多肽,预测其蛋白质分子量为23kD,预测其理论等电点为9.23。该基因已经在GenBank上注册,其基因序列登录号AY587773,氨基酸序列登录号为AAT01418。该基因的克隆为植物分子育种提供了新的基因资源。     

马铃薯非特异性脂质转移蛋白基因StLTPa1的克隆和表达

非特异性脂质转移蛋白（nsLTP）是植物中大量存在的小分子脂类结合蛋白,具有多种生物学功能,如抗菌防御、信号传导、胞壁松弛、蛋白酶抑制等。通过接种青枯菌（Ralstonia solanacearum）,从马铃薯栽培品种中薯3号中获得一个新的非特异性脂质转移蛋白cDNA克隆StLTPa1,序列分析表明该基因含636bp核苷酸,编码91个氨基酸,属于I类非特异性脂质转移蛋白。基于氨基酸序列构建的系统发生树揭示,该基因与其他茄科nsLTP具有高度保守的序列相似性,核酸和氨基酸水平分别具75%～85%和60%～92%的同源性。对该基因在互作早期基因表达时空性分析表明,StLTPa1基因不仅受病菌的诱导,在不同抗、感病的马铃薯基因型中差异表达,而且受一定浓度外源非生物激发子如水杨酸、茉莉酸和脱落酸的诱导并产生一定时间的持续效应,其诱导表达模式也表现出一定的差异。原位杂交结果显示StLTPa1主要在马铃薯茎、叶维管束系统的韧皮部细胞中表达。这些结果说明StLTPa1基因受病菌和非生物激发子诱导,在植物防御反应中发挥作用。     

小麦脂质转运蛋白cDNA结构及相应肽链构造特征的分析

根据测序获得的1条261 bp cDNA片段,通过电子延伸、设计引物,从小麦Mardler/7*百农3217(Pm2)的cDNA中扩增获得1条651 bp的cDNA片段,通过同源比对发现其包含小麦LTP1 完整的编码序列.该片段包含基因的5'非翻译区42 bp,3'非翻译区261 bp,开放阅读框348 bp,编码115个氨基酸.预计蛋白的分子量为11.2 kD,等电点为9.46.此基因有8个位置保守的半胱氨酸(C)残基及25个氨基酸的信号肽,为典型的植物脂质转运蛋白基因.其基因序列数据库(GenBank)登录号为AY796184(基因)和AAV65513(蛋白).通过疏/亲水性分析,发现肽链分子具有较大范围的疏水面.     

疣粒野生稻金属硫蛋白(OMMT-2)基因的获得及序列分析

从疣粒野生稻叶片cDNA文库中分离出1个金属硫蛋白基因的cDNA序列,命名为OMMT-2。该基因全长532bp,其中5’非翻译区为111bp,3’非翻译区171bp,开放阅读框长249bp,编码82个氨基酸,该蛋白的分子量为7775.9,理论等电点为6.49;基因编码的氨基酸含有14个半胱氨酸(Cys),占了总氨基酸的17.07%,且集中分布在肽链的N端和C端,呈CXC和CXXC排列方式。疏水性分析表明,该蛋白在43~56个氨基酸之间有较强的疏水区。通过氨基酸序列分析表明,金属硫蛋白中半胱氨酸的位置和数目有较强的保守性,揭示了半胱氨酸对金属硫蛋白的功能十分重要。     

猪嵴病毒福建株结构蛋白VP 基因的克隆与生物信息学分析

为丰富猪嵴病毒结构的分子流行病学数据,明确福建株猪嵴病毒结构蛋白VP的特征,研究运用RT-PCR方法设计特异性引物,对猪嵴病毒结构蛋白进行分段扩增后进行克隆测序,并将测序结果进行拼接后进行生物信息学分析。结果表明,所扩增福建株猪嵴病毒含有完整的结构蛋白VP,其基因全长为2529 bp,编码有843个氨基酸,理论等电点为5.34,理论分子质量为89.603 kD,不稳定系数为37.71,最大疏水指数为2.522,最小疏水指数为-2.622。其和XX株猪嵴病毒结构蛋白核苷酸同源性最高,仅为86.7%,与swine/S-1-HUN/2007/Hungary株猪嵴病毒结构蛋白核苷酸同源性最低,为83.7%。从遗传进化上看,猪嵴病毒结构蛋白在遗传进化上呈现2个独立的分支,中国猪嵴病毒分离株在2个遗传分支上均有分布。     

玉米醇溶蛋白γ-zein基因载体构建及亚细胞定位

用PCR方法从pROK.TG1LK扩增得到γ-zein基因的全长,克隆到中间载体pMD18-T,获得了重组质粒pMD18-γ-zein,分别用Nco Ⅰ和Bgl Ⅱ 2种限制性内切酶酶切重组质粒和经过改良的pCAMBIAI 1302载体,经回收、连接、转化、鉴定后,构建了由35S驱动的绿色荧光蛋白(GFP)融合的植物表...     

多抗马铃薯病毒及类病毒的amiRNA双元表达载体的构建及遗传转化

马铃薯病毒及类病毒病害严重影响了中国马铃薯的生产。为了培育抗病毒及类病毒的马铃薯新材料,本研究采用人工miRNA(artificial microRNA,amiRNA)策略,以马铃薯X病毒(potato virus X,PVX)与马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)编码沉默抑制子P25蛋白和HC-pro蛋白的基因为靶标,利用5'RACE技术对P25基因、HC-Pro基因潜在的剪切热点进行预测。再采用overlapping PCR技术,以拟南芥mi R159a前体为骨架,设计特异性引物,构建分别靶向P25和HC-Pro基因的amiRNA表达载体。同时构建靶向马铃薯内源基因Virp1的amiRNA表达载体,将构建完成的三个amiRNA表达载体串联获得amiRNAs三联体,分别转入根癌农杆菌菌株EHA105,并用农杆菌介导法转化马铃薯品种克新13。经PCR鉴定,结果表明,目的基因片段已成功转入马铃薯中。     

犬瘟热病毒Lederle株H,N全基因序列分析及表达研究

采用RT-PCR方法自犬瘟热病毒Lederle株基因组RNA中扩增出H基因(1 911 bp)和N基因(1 707 bp)片段,序列测定和分析表明与Onderstepoort株、CDV3株等疫苗毒株的同源性在95%以上,而与野外分离株的同源性介于90%～95%;以获得的H,N全基因片段为模板,分别扩增H基因近3′端996 bp的基因片段以及N基因中间高度保守区562 bp的基因片段,经克隆测序后分别插入原核表达载体pET-32a中进行表达,结果显示H片段和N片段分别表达大小约为57 kD和37 kD的融合蛋白,Western blotting检测结果显示,表达蛋白均可与CDV抗血清发生阳性反应,提示原核表达产物具有与CDV抗血清结合的免疫反应性。     

草莓轻型黄边病毒CP基因的克隆、序列分析及原核表达

克隆草莓轻型黄边病毒CP基因,并构建其原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达CP蛋白。利用SMYEV的检测引物,通过RT-PCR技术筛选带SMYEV的草莓植株;根据NCBI中SMYEV序列设计扩增CP基因全长引物,通过RT-PCR获得SMYEV沈阳分离物CP基因全长序列;将CP基因克隆到原核表达pGEX-6P-1上,利用IPTG诱导CP基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达蛋白。利用RT-PCR扩增获得SMYEV分离物SY05的CP基因全长序列,由729个核苷酸组成,编码242个氨基酸残基。SY05与其他SMYEV分离物的核苷酸同源性为80.1%～97.4%,氨基酸同源性为92.1%～99.6%,其中,与SMYEV分离物SY03的氨基酸一致性为98.3%。将SY05的CP基因成功克隆到原核表达载体pGEX-6P-1上,构建了重组表达载体p6P-EV-CP,并将其导入大肠杆菌BL21(DE3)中。SDS-PAGE分析表明,IPTG诱导SMYEV分离物SY05的CP基因在大肠杆菌中表达出分子量为52.0 kDa的融合蛋白。克隆出SMYEV分离物SY05的CP基因,实现了其在原核细胞中的表达,为SMYEV抗血清的制备奠定了重要基础。     

双重检测马铃薯X和Y病毒试纸条制备技术研究

为了实现在马铃薯种薯生产田现场同时快速检测马铃薯X（PVX）和Y病毒（PVY）,利用胶体金标记和免疫层析技术研制了PVX-PVY双重检测试纸条。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,在波长526nm处有最大吸收值,金颗粒直径约25nm。同时标记PVX和PVY兔多克隆抗体,将抗体标记物喷射于玻璃纤维纸上,作为金标垫。将PVX和PVY抗体分别划线于硝酸纤维素膜上作为检测线,将羊抗兔抗体划线于硝酸纤维素膜上作为质控线,制备胶体金试纸条。结果表明,研制的双重试纸条能够在2min之内同时检出PVX和PVY。PVX病汁液检测稀释限度可达10⁶倍（W/V）,PVY可达10⁵倍（W/V）,其中对PVX检测更灵敏。用其他4种常见病毒（PVS、PLRV、PVA和PVM）检测,未出现交叉反应。在田间采集马铃薯叶片,分别利用试纸条与DAS-ELISA检测,结果一致性非常高。由此可知,该试纸条具有操作简便、反应快捷的特点,特别适用于田间及口岸一线对于马铃薯X和Y病毒的同时检测。     

新城疫病毒La Sota株HN基因的克隆与序列分析

旨在从分子生物学角度进一步研究新城疫病毒La Sota株HN基因,探究NDV La Sota HN基因的遗传变异情况。研究以试验室冻存的p NDV-HN为模版,根据Gen Bank中登录的NDV La Sota株序列设计引物扩增HN基因,将其克隆到pMD18-T载体后进行鉴定,对鉴定正确的重组质粒p MD-NDV-HN进行测序分析。应用生物信息学软件对新城疫病毒Lasota株HN基因进行系统进化树分析、氨基酸序列同源性分析、糖基化位点、蛋白结构跨膜区分析及磷酸化位点预测分析。核苷酸序列测定结果表明:HN基因的序列长度为1743bp,该基因的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)总长为1716 bp,编码571个氨基酸。生物信息学表明:试验获得的HN基因具有6个潜在糖基化位点及12个半胱氨酸残基,第5个潜在糖基化位点(508-510 aa)发生缺失及第123位半胱氨酸残基被色氨酸残基取代。La Sota株HN基因编码的蛋白质中有29个丝氨酸、10个酪氨酸和16个苏氨酸可能成为蛋白激酶磷酸化位点。将试验获得的La Sota株HN基因序列和推导的氨基酸序列与新城疫毒株的HN基因相应序列比较后发现,它们的核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性最高均可达到99%,表明HN基因在种属间具有较高的保守性。研究为新城疫病毒的分子病毒学研究奠定了基础。     

H5N1型禽流感病毒HA基因克隆及序列分析

为从分子生物学角度进一步研究H5N1型禽流感主要抗原HA基因,探究H5N1 HA基因的遗传变异情况及其蛋白结构,根据GenBank中登录的H5N1型禽流感HA基因的序列利用Primer 5.0设计引物扩增HA基因,将其克隆到pMD18-T载体后进行鉴定,对鉴定正确的重组质粒pMD-H5N1-HA进行测序分析。应用生物信息学软件对禽流感病毒HA基因进行系统进化树分析、氨基酸序列同源性分析、保守区分析,磷酸化位点和序列重复区分析及HA蛋白二级、三级结构的预测。核苷酸序列测定结果表明：HA基因长1661 bp,共编码326个氨基酸;生物信息学分析结果表明：HA基因在种间具有较高保守性,HA基因的氨基酸序列与其他地方性禽流感H5N1病毒株HA基因的序列同源性最高可达99.7%,且为高致病性毒株;HA蛋白的二级、三级结构预测结果显示：HA蛋白多为α螺旋和β转角结构,无规则卷曲,是亲水性蛋白。该结果为禽流感病毒的分子病毒学研究奠定了基础。     

一步法RT-PCR和两步法RT-PCR对马铃薯病毒诊断研究的比较

本研究采用试剂盒和Total试剂两种方法从马铃薯叶片和茎秆中提取总RNA,同时设计了一步法RT-PCR和两步法RT-PCR的反应体系,依据马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯S病毒、马铃薯A病毒以及马铃薯卷叶病毒的基因组RNA保守序列设计特异性引物对,并运用两种RT-PCR反应体系对染病的马铃薯进行病毒检测,结果与报道的这五种马铃薯病毒核苷酸序列进行BLAST比对, 表明扩增的五种马铃薯病毒靶带的序列与靶序列完全一致。两种诊断方法对马铃薯病毒核酸进行浓度检测,结果证明,两步法RT-PCR具有较高灵敏性。但这两种方法均可快速、简便、有效地诊断马铃薯病毒。     

李矮缩病毒外壳蛋白基因克隆及原核表达研究

为制备李矮缩病毒(Prunus dwarf virus, PDV)抗血清,克隆PDV外壳蛋白(CP)基因,构建原核表达载体,优化蛋白表达条件。以阳性感病甜樱桃叶片为试验材料,提取总RNA,根据PDV CP基因(L28145.1)设计特异引物,RT-PCR方法扩增,克隆、测序,构建原核表达载体pET30a-PDVCP,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株表达。PDV CP基因（Genbank登录号：JF333587.1）全长657 bp,编码217个氨基酸,与GenBank其他PDV分离物CP基因核苷酸序列的同源性为89.2%~93.9%,推导的氨基酸序列同源性为97%~99%。根据完整CP基因核苷酸序列构建系统进化树显示：12个PDV分离物可分为3组,泰安分离物与巴西、土耳其等分离物属于Ⅰ组。成功构建原核表达载体pET30a-PDVCP,并在体外条件下诱导表达出融合蛋白。转pET30a-PDVCP载体的大肠杆菌BL21（DE3）菌株表达分子量约24 kDa的重组蛋白。该重组蛋白在30℃,1.0 mmol/L IPTG、诱导4 h表达量最大。     

锦鲤疱疹病毒ORFl基因的克隆、表达及多克隆抗体的制备

为了进行锦鲤疱疹病毒（Koi Herpesvirus Virus,KHV）诊断方法、疫苗研制和蛋白功能研究。通过选择基因保守性极强的ORFl基因作为研究对象,设计1对特异性引物进行PCR克隆。目的基因与表达载体PET构建重组质粒,将重组质粒转化大肠杆菌E．coliBL21（DE3）后诱导表达,再将成功表达的目的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。PCR产物经电泳显示,所扩增的基因长度774bp,与目的基因长度相符。蛋白表达产物经SDS．PAGE和Western-bolt检测,重组表达质粒K1-PET成功诱导表达,表达蛋白为37．3KD,为包涵体。免疫小鼠获得多克隆抗体,经酶联免疫检测发现其效价达到1：27000。表明表达出的目的蛋白具有免疫原性,实验获得的表达蛋白和多抗血清为KHV的疫苗研制和免疫学检测方法的建立奠定了基础。     

樱桃病毒A外壳蛋白基因克隆及其原核表达

为制备樱桃病毒A(Cherry virus A,CVA)抗血清,克隆CVA外壳蛋白基因(CP),构建原核表达载体,优化蛋白表达条件。根据CVA全基因组序列(NC_003689.1)设计特异引物,RT-PCR方法扩增CVA外壳蛋白基因,克隆、测序,构建原核表达载体pET30a-CVACP,转化大肠杆菌BL21(DE3)株系,采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达。序列分析显示,该区段长为603 bp,编码201个氨基酸,与法国分离物PF(HQ267856.1)的同源性为96.8%,与印度分离物JKSPMi-5(FN669548.1)同源性为86.3%。成功构建了原核表达载体pET30a-CVACP,SDS-PAGE电泳分析显示,转pET30a-CVACP载体的BL21(DE3)菌株表达分子量约24 kDa的重组蛋白,该重组蛋白在37℃、1.5 mmol/L IPTG、诱导4 h条件下表达量最大。     

禽流感病毒H9亚型HN31株NS基因

为克隆和分析禽流感病毒（H9亚型）HN31株的NS基因的分子特征,通过RT-PCR方法扩增其NS基因,PCR产物与载体pMD19-T Vector连接,转化大肠杆菌DH5α,经蓝白斑筛选,调取阳性菌落,摇菌过夜,提取质粒进行PCR鉴定和酶切鉴定,送阳性重组质粒测序。结果显示RT-PCR产物大小为919 bp,HN31株的NS基因长度为890 bp;其与H6、H9亚型的A型流感病毒的亲缘关系比H5、H7、H3、H1亚型流感病毒更近。