乳酸菌表面表达PEDV S1蛋白的研究

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)可引起猪的急性腹泻和脱水,具有较高的致死率.为了研究基因工程疫苗来预防此病,从pQE-S质粒为模板,PCR扩增了PEDV抗原决定簇基因片段sl基因,并将其克隆到大肠杆菌中.克隆质粒鉴定后,将其连接到pLA载体上,并转化到干酪乳杆菌中,用SDS-PAGE和Western blot方法进行了鉴定.实验结果显示,S1蛋白可在干酪乳杆菌中正确表达,并为PEDV抗血清所识别.     

表达PEDV-S1蛋白的重组枯草芽孢杆菌构建及鉴定

猪流行性腹泻病毒(PEDV)可引起新生仔猪严重腹泻和死亡,给养猪业造成巨大经济损失。根据枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)调节动物胃肠道菌群平衡的功能和结构特征,选择其作为PEDV S1蛋白表达的宿主菌,构建重组基因工程枯草芽孢杆菌。实验将重组质粒p LA-PEDV-S1电转至枯草芽孢杆菌,提取枯草芽孢杆菌的重组质粒,采用PCR、Western blot和免疫荧光方法鉴定阳性质粒DNA。获得了重组pLA-PEDV-S1/B.Subtilis,S1蛋白成功展示表达在菌体表面,重组PEDV S1蛋白能够和猪源PEDV阳性血清结合,具有反应原性。该重组菌可能成为预防PEDV感染的口服疫苗候选菌株。     

共表达ETEC K99、K88菌毛蛋白重组干酪乳杆菌的构建

将PCR扩增的K99和K88-LTB基因片段串联插入到干酪乳杆菌细胞表面表达载体pLA中,构建了重组表达载体pLA-K99-K88-LTB,将其电转化干酪乳杆菌CICC 6 105,获得了表达融合蛋白pLA-K99-K88-LTB的重组干酪乳杆菌表达系统.重组干酪乳杆菌在MRS培养基中表达后,经SDS-PAGE检测,约...     

变异猪流行性腹泻病毒M和N双基因融合真核表达及其活性鉴定

[目的]体外表达变异猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M-N双基因融合蛋白并明确其生物活性,为开展PEDV新型疫苗及其诊断技术研究提供更多的候选蛋白.[方法]将变异PEDV的M基因克隆至pEASY-Blunt M2(pM2)真核表达载体构建pM2-M真核质粒,通过同源重组将N基因克隆至M2-M基因片段构建pM2-M-N双基因融合重组质粒,然后转染293T细胞表达出M-N双基因融合蛋白.通过Western blotting、ELISA及免疫BLAB/c小鼠试验鉴定表达融合蛋白的生物学活性.[结果]扩增获得的M基因、N基因片段大小分别为678和1359 bp,且与原序列的相似性均达100.0%.将M基因和N基因并连接至pM2真核表达载体成功构建获得pM2-M-N双基因融合重组质粒,M-N双基因片段大小为2004 bp,且与原序列的相似性为99.3%.以pM2-M-N双基因融合重组质粒转染239T细胞,表达出大小约75 kD且具有免疫活性的M-N双基因融合蛋白,纯化的M-N双基因融合蛋白能与PEDV阳性血清反应,与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等病毒均无交叉反应;以其免疫BLAB/c小鼠能诱导产生特异性抗体.[结论]通过pM2真核表达载体能构建获得变异PEDV毒株的pM2-M-N融合双基因重组质粒,转染293T细胞后可表达出具有良好免疫活性的M-N双基因融合蛋白,为后期开展变异PEDV基因工程疫苗及其诊断技术研究提供更多的候选蛋白.     

猪乳铁蛋白基因的克隆及其重组乳酸菌表达系统构建

根据猪乳铁蛋白N端基因序列及表达载体质粒的基因融合特点,设计一对引物,以泌乳3日龄母猪乳腺组织RNA为模板,进行RT-PCR,获得含有猪乳铁蛋白基因N端1 077 bp目的片段,将其与表达载体质粒pPG612.1进行连接,通过转化进入宿主菌JM109细胞内,通过质粒提取、PCR鉴定、酶切鉴定和序列测定分析,表明猪乳铁蛋白N端PLFN基因已成功插入到表达载体质粒中,获得了猪乳铁蛋白干酪乳杆菌表达载体质粒pPG612-PLFN。将获得的重组质粒再分别电转化入干酪乳杆菌ATCC393、植物乳杆菌KLDS1.0344、副干酪乳杆菌KLDS1.0652及戊糖乳杆菌KLDS1.0413中,获得表达猪乳铁蛋白基因的多种重组乳酸菌分别为pPG612-PLFN/L.casei,pPG612-PLFN/L.plantarum,pPG612-PLFN/L.paracasei和pPG612-PLFN/L.pentosus.,为猪乳铁蛋白的乳酸菌表达及重组乳酸菌抗菌制剂的制备奠定了基础。     

干酪乳杆菌表面展示IBDV VP2蛋白

旨在利用pLA载体将IBDV B87株VP2蛋白展示在干酪乳杆菌表面。首先通过RT-PCR扩增VP2基因片段,测序鉴定正确后,将目的片段构建在pLA穿梭质粒上,命名为pLA-VP2,然后将重组质粒电转化到干酪乳杆菌中,构建IBDV重组干酪乳杆菌。应用SDS-PAGE检测重组菌表达目的蛋白VP2,得到约90 kDa的融合蛋白,与预期结果相符。Western blot结果显示VP2蛋白可以与抗IBDV多抗血清发生特异性反应,具有很好反应原性。流式细胞仪的散射光检测器可以捕捉到pLA-VP2重组菌菌体表面的荧光,且重组菌荧光强度强于pLA菌对照组,应用正态分布函数计算pgsA-VP2融合蛋白的表达效率,约为80%。结果表明IBDV VP2蛋白成功展示在干酪乳杆菌表面。     

表达PEDV S蛋白重组仙台病毒的构建及其免疫原性研究

为构建表达猪流行性腹泻病毒(PEDV) S蛋白的重组仙台病毒(SeV),并评价其诱导的特异性免疫应答反应,利用PCR扩增得到PEDV中国流行株的全长S基因,构建含S基因的重组仙台病毒感染性克隆质粒(pBeloBAC-SeV-PEDV-S),并拯救重组病毒SeV-PEDV-S。对重组病毒进行鉴定并测定其生长曲线以确定成功获得表达PEDV S蛋白的重组仙台病毒。将表达S蛋白的仙台病毒免疫小鼠;间接免疫荧光和Western blot试验检测血清中特异性抗体的产生;利用脾脏淋巴细胞分离和流式细胞技术检测特异性T淋巴细胞增殖反应;对血清中的中和抗体效价进行评价。结果表明：重组仙台病毒能特异性表达PEDV S蛋白,且与野生型仙台病毒有一致的生长曲线;免疫小鼠后,重组仙台病毒能有效刺激小鼠产生特异性抗体,诱导较高的中和抗体水平,且能显著促进PEDV特异性T淋巴细胞增殖。综上,该试验为进一步研究重组仙台病毒在猪体上的免疫反应奠定了基础,也为新一代安全有效的PEDV活载体疫苗的研发提供了策略。     

人表皮生长因子融合蛋白在干酪乳杆菌中的表达

以干酪乳杆菌作为传递载体,构建表达人表皮生长因子的重组干酪乳杆菌,探讨原位表达特定蛋白的可行性。采用SOE PCR合成人表皮生长因子序列,克隆到干酪乳杆菌表达载体pELWH,构建pELWHhEGF重组质粒,将该质粒电转化干酪乳杆菌宿主,采用Western blot及间接免疫荧光检测目的蛋白的表达,并通过细胞增殖实验验证目的蛋白的生物学活性。结果表明:在重组菌的细胞表面及培养液上清中均检测到SlpA-hEGF融合蛋白,分子质量约55ku;细胞增殖实验显示SlpA-hEGF融合蛋白及干酪乳杆菌上清均能显著促进NIH/3T3细胞的增殖。     

猪流行性腹泻病毒coe基因的克隆表达及卵黄抗体的制备

通过RT-PCR技术扩增猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)coe基因,将其克隆至原核表达载体p ET32a中,构建重组表达质粒p ET32a-coe,鉴定正确后进行诱导表达。结果表明,重组菌可表达相对分子量约为33 k D的融合蛋白;Western-Blotting结果显示,COE蛋白能与抗PEDV的阳性血清发生特异性结合反应,表明研究的COE蛋白具有良好的反应原性。纯化后的COE蛋白与弗氏佐剂按比率混合作为免疫抗原,免疫产蛋鸡,获得特异性抗猪流性腹泻病毒COE蛋白的卵黄抗体(Ig Y)。氯仿抽提法提取卵黄抗体,通过SDSPAGE、Western-Blotting对提取的卵黄抗体进行鉴定并用间接酶联免疫吸附实验(ELISA)对其进行效价检测。结果显示,纯化后的卵黄抗体Ig Y具有高度的特异性,其抗体效价可达1∶1 000。研究结果表明,表达的COE蛋白具有良好的免疫原性,作为免疫抗原制备的卵黄抗体具有较高的抗体效价。     

PEDV nsp15基因真核表达载体的构建及蛋白的表达

猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）含有一种名为Nsp15的非结构蛋白，为了研究Nsp15蛋白在侵染宿主细胞时产生的作用，成功构建了PEDV Nsp15基因的真核表达载体。通过PCR技术扩增Nsp15基因片段，经双酶切连接到pCMV-Myc载体上，酶切鉴定及测序结果证实PEDV Nsp15基因成功克隆到pCMV-Myc载体中，并将重组质粒命名为p CMV-Myc-Nsp15。将重组质粒pCMV-Myc-Nsp15转染至IPEC-J2细胞中，利用Western Blot和间接免疫荧光技术检测pCMV-Myc-Nsp15的表达以及定位情况。结果显示，pCMV-Myc-Nsp15在IPEC-J2细胞中成功表达，并且在胞质胞核均匀分布。为进一步研究PEDV Nsp15蛋白的功能奠定基础。