里氏木霉木聚糖酶基因Ⅱ在毕赤酵母中的分泌表达及其酶学性质研究

利用RT-PCR技术从高产木聚糖酶菌株T. reesei Rut C-30中成功扩增出其主要木聚糖酶基因XynⅡ,经序列分析证实,在该菌株诱变选育过程中其成熟肽序列有两处碱基发生突变;将不带原基因信号肽的XynⅡ克隆到毕赤酵母高效表达载体pPICZαA上,线性化后经电击转化到毕赤酵母中,经Zeocin及PCR筛选后得到的转化子用1%甲醇诱导。SDS-PAGE证实,重组子实现了分泌表达,且发酵上清中几无杂蛋白;对该重组酶酶学性质分析表明,该酶最适反应温度为60℃,最适反应pH值为6.0,该酶热稳定性较好,在50℃下保温30 min仍能保留其95%以上活性。     

里氏木霉RUT-C30内切β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的分泌表达

摘要：以里氏木霉（Trichoderma reesei）RNA为模板，采用RT-PCR扩增的方法获得不带自身信号肽man1基因的cDNA片段。构建了重组表达载体pPIC9K-man1，重组质粒SacⅠ线性化后用PEG（聚乙二醇）法导入毕赤酵母Pichia pastoris菌株GS115中，通过PCR和表型鉴定表明man1基因已经整合到毕赤酵母染色体上。经大量筛选，获得高效分泌表达甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株RMAN23。将此菌株在5L发酵罐中进行高密度发酵，测定酶活最高达470IU /mL，同时对重组甘露聚糖酶的性质进行了初步研究。     

一种绿色木霉纤维素内切酶基因的克隆及其定点突变对酶活力的影响

纤维素资源是地球上最丰富的可再生资源,纤维素酶的酶活力和生产成本制约着纤维素的利用.本研究从多年户外放置的朽木(Populus bonatii)中分离出一株真菌G-1,经18S rDNA序列分析鉴定为绿色木霉(Trichoderma viride).从G-1中分离出一种纤维素内切酶基因(endoglucanase,EG;GenBank登录号:HM116999.1).通过重叠引物延伸法对EG进行定点突变,得到一个突变序列EG-mut,将EG和EG-mut分别插入分泌型表达载体pPIC9K,并导入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris),筛选到两个菌株,经刚果红染色和DNS法对酶活性测定,显示其内切酶的活性分别达到20.915 U/mL和24.110 U/mL,酶活力高于本实验中得到的其它重组菌株.结果表明某些定点突变可以揭示影响酶活的重要功能域.     

绿色木霉葡聚糖内切酶Ⅰ基因的定点突变及酶学性质的研究

将绿色木霉葡聚糖内切酶EGⅠ基因eg1亚克隆到表达载体pSE380,构建出重组质粒pSE380-eg1,转化到大肠杆菌JM109中表达,利用金属亲和层析对EGI进行纯化,纯化后的酶比活力达到3.8U/mg,其最适反应温度为48℃,最适pH为5.2。同时对EGⅠ的氨基酸残基G291位进行随机定点突变,筛选到一株突变酶G291S,其比活力为野生酶的2.2倍,Km值为野生酶的0.66倍,最适反应温度和最适反应pH值未发生改变。     

哈茨木霉A25-2纤维二糖水解酶I基因的克隆及其编码催化功能域的序列在绿色木酶HP35-3中的表达

本研究从哈茨木霉（rrichoderma harzianMm）A25—2总RNA中利用RT—PCR的方法扩增到其纤维二糖水解酶I基因的cDNA序列,并对该基因编码的氨基酸序列进行分析,得到cbhI基因中编码催化功能域的序列。将催化功能域编码序列克隆到表达载体pCP—GH中,用PEG—CaCl2介导的原生质体转化方法将重组质粒转化到绿色木霉（Trichoderma viride）HP35—3中,筛选得到12个转化子。以P-NPC为底物,测定了该12个转化子的酶活力,获得比活力最高的转化子Tv／CDHI-CBM-5,其纤维二糖水解酶活力是HP35—3的3．8倍。SDS—PAGE分析表明,绿色木霉表达了导入的含A25—2纤维二糖水解酶I催化功能域的编码序列。