弓形虫棒状蛋白ROP54编码基因的生物信息学分析及原核表达

为了能够获得刚地弓形虫RH株棒状蛋白ROP54的重组蛋白,本研究进行了弓形虫RH株ROP54蛋白编码基因的生物信息分析及原核表达。运用RT-PCR方法扩增刚地弓形虫RH株ROP54蛋白编码基因序列,并连接至pMD-18-T载体,构建出克隆质粒pMD-ROP54后,转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中,测序后对基因序列进行生物信息分析。将pMD-ROP54及pET-28a经双酶切及连接,构建出原核表达质粒pET-ROP54,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况,Western blot鉴定重组蛋白的反应原性。结果显示,成功扩增出长度约1 440 bp的ROP54蛋白编码基因序列。生物信息学分析显示,测序结果与刚地弓形虫M49株比对同源性为99%。预测ROP54蛋白氨基酸序列1至26个氨基酸为信号肽,亲/疏水性最小值是-2.978,最大值是2.700。成功构建了原核表达质粒pET-ROP54,IPTG诱导后经,SDS-PAGE结果可见约52.94 kDa大小的蛋白表达,且能够被犬抗弓形虫血清识别,具有良好的反应原性。本研究成功...     

弓形虫微线体蛋白MIC3基因的克隆及原核表达

根据编码MIC3的已知基因序列设计并合成一对引物,应用PCR技术从弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码MIC3的全长基因,克隆入pGEX-KG表达载体,转化入E.coli DH5α感受态细胞,经含氨苄青霉素琼脂平板筛选,小量抽提质粒进行酶切、PCR及DNA测序鉴定.然后阳性重组质粒转化入E.coli BL21-CodonPlus,IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定.结果显示,扩增的MIC3基因与GenBank中相应基因序列（AJ132530）的同源性达99.6 %,表达的MIC3融合蛋白表观分子量约为66 ku,且可被兔抗弓形虫免疫血清识别.说明所获得的表达蛋白质具有一定的反应原性,为下一步利用重组蛋白建立弓形虫的诊断方法和研制弓形虫的亚单位疫苗奠定了基础.     

猪Ghrelin基因的克隆及原核表达

从猪下丘脑、胃等组织中提取总RNA，根据已发表的猪的Ghrelin mRNA序列设计合成引物，通过RT-PCR进行cDNA扩增，获得了282bp的片段。将该片段克隆于pMD-18T载体后进行序列分析，确认PCR产物为Ghrelin cDNA。从阳性克隆中提取质粒，经NheⅠ和XhoⅠ双酶切，回收282bp的目的片段，定向克隆到pET-28a表达载体中，提取质粒并再次转化到BL21（DE3）中，成功地筛选出阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌，通过SDS-PAGE检测出猪Ghrelin基因的表达．     

梅花鹿colX基因的克隆及原核表达

提取健康梅花鹿鹿茸肥大软骨细胞总RNA,以RT-PCR获得colX基因2 038 bp的完整编码序列,将其克隆入载体pMD18-T中,经限制性内切酶和质粒PCR分析,并测序证实的阳性重组子与表达载体pET-28a( )连接,转化大肠杆菌BL21(DE3)。以IPTG诱导,经SDS-PAGE及Western-blot分析表明,获得相对分子质量为65 000的colX蛋白表达带,与预期相符,表明成功获得梅花鹿colX基因蛋白。     

牛抵抗素基因的克隆及原核表达

从健康新生牛大网膜脂肪组织中提取总RNA,根据已发表的牛Resistin mRNA序列设计、合成引物,通过RT-PCR进行cDNA扩增,获得了343 bp的片段。将该片段克隆于pMD18-T载体后进行序列分析,确认PCR产物为牛Resistin cDNA。从阳性克隆中提取质粒,经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,回收343 bp的目的片段,定向克隆到pGEX-6P-1表达载体中,提取质粒并再次转化到BL21(DE3)中,成功地筛选出阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌,通过SDS-PAGE检测出牛的Resistin基因的表达。     

弓形虫MIC3基因真核表达质粒的构建及在 IBRS-2细胞内的表达

采用PCR技术从弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码MIC3的基因,克隆入pMD18-T载体,转化至E.coliDH5α感受态细胞,经抗性平板筛选、小量抽提质粒进行酶切、PCR及DNA测序鉴定后,亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1。然后筛选含有目的基因的重组质粒,并转染IBRS-2细胞,在G418压力下进行筛选,利用SDS-PAGE、Western blot和ELISA检测表达情况。结果显示,扩增的MIC3基因与GenBank上相应基因序列(AJ132530)的一致性达99.9%,构建的真核表达质粒pcMIC3能在转染的IBRS-2细胞中表达分子量约为39.2ku的MIC3,且表达的蛋白质具有良好的免疫活性,为进一步研究该质粒的动物免疫试验奠定了基础。     

人SOD基因的克隆与原核表达

超氧化物歧化酶(SOD)是机体内超氧自由基的天然清除剂,在抗衰老、抗辐射、抗逆境,消炎、抑制肿瘤和癌症,以及自身免疫疾病的治疗方面有很重要的作用。我国目前主要从血液中提取SOD,有关重组人SOD的研究较少。文章通过RT-PCR方法克隆得到人SOD基因,并成功构建其原核表达载体pET-16b-SOD,为通过基因重组技术生产人SOD创造了条件。     

刚地弓形虫丝裂原活化蛋白激酶1基因克隆、表达及抗原性分析

克隆、表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)丝裂原活化蛋白激酶1(TgMAPK1)基因片段,并分析其抗原性。提取弓形虫GT1株速殖子总RNA,逆转录合成cDNA。RT-PCR扩增TgMAPK1基因。扩增产物经双酶切后连接入pET28a(+)载体,重组质粒转化大肠埃希菌(Escherichia Coli)DH5α,阳性菌落经PCR和双酶切鉴定,并测序。将测序正确的重组质粒pET28a(+)-TgMAPK1转化至E.coli BL21并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物。以鼠抗弓形虫血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白的抗原性。RT-PCR扩增产物约为1 599bp。菌落PCR、双酶切和测序结果显示,重组质粒pET28a(+)-TgMAPK1构建成功。SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量约58 000的包涵体重组蛋白。Western blotting分析证实其能被鼠抗弓形虫血清识别。刚地弓形虫GT1株TgMAPK1基因片段可在原核表达系统中表达,且该重组蛋白具有抗原性。     

刚地弓形虫Rop18基因的原核表达及鉴定

利用PCR技术从弓形虫RH株基因组中扩增出Rop18基因片段,克隆入pET-30a载体,将重组质粒转化入大肠杆菌Top10中,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。测序结果与参考序列(登录号:JX045329.1)比对发现,核苷酸同源性为99.6%。将阳性重组质粒转化入大肠杆菌BL21中,表达产物经SDS-PAGE检测结果显示,Rop18基因在大肠杆菌中成功表达;融合蛋白的分子质量在66.2 ku左右,Western blotting显示其能被兔抗弓形虫免疫血清识别。结果表明,弓形虫RH株Rop18基因可以在原核表达系统中高效表达,该重组蛋白具有免疫原性,有望作为弓形虫疫苗候选抗原。     

弓形虫微线体蛋白MIC9的原核表达及免疫反应性分析

为深入了解弓形虫微线体蛋白9(MIC9)基因功能,以弓形虫RH株总基因组为模板PCR扩增MIC9基因片段,并构建MIC9的原核表达载体,采用Western blot对其免疫反应性进行鉴定分析。结果显示:扩增出大小为903 bp的MIC9基因片段,与预期结果一致;成功构建了pMD-18T-MIC9克隆质粒和pGEX-4T-1-MIC9原核表达载体,经过双酶切及测序鉴定正确,且能够在大肠杆菌中成功表达,表达蛋白的分子量为59 kDa;经免疫反应性鉴定,MIC9重组蛋白能够被弓形虫全虫抗体特异性识别,证明重组蛋白MIC9具有一定的免疫反应性。研究结果为弓形虫MIC9基因免疫功能的后续研究提供了参考。     

弓形虫ROP18基因重组蜥蜴利什曼原虫的构建及鉴定

用PCR方法从弓形虫RH株全基因组中扩增ROP18基因,将其克隆至pMD18-T载体,经测序分析后,构建真核表达穿梭质粒pLEXSY-neo2-ROP18;利用电转染技术将外源基因表达盒转入蜥蜴利什曼原虫,G418筛选阳性克隆;阳性克隆分离培养后提取基因组,用ROP18特异性引物及同源重组鉴定引物进行重组利什曼原虫PCR鉴定,结果阳性虫体中扩增出特异性目的条带;应用鼠抗弓形虫多抗血清以Western blot印记法从蛋白水平进行重组蛋白检测,证明目的蛋白在蜥蜴利什曼原虫中得到表达。     

刚地弓形虫GRA3基因的克隆与表达

采用PCR方法扩增弓形虫GRA3基因,将扩增产物与pMD18-T Simple载体连接,重组质粒经PCR、双酶切鉴定后测序;构建pGEX-4T-1／GRA3表达载体,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western blot分析。结果显示,克隆的GRA3基因片段长687bp,含有1个669bp的开放阅读框,编码222个氨基酸,与GenBank中UK株（AF414079）的同源性为99．8％;表达的融合蛋白为50Ku,能被弓形虫阳性血清识别;表明该融合蛋白具有较好的免疫反应活性。     

弓形虫DOC2基因C-端的克隆及序列分析

为研究弓形虫DOC2基因作为弓形虫疫苗候选抗原分子的可行性,本试验用RT-PCR技术扩增DOC2基因编码区的C-端并测序。将该基因片段用生物信息学软件翻译为氨基酸序列后,预测弓形虫DOC2蛋白C-端的生物学特性、高级结构和B细胞抗原表位。结果表明,DOC2基因C-端片段长度为1887 bp。将其翻译成氨基酸序列后预测含有11个亲水区域和7个跨膜区。二级结构中含有19个α-螺旋、1个β-转角和17个无规则卷曲。结合柔性区域等分析,DOC2蛋白C-端共含有12个线性B细胞抗原表位。结果表明DOC2蛋白C-端可作为弓形虫疫苗候选分子,为研制新型弓形虫DNA疫苗或表位肽疫苗提供理论基础。     

弓形虫胚层发育相关蛋白的原核表达及免疫原性研究

试验旨在研究弓形虫胚层发育相关蛋白（TgERP）的免疫原性,以弓形虫RH株的基因组DNA为模板,扩增TgERP基因,将其连接于表达载体pET-30a(+)后,转化至Escherichia coli BL21（DE3）感受态细胞进行IPTG诱导表达,应用Western blotting对重组蛋白的反应原性进行分析,并用纯化后的TgERP蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。结果显示,在37 ℃条件下用1.0 mmol/L IPTG诱导6 h表达可溶性TgERP蛋白的量最大。SDS-PAGE结果显示,目的蛋白分子质量为16.7 ku,以可溶形式表达,纯化后蛋白条带单一。经Western blotting分析,TgERP蛋白有较好的反应原性;制备的多克隆抗体效价较高,可达1∶51200,表明该蛋白具有较好免疫原性。提示,TgERP蛋白可作为血清学诊断方法的候选抗原和弓形虫病疫苗的候选分子,为建立弓形虫新型诊断方法和研制新型弓形虫疫苗奠定了基础。     

Study on Expression of Toxoplasma gondii Rhoptry Neck Protein 5 Gene in Different Developmental Stages

To investigate the relationship between the expression level of Toxoplasma gondii rhoptry neck protein 5 (TgRON5) gene in different developmental stages and the virulence of Toxoplasma gondii, the objective of this study was to examine the different expression of TgRON5 gene in different developmental stages of type Ⅱ Toxoplasma gondii PRU strain. Specific primers were designed according to the sequence of TgRON5 gene, and ACT1 gene of Toxoplasma gondii was used as a reference gene. Following the establishment of standard curve for the target and reference genes, in order to confirm the consistency of their amplification efficiency, Real-time PCR method was applied to determine and compare the expression level of TgRON5 gene in development stage which including tachyzoite, bradyzoite, non-sporulated oocyst and sporulated oocyst. The results demonstrated that TgRON5 was expressed in all developmental stages but the sporulated oocysts had the highest expression, followed by the non-sporulated oocysts, the third was tachyzoite, and the lowest was bradyzoite. It suggests that the synthesis and secretion of TgRON5 protein was closely associated with the invasiveness of the parasite. All these findings had important implications for elucidating the functions of TgRON5 involved in the invasion of Toxoplasma gondii.     

弓形虫不同发育时期棒状体颈部蛋白5基因的表达研究

为探究不同发育时期弓形虫棒状体颈部蛋白5（Toxoplasma gondii rhoptry neck protein 5,TgRON5）基因的表达情况与其毒力的相关性,本试验以Ⅱ型弓形虫PRU虫株作为研究对象,以弓形虫管家基因ACT1作为内参基因,分别对目的基因和内参基因设计特异性引物,通过对各基因建立标准曲线,确定二者扩增效率的一致性后,采用实时荧光定量PCR相对定量法对弓形虫4个不同发育时期（速殖子、缓殖子、未孢子化卵囊及孢子化卵囊）中TgRON5基因的表达情况进行检测与分析。结果显示,TgRON5基因在弓形虫各发育时期均有表达,其中,孢子化卵囊表达水平最高,未孢子化卵囊次之,速殖子较低,缓殖子最低,表明RON5蛋白的合成与分泌与虫体入侵宿主细胞的侵袭力有着密切的关系。本研究结果为阐明TgRON5蛋白参与弓形虫入侵的机理奠定了基础。     

弓形虫棒状蛋白17基因的克隆与序列分析

为研究弓形虫棒状体蛋白17(ROP17)基因的遗传变异,本研究以弓形虫RH株、PRU株和TgC7株为研究对象,首次PCR扩增了其ROP17基因部分序列,将PCR产物纯化后克隆到pMD18-T并测序。将测定的序列与网上下载的弓形虫VEG株、GT1株和ME49株相应序列进行比对,然后用Mega 5.0程序的NJ法和Puzzle 5.2程序的ML法构建系统发育树。结果表明,3株弓形虫分离株的ROP17基因部分序列长度均为1375 bp,A+T含量在49.53%~50.04%之间,3个虫株相应序列的变异碱基数皆小于20个,其变异率为2.3%,氨基酸序列变异率在0~6.11%之间。系统发育结果显示, ROP17基因部分序列能区分弓形虫基因Ⅰ型和Ⅱ型的虫株。本研究结果为进一步研究弓形虫ROP17基因的变异及研制弓形虫ROP17基因的亚单位疫苗提供了理论依据。     

弓形虫SAG1基因在蜥蜴利什曼原虫中的表达

利用PCR扩增技术从弓形虫RH株全基因组中扩增出弓形虫抗原基因SAG1,将其克隆入真核表达载体质粒pLEXSY-neo2,构建真核表达穿梭质粒pLEXSY-neo2-SAG1。利用电穿孔转染技术将外源基因表达盒转入蜥蜴利什曼原虫,经G418筛选阳性克隆。表达的外源重组蛋白经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,证明SAG1重组蛋白在蜥蜴利什曼原虫中得到表达。