马铃薯甲基转移酶基因StDRM2的克隆及表达分析

DNA甲基化对植物的生长发育至关重要,DNA甲基转移酶建立和维持着DNA甲基化,其中结构域重排甲基转移酶DRM2催化非对称位点的从头甲基化.为了初步探究马铃薯StDRM2基因的功能,本研究利用同源克隆基因技术从马铃薯'青薯9号'中克隆了StDRM2基因,利用Gateway技术构建过表达载体,农杆菌遗传转化马铃薯'大西洋...     

水稻苗期低温诱导表达新基因OsCOI的克隆、过表达载体的构建与转化

水稻苗期冷害是导致水稻减产的重要因素之一。为了发掘新的耐冷基因、诠释其耐冷分子机制并应用分子育种的手段提高水稻苗期耐冷性,前期已通过Northern表达分析,从已构建的水稻苗期低温诱导表达正向抑制差减cDNA文库中,发现了一个受低温诱导上调表达的功能未知的C2H2型锌指结构域蛋白新基因(特命名为OsCOI)。本研究进一步通过RT-PCR的方法从水稻中克隆了该基因,构建了其植物过表达载体,并通过农杆菌介导转入水稻基因组中,获得了其过表达转基因水稻株系,为进一步研究该基因的功能并探讨其在水稻耐冷分子育种中的应用价值奠定了基础。     

枸橼C-05小热激蛋白基因HSP23.3克隆与拟南芥遗传转化

以枸橼C-05叶片为材料,对枸橼C-05中HSP23.3基因的ORF进行了克隆,并对其生物学信息进行了分析。结果显示：HSP23.3基因在枸橼C-05中的ORF为615 bp,编码204个氨基酸。枸橼C-05的HSP23.3蛋白属于跨膜亲水不稳定蛋白,预测定位于细胞质,二级结构由α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲构成,其中,α-螺旋和无规则卷曲是其最主要的二级结构元件,且三级结构和二级结构预测结果高度相似。不同物种同源序列进化分析结果显示枸橼C-05的HSP23.3与漾濞槭的TXG74 151.1亲缘关系最近。含枸橼C-05种质HSP23.3基因的转基因拟南芥T2代株系接种丁香假单胞菌结果显示转基因拟南芥与野生型相比症状较轻且能抑制丁香假单胞菌的繁殖。本研究初步认为HSP23.3基因可能参与枸橼C-05抗溃疡病反应过程。     

雄性不育基因对棉花的遗传转化

利用TA29、A6、A9三启动子功能区与barnase基因融合构建的不育基因以农杆菌介导法对棉花下胚轴进行了遗传转化,通过胚状体途径获得了转基因再生植株.利用150 mg·L-1高浓度卡那霉素(Km)对转化初期筛选出的再生苗进行再次筛选,提高了转化株的选出率.通过PCR检测和Southern dot blot分析从转基因胚状体再生植株中获得了带有barnase不育基因的120株转基因植株.进行转基因植株生物学性状检测和观察表明,所获得的转基因植株对溴苯腈表现出了明显的抗性,并从不育基因转化植株中筛选出了具有明显不育特征的雄性不育株.     

抗玉米螟基因Cry1A.301原核表达和玉米遗传转化

增强玉米品种的抗虫性是减少玉米螟为害、提高玉米产量的有效途径。通过密码子优化改造获得抗虫基因Cry1A.301,构建原核表达载体pET30a-Cry1A.301,进行蛋白免疫学、ELISA检测以及玉米螟抗性生测。结果表明,原核表达载体中Cry1A.301蛋白高效表达,且7d后杀虫效率达100%。通过Cry1A.301基因与植物表达载体CPB连接,构建CPB-35S∶∶Cry1A.301-35S∶∶bar载体进行农杆菌介导的玉米萌动胚遗传转化,得到12株T0代转基因植株。T0代植株叶片中目的基因、筛选标记bar基因的PCR检测与蛋白免疫学检测结果表明,Cry1A.301基因已经整合到玉米基因组并表达。     

白屈菜CmFAD2基因的克隆及植物转化载体构建

通过对白屈菜低温应答过程的转录组分析发现膜脂不饱和化相关基因的表达在一定过程中发生变化,脂肪酸去饱和酶基因FAD2在随温度的变化趋势为正V型,且表达量变化显著。利用NCBI等在线软件对序列进行相关生物学信息分析,并对白屈菜FAD家族成员FAD2基因的完整开放阅读框(ORF)进行克隆,并命名为CmFAD2。选用克隆载体pMD-19-T,转化大肠杆菌DH5α,测序验证序列正确性及完整性。将目的基因与植物表达载体pRI-201-AN连接构建重组DNA pRI-201-AN-Cm FAD2,电击法转化农杆菌LBA4404,利用菌液PCR法验证成功。该基因可作为药用植物抗寒品种创制的候选基因。     

陆地棉异质型ACCase基因的种子特异表达载体构建与遗传转化

异质型ACCase催化乙酞CoA形成丙二酞辅酶A是植物脂肪酸合成途径中的第一个关键的步骤,也是限速步骤:植物体内过量表达ACCase能够增加脂肪酸合成的底物,有可能导致植株种子含油量的增加.本实验采用GUS基因瞬时表达检测棉花愈伤组织中种子特异性表达启动子AGP的活性;利用RT-PCR扩增,克隆了陆地棉异质型ACCas...     

人参PgPP2C2基因的克隆及生物信息学分析

2C型蛋白磷酸酶(PP2C)是最大的蛋白磷酸酶家族,PP2C蛋白在响应不同非生物胁迫中发挥着重要作用。为了探究人参Pg PP2C2基因的功能,基于实验室前期转录组数据库,从人参中克隆了一个2C型蛋白磷酸酶基因,命名为Pg PP2C2,并对Pg PP2C2基因的序列、编码蛋白质的结构进行分析,预测了其功能。研究结果表明,该核苷酸序列的开放阅读框为1 269 bp,编码422个氨基酸。其编码蛋白质属于亲水性蛋白,无信号肽,未形成跨膜结构域,包含2C家族丝氨酸/苏氨酸磷酸酶催化结构域。通过蛋白互作分析,发现Pg PP2C2蛋白与HOG1 (参与渗透调节的丝裂原活化蛋白激酶)和NBP2 (NAP1-binding蛋白2,参与HOG途径的蛋白)的互作分数分别高达0.996和0.984,推测Pg PP2C2蛋白可能参与渗透胁迫调节及磷酸化过程。本研究结果可为后期进一步研究PgPP2C2基因的功能和开展人参种植调控提供理论基础。     

农杆菌介导法转化大豆体细胞胚获得转基因植株

以六个品种大豆体细胞胚为受体,以Bt基因为目的基因,应用根癌农杆菌介导法对大豆进行了遗传转化,经卡那霉素选择、诱导体细胞胚萌发及壮苗培养,获得了完整的抗性再生苗,经PCR、PCR-Southern和点杂交分析鉴定,初步证明外源基因Bt已整合到大豆的基因组中。     

草坪草遗传转化进展与研究热点

随着我国草坪业的快速发展,草坪草遗传育种工作越来越受到人们的关注,生物技术在草坪草品种改良中具有很大的应用潜力。着重从转基因草坪草的类型与目标基因、外植体的选用、转化方法、表达载体的构建、转化体的筛选等方面综述了草坪草转基因研究的现状及其进展,同时对草坪草分子标记和体细胞无性系变异等方面的研究进展作了简要的概述,提出了抗逆、抗病虫与环保型、纯天然彩色草坪草等研究热点。核技术在改良草坪草的观赏性状、抗逆性、抗病性等方面将发挥重要作用。     

转梭梭HaPrxQ基因拟南芥植株的获得与检测

HaPrxQ是参与活性氧清除的重要基因。根据已发表的过氧还蛋白基因序列,设计特异引物,扩增到完整的HaPrxQ基因;构建植物表达载体pCAMBIA2300-HaPrxQ,通过农杆菌介导转化拟南芥,获得转化植株种子。对收获的T0代种子进行卡那霉素抗性筛选,并通过PCR对抗性苗进行检测。结果表明,构建的载体成功转化拟南芥并获得了9份转HaPrxQ基因苗。     

GhWRKY44基因在烟草中遗传转化及功能分析

为了进一步验证GhWRKY44(登录号:KJ801807)基因在烟草异位表达后的功能,构建了Ca MV35S启动子调控、Nos为终止子的棉花抗枯萎病相关基因(GhWRKY44)的过表达载体;电击法将其导入农杆菌GV3101,菌液PCR筛选鉴定阳性菌株,采用农杆菌介导法转化烟草;T0转化植株经卡那霉素筛选、PCR检测后,随机从转基因T0中选取5株进行RT-PCR检测,均为阳性株,说明GhWRKY44基因不仅整合到烟草基因组中而且还能正常转录。对过表达GhWRKY44基因的转基因烟草T1株系进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析。结果表明,在正常生长情况下,PR5和NPR1的表达量在转GhWRKY44株系中明显增加,枯萎病菌侵染后,在转GhWRKY44株系中,PR1a、PR2和NPR1的表达量迅速增加,明显高于野生型株系,而PR5的表达量则低于野生型株系,说明该目的基因能在烟草中异位表达并能激活病程相关蛋白基因的表达,但其功能仍需进一步研究。     

马铃薯块茎花色素苷合成相关R2R3 MYB蛋白基因的克隆和功能 分析

植物花色素苷的合成代谢受转录因子的调控, 其中R2R3 MYB为最主要的转录调控因子。本研究以彩色四倍体马铃薯为试材, 克隆了R2R3 MYB基因家族里调控马铃薯块茎花色素苷合成R2R3 MYB-StAN1的3个同源基因, 并利用生物信息学分析、稳定烟草遗传转化、qPCR等方法对这3个同源基因的结构和功能进行分析和鉴定, 结果表明, 这3个同源基因均含有R2和R3保守结构域, 其主要差别在于C端由10个氨基酸序列组成的重复结构(R)数目不同, 根据R数目将其分别命名为StAN1-R0、StAN1-R1和StAN1-R3, 其蛋白分子量分别为28 047.91、29 458.35和31 527.60 Da, 等电点(pI)分别为6.14、6.90和8.39, 均为亲水蛋白。通过转化烟草发现, 转入StAN1-R0、StAN1-R1和StAN1-R3后, 烟草叶片叶色变化明显, 其中转StAN1-R1烟草叶色呈深红色, 其叶片花色素苷含量最高。进一步利用qPCR分析表明, 外源StAN1使烟草叶片花色素苷合成代谢途径的关键基因(NtCHS、NtCHI、NtF3H、NtF3’H、NtDFR、NtANS、NtUFGT)上调表达, 同时烟草内源NtbHLH基因的表达显著上升; StAN1-R1可以高效地调控烟草内源NtbHLH基因和结构基因NtDFR和NtANS的表达。结果表明, StAN1的3个同源蛋白均可以调控花色素苷的合成, 而只含一个重复序列R的StAN1调控花色素苷合成的能力最强。     

番茄ACC氧化酶基因cDNA的克隆及三种植物表达载体构建

乙烯在植物生长发育过程中发挥着重要的作用.ACC氧化酶是乙烯生物合成途径的限速酶.通过反义基因工程调控ACC氧化酶基因的表达,进而起到调控乙烯的生成是乙烯研究的主要途径.本研究采用RT-PCR方法获得番茄ACC氧化酶基因cDNA序列1 018 bp,构建该基因的正义、反义、RNAi表达载体,通过电转化法导入农杆菌LBA4404中.     

棉花GhMYB0基因的克隆、表达分析及功能鉴定

MYB类转录因子是植物转录因子最大的家族之一, 参与控制植物腺毛细胞的模式和形态建成。本研究利用雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii) D₅基因组数据库以AtMYB0 (GL1, NM_113708)蛋白为参比序列获得同源基因GrMYB0, 从徐州142中克隆了陆地棉的GhMYB0, 其开放阅读框长度为843 bp, 编码280个氨基酸。经过保守结构域分析和亚细胞定位确定GhMYB0为R2R3-MYB转录因子。qRT-PCR的结果表明, GhMYB0在徐州142开花当天开始高调表达, 开花后20 d表达量达高峰; 在所有的组织器官中, 花中表达量最高, 其次为胚珠。转基因功能分析结果表明, 在野生型拟南芥(Columbia)中过表达GhMYB0, 使其叶片表皮毛与野生型相比明显减少; 该基因在拟南芥突变体gl-1中过表达, 能恢复表皮毛缺失型突变体的表型, 说明该基因可能对拟南芥表皮毛的形态建成发挥一定作用, 本试验为研究R2R3-MYB转录因子在棉纤维起始和伸长过程中的调控作用提供有力证据。     

phaG和phaC基因在烟草叶绿体中的转化及其遗传分析

中长链羟基脂肪酸聚酯(medium-chain-length-PHAs, mcl-PHAs) 属于微生物聚酯。羟酰-CoA-ACP-转移酶和II型PHA合酶是mcl-PHAs生物合成途径中的两个关键酶。将编码羟酰-CoA-ACP-转移酶的基因phaG与水稻叶绿体psbA基因的启动子和终止子连接构建表达盒RpsbA-pro-phaG-RpsbA-ter,将II型PHA合酶的基因phaC与水稻叶绿体16S rRNA基因的强启动子Prrn及rbcL基因的终止子连接构建表达盒prrn-phaC-RrbcL-ter,连同壮观霉素抗性基因aadA表达盒prrn-aadA-TpsbA-ter一起克隆进烟草叶绿体基因组同源片段rbcL和accD之间,得到烟草叶绿体表达载体pTGC。用包裹有质粒pTGC的金粉子弹轰击烟草无菌苗叶片,经壮观霉素筛选后获得6株叶绿体型转基因植株。对T₀代和T₁代转基因植株进行PCR检测和Southern blot分析表明,外源基因已整合进烟草叶绿体基因组中,且T₁代转基因植株已同质化。RT-PCR分析结果证实外源基因已在转录水平上表达。转基因植株的自交及正反交结果表明,外源基因在转基因后代中能够稳定遗传,遗传方式遵循母性遗传规律,不存在转基因的花粉漂移现象。