多联厌气菌干粉菌苗的研究 Ⅱ各种梭菌干粉菌苗制造及其免疫剂量试验

研制了快疫、羔羊痢疾,猝狙、肠毒血症、黑疫、肉毒中毒、破伤风和气肿疽等八种干粉菌苗。前七种菌苗对家兔的免疫剂量分别为:3～5mg,2mg,1～2mg,0.1mg,0.5mg,0.25mg,和0.1mg。对绵羊的免疫剂量分别为:4～8mg,1mg,2mg,2mg,≤10mg,20mg,≤10mg。气肿疽菌苗对海猪的免疫剂量为7.5mg。对于前七种菌苗,每毫升培养基可分别制造2.68～1.31,24.1,5.7,13.1,≥2.84,1.51,和≥1.43头剂(绵羊)。四只免疫绵羊血清等量混合,0.1ml分别中和腐败梭菌毒素1MLD以上;魏氏梭菌B型毒素2MLD以上;C型毒素1MLD以上:D型毒素2MLD以上;诺维氏梭菌毒素200MLD;肉毒梭菌毒素1MLD;破伤风梭菌毒素1,000MLD,各该菌苗即可达到有效标准。     

重组腐败梭菌α毒素替代羊三联四防苗中腐败梭菌组分的免疫效果评价

为了评价重组腐败梭菌α毒素在联苗中的免疫效果,试验用不同含量的重组腐败梭菌α毒素替代羊三联四防苗中腐败梭菌组分制备联苗,分别免疫兔和绵羊,在免疫后的第10,14,21天分别测定血清中和效价,免疫后第25天用1个最小致死量(MLD)的腐败梭菌毒素对免疫兔和绵羊分别进行攻毒,以期得到能使动物获得足够保护的抗原含量。结果表明:对于兔和绵羊联苗中重组腐败梭菌α毒素蛋白最小免疫剂量分别为0. 3 mg、0. 25 mg时,在免疫后第14天腐败梭菌毒素血清中和效价均能达到1;免疫后第25天进行攻毒保护试验,免疫兔和绵羊攻毒保护率分别为100%、75%。说明重组腐败梭菌α毒素可以替代羊三联四防苗中腐败梭菌组分用来进行免疫。     

气肿疽梭菌延边样的分离鉴定

牛、羊等反刍动物的气肿疽病是由气肿疽梭菌感染引起的严重危害畜牧业发展的一种疾病,本研究从延边州延吉市采集疑似气肿疽梭菌感染的牛肝脏、脾脏、肌肉等组织进行气肿疽梭菌的分离鉴定。结果表明:经病原学检查、生化鉴定、动物试验及分子生物学鉴定,本试验成功对气肿疽梭菌进行了分离,该菌株细胞毒素、cct A基因与Gen Bank上已发表的气肿疽梭菌ATCC 10092菌株的同源性达到99.0%,此结果为该地区气肿疽病的免疫和微生态防治提供了重要的参考依据。     

气肿疽梭菌CctA基因的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立

研究旨在原核表达气肿疽梭菌细胞毒素A （CctA）基因,用纯化的重组蛋白建立其间接ELISA检测方法,a。利用大肠杆菌密码子的偏爱性优化CctA基因序列,克隆至原核表达载体pET-28a （+）,双酶切鉴定原核表达质粒pET28a-CctA并测序。将重组质粒转入大肠杆菌,经IPTG诱导得到高表达的重组CctA包涵体蛋白。包涵体蛋白变性后经镍（Ni）柱纯化,SDS-PAGE检测其纯化效果。以豚鼠抗气肿疽梭菌抗血清为一抗,用Western blotting方法检测重组CctA蛋白的反应原性。用棋盘滴定法建立间接ELISA检测方法,以复性后的重组CctA蛋白作为检测抗原,摸索抗原包被浓度、封闭液的种类及浓度、抗体的最适稀释度和反应条件等。选用3批气肿疽灭活疫苗免疫豚鼠后采集血清,同时用攻毒和间接ELISA两种方法验证疫苗的免疫效力。质粒双酶切结果显示,得到大小约853 bp的条带,与预期相符,且测序结果正确。SDS-PAGE结果表明,成功表达并纯化大小为35 ku的重组CctA蛋白。Western blotting结果显示,豚鼠抗气肿疽梭菌抗血清与重组CctA蛋白具有良好的反应原性。建立的间接ELISA法的最适条件为：抗原的包被浓度为0.5 μg/mL,于4 ℃包被过夜;封闭液选择10%胎牛血清,37 ℃孵育2 h;二抗的稀释度为1：8 000;室温避光显色10 min后终止反应,测定D_{450 nm}值。当P/N>4.6时,间接ELISA法检测结果与豚鼠攻毒试验结果拟合度较好。本研究成功表达CctA基因并纯化了重组CctA蛋白,建立的以重组CctA蛋白为检测抗原的间接ELISA检测方法,有望成为气肿疽灭活疫苗免疫效果验证的替代方法。     

牛羊肉毒梭菌(C型)灭活苗的研制及免疫效果观察

采用我所分离并保存的对本地区牛羊肉毒梭菌病具有良好免疫原性的菌株Nb6514研制成功牛羊肉毒梭菌(C型)灭活苗。用免疫牛、羊血清作小白鼠体外中和试验来测定抗体效价,结果表明:结果显示,免疫10d的牛羊均可抗10个小鼠最小致死量/m L;30d分别可抗30~280和20~240个最小致死量/m L血清;180d达到高峰,分别可抗300~1600和200~1200个小白鼠最小致死量/m L血清;至550(一年半)仍可抗10个最小致死量/m L血清。结果表明研制的牛羊肉毒梭菌(C型)灭活苗具有良好的免疫效果,能有效预防牛羊肉毒梭菌(C型)病。     

气肿疽梭菌C54-1株的制备与检定

为研究气肿疽梭菌C54-1株(CVCC60001)的菌种特性,制备了1批气肿疽梭菌C54-1株,并对菌种的形态及生化特性、培养特性、血清学特性、真空度、纯粹、剩余水分、毒力及免疫原性、16S rDNA等进行检定,以及对于该菌的适宜培养基促生长能力等方面进行了比较。实验结果表明,该冻干菌种的形态及生化特性、培养特性、血清学特性、真空度、纯粹、剩余水分、毒力及免疫原性均符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》二〇〇〇版质量标准的规定。16S rDNA鉴定为气肿疽梭菌,相似度为99.93%。在免疫原性检定中,使用致死剂量攻毒时,免疫组能够4/4被保护,证明该菌明矾苗免疫效果良好。使用商品化梭菌培养基对于该菌培养进行了比对,证实商品化培养基替代厌气肉肝汤的可能性。本研究为气肿疽梭菌的制备和检定提供参考依据,并使用不同培养基进行比对研究,为该菌的稳定培养和疫苗工艺改进提供了研究基础。     

口蹄疫灭活二联苗的免疫研究

将口蹄疫灭活细胞毒按一定比例配成的ＦＭＤ灭活二联苗免疫豚鼠制备的阳性血清，经常量细胞中和试验，能完全抑制细胞病变的发生，联苗免疫后２６天，豚鼠获得了对病毒感染的抵抗力，能有效地抵抗Ｏ．Ａｓｉａ－Ｉ的单独感染和两型毒的同时混合感染。     

山羊气肿疽病的诊治

正气肿疽是由气肿疽梭菌引起的非接触性、急性、高热性、败血性传染病,以组织坏死、产气和水肿为主要特征,又称鸣疽、气肿性炭疽。气肿疽梭菌是产芽孢的革兰氏阳性厌氧菌,其芽孢对外界抵抗力极强,可存活数年。和其他梭菌一样,气肿疽梭菌属土壤源性细菌,被牛、羊及其他动物摄入后,主要寄生在其脾脏、肝脏和肌肉中。细菌繁殖体常产生大量毒素,造成肌肉坏死和毒血症。常见于放牧畜群,牛多发,羊偶发。笔者现将工作中遇到的一例山羊气肿疽病例的诊     

气肿疽及防控措施

气肿疽又被称为黑腿病,为气肿疽梭菌引起的一种急性败血症的传染病,呈散发或地方性流行,气肿疽梭菌在深层肌肉产酸产气导致气肿坏疽为特征。主要通过春秋两季气肿疽疫苗注射来防控气肿疽传染病。2016年4月7日,宁洱县勐先镇黄寨村箐头组鲁明文、鲁升2户养殖户的黄牛发生疫病,在饲养的27头黄牛中发病7头,死亡5头。经普洱市动物卫生监督所、宁洱县动物疫病预防控制中心和勐先镇农业技术服务中心技术人员通过黄牛发病的流行病学调查、现场病理解剖、采样送实验室检测诊断为牛气肿疽病。及时采取牛气肿疽病的防控治疗措施,有效控制了疫情的流行蔓延,按期回访没有出现黄牛发病死亡情况,减少了养殖户的经济损失,巩固了本地山区养牛业的健康发展。     

豚鼠对不同剂量猪细小病毒灭活苗的抗体反应

我研究所研制的猪细小病毒(PPV)AEI灭活苗对预防因PPV引起的母猪繁殖障碍病有良好的效果。该疫苗的效力检验以豚鼠为最易感。本文采用PPV灭活苗的不同剂量,分别为1ml二次、0.5ml二次、0.5ml一次和1ml一次,免疫PPV HI阴性豚鼠,观察豚鼠抗体反应的情况。现报告如下。一、材料和方法 1、材料:7批PPV AEI灭活苗,按本所“猪细小病毒AEI灭活疫苗的制造和检验试行规程”制做,经检验质量合格。