镉胁迫下构树qRT-PCR内参基因筛选及验证

[目的]筛选出镉（Cd）胁迫下构树中稳定表达的内参基因，为后续开展构树耐Cd的分子机理研究奠定基础。[方法]以Cd胁迫下构树的根和叶组织为材料，通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测10个候选基因（BpUBE2、 BpRPL8、 Bp Actin、 BpGAPDH、 BpHSP、 BpTUA、 BpDOUB、 Bpβ-TUB、 BpHIS、BpNADH）的表达情况，利用geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder分析软件对候选内参基因的表达稳定性进行综合评估，并通过逆境胁迫响应基因BpDREB验证筛选出的内参基因的稳定性。[结果]BpDOUB和BpNADH在Cd胁迫下构树中基因表达相对稳定，BpGAPDH表达稳定性最差。以BpDREB验证内参稳定性时发现，单独或组合使用BpDOUB及BpNADH为内参基因时，BpDREB基因表达水平显示出相似的趋势，而稳定性较差的BpGAPDH基因未能对BpDREB的表达量进行准确校正。[结论]BpDOUB、BpNADH基因以及Bp DOUB+BpNADH基因组合均可作为合适的内参基因，提高Cd胁迫下构树相关基因表...     

盐和干旱胁迫下杨树新内参基因的筛选

【目的】通过杨树的多个基因芯片数据,筛选出在盐和干旱胁迫下能够稳定表达的基因作为杨树的新内参基因,为挖掘出更稳定、更理想的内参基因提供途径。【方法】利用已公布的基因芯片数据库获取不同生长时期、不同逆境处理下的杨树表达数据,将这些数据进行归一化处理,对基因在不同试验条件下表达量的稳定性进行排序。结合基因的功能注释信息,筛选新的内参基因。为进一步验证基因表达的稳定性,以经过NaCl,PEG处理的南林95杨(组培苗)的叶片材料为研究对象,利用实时荧光定量PCR方法,对6个传统内参基因(PtUKN1,PtUBQ,Actin,EF1α,18S rRNA,TUA8)和本研究筛选的6个新内参基因在处理后的0,1,4,8,12,24 h的基因表达量进行分析,再利用geNorm,NormFinder和BestKeeper内参基因分析软件对试验数据进行统计和排序,以比较这12个基因的表达稳定性,从而筛选到合适的内参基因。【结果】筛选6个稳定表达的新内参基因(PtRG1,PtRG2,PtRG3,PtRG4,PtRG5,PtRG6)。将这6个新内参基因与6个传统内参基因进行稳定性比较后发现,在geNorm程序分析中盐胁迫下PtRG2和PtRG3稳定性较好,干旱胁迫下PtRG3和PtRG5的稳定性较好;在NormFinder程序分析中盐胁迫下TUA8和PtRG1稳定性较好,干旱胁迫下PtRG1和PtRG2稳定性较好;在BestKeeper程序分析中盐胁迫下PtRG1和PtRG5稳定性较好,干旱胁迫下PtRG3和PtRG5稳定性较好。综合以上3个内参基因分析软件的结果,PtRG1,PtRG3和PtRG5的稳定性较好。为了进一步验证新内参基因的可靠性,以在NaCl和PEG处理条件下受诱导表达的PtVQ6,PtVQ13和PtVQ37作为对照进行荧光定量PCR试验,发现3个VQ基因的总体表达趋势与使用其他内参基因的结果一致。【结论】本研究鉴定的PtRG1,PtRG3和PtRG5适宜作为杨树在盐和干旱胁迫下的内参基因,这些新内参基因的挖掘对准确校正实时荧光定量PCR试验中目的基因的表达水平具有重要意义。     

‘麦缘锦楸’叶色表型qRT-PCR内参基因筛选及验证

[目的]筛选不同叶色部位稳定表达的内参基因,为后期开展‘麦缘锦楸’叶色形成的分子机制奠定基础。[方法]以‘麦缘锦楸’不同叶色部位及灰楸对应部位叶片为材料,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测了7个候选基因(CfUBC、CfActin11、CfPP2A、CfMADH、CfGADPH、CfEF-1及CbuActin)的相对表达量,利用GeNorm、NormFinder和BestKeeper等分析软件对内参基因进行了稳定性评价。分析了‘麦缘锦楸’和灰楸不同叶色部位中萜类合成相关基因(CfGES)的表达模式,验证了上述稳定性评价结果的可靠性。[结果]7个候选内参基因在‘麦缘锦楸’和灰楸叶片中均具有作为内参基因的性能,其中,CfMADH和CfEF-1在不同叶色部位的表达量最稳定,CfGADPH和CfActin11次之,CfUBC最差。以萜类合成相关基因CfGES验证内参稳定性发现,单独或组合使用CfEF-1及CfMADH为内参基因时,CfGES的表达差异与转录组数据趋势一致。[结论]单独或组合使用CfMADH和CfEF-1来校准‘麦缘锦楸’不同叶色部位的基因表达量,可显著提高实验结果...     

美国白蛾内参基因的鉴定及筛选

【目的】为筛选美国白蛾在不同温度处理、不同发育阶段、幼虫不同组织中稳定的内参基因,为美国白蛾相关的基因定量研究奠定基础。【方法】在美国白蛾转录组测序结果中筛选出8个候选内参基因GAPDH、ACT、RPL12、RPL18a、RPS16、EF1α、EF1β、18S rRNA,获得碱基序列。将以上序列进行克隆、测序、比对最终证明其为美国白蛾的基因且碱基序列正确,之后将其上传到NCBI获得登录号。设计以上8个候选内参基因的实时荧光定量PCR(qRT-PCR)引物,利用qRT-PCR技术测定8个候选内参基因在美国白蛾不同发育阶段(幼虫1～6龄)、不同温度处理下(-10、-5、0、25、35、40、45℃处理2 h)、幼虫的不同组织(头、肠道、脂肪体、马氏管、表皮)中的表达量,记录C_t值;然后通过ΔC_t法、GeNorm、NormFinder和BestKeeper共4种方法对8个候选内参基因在不同条件下的C_t值进行统计分析,最后综合RelFinder选出最稳定的内参基因。通过GeNorm计算V_(n/(n+1))最合适内参基因的数目。【结果】C_t分析表明,在不同发育阶段和在不同温度处理下表达最稳定的是RPL12;在幼虫不同组织中,最稳定的是RPS16。GeNorm分析结果与ΔC_t分析结果相同。NormFinder分析表明,在不同的发育阶段和不同温度处理下最稳定的候选内参基因分别是RPL18a和EF1α;在幼虫组织中,最稳定的是ACT。BestKeeper分析认为,不同发育阶段,ACT、GAPDH不适合作为内参基因;不同温度处理下,ACT、RPL18a、RPL12、RPS16、EF1β不适合作为内参基因;在不同幼虫组织中,RPL18a、EF1α、EF1β、18S rRNA不适合作为内参基因。最后RelFinder综合评价显示,在不同的发育阶段最稳定的内参基因组合是RPL12和EF1β,最不稳定的是ACT;在不同的温度处理下,最稳定的内参基因组合是EF1α和GAPDH,最不稳定的是ACT;在不同组织中,最稳定的组合是ACT和RPS16,最不稳定的是RPL18a。经GeNorm软件计算,最合适的内参基因数目应该是2个。【结论】在美国白蛾不同发育阶段的基因定量研究中,建议以RPL12和EF1β作为内参基因;在不同温度处理的基因定量研究中,建议以EF1α和GAPDH作为内参基因;在幼虫不同组织的基因定量研究中,建议以ACT和RPS16作为内参基因。此外,亦初步说明了昆虫内参基因在不同试验条件下的不稳定性。     

油茶WRKY基因家族鉴定及逆境胁迫表达分析

【目的】WRKY转录因子在植物应对生物和非生物胁迫中起重要调控作用。油茶是我国南方丘陵地区重要的经济树种,常受各种逆境胁迫影响。深入挖掘油茶WRKY基因家族成员并探讨其应对逆境胁迫的表达调控模式具有重要意义。【方法】以油茶全基因组数据为参考,利用生物信息学方法,鉴定分析了CoWRKYs基因家族成员,并基于油茶逆境胁迫的相关转录组数据,明确CoWRKYs在低磷、干旱和低温等非生物胁迫下的表达模式,最后基于qRT-PCR方法解析CoWRKYs在不同逆境胁迫下的瞬时表达特征。【结果】CoWRKYs基因家族包含89个成员（CoWRKY1～CoWRKY89）。根据系统发育特征可将其分为3大类,I类、II类和III类的数量分别为20、55和14。保守基序分析表明,进化关系密切的CoWRKYs蛋白具有相同或相似的基序组成。CoWRKYs在低磷、干旱、低温等非生物胁迫下表达谱分析的结果显示,65个CoWRKYs呈现显著表达差异,其中17个CoWRKYs同时受三种非生物胁迫的调控,且大部分基因在逆境胁迫下表现为上调表达,推测这些CoWRKYs在油茶的非生物逆境胁迫中可能起正调控作用。qRT-PCR结果表...     

巨龙竹秆形发育过程实时荧光定量PCR内参基因的筛选

[目的]利用荧光定量PCR(q RT-PCR)和表达分析软件筛选适用于巨龙竹秆形发育研究的q RT-PCR的稳定内参基因。[方法]应用常规PCR和q RT-PCR,分析EF-1α、GAPDH、Actin、Tubulin、TIP-41、PP2A共6个内参基因在不同秆形巨龙竹("通直型"和"弯曲型")竹笋3个不同发育时期的表达情况。利用Ge Norm、Norm Finder软件对各内参基因的表达稳定性进行评估;以筛选的内参基因对巨龙竹木质素合成中的PTAL基因的表达量进行定量分析,验证所筛选内参基因的有效性。[结果]PCR和q RT-PCR的结果表明,6个候选内参基因PCR目的片段电泳条带单一,熔解曲线具有明显的单一峰。内参基因Actin、EF-1α、GAPDH的稳定性和相关性表现最佳;以它们为内参,对茎秆发育过程中PTAL基因进行定量分析,结果显示它们均具有高效性。[结论]Actin、EF-1α、GAPDH可以作为巨龙竹秆形发育研究中目的基因定量分析的内参基因。为进一步分析巨龙竹秆形发育过程中关键基因表达量的变化提供研究基础。     

刚毛柽柳ThBADH基因的克隆和表达分析

甜菜碱醛脱氢酶是甜菜碱合成的关键酶,能通过调节植物生理生化过程参与多种非生物胁迫响应。本研究从刚毛柽柳中克隆,获得一条BADH基因,命名为ThBADH基因。该基因有一个完整的开放阅读框架,其核苷酸序列全长为1 512bp,编码了503个氨基酸。预测其蛋白质分子量为54.58kD,理论等电点PI为5.21。qRT-PCR结果显示,在激素胁迫下,如JA、GA_3、ABA胁迫下,ThBADH基因能被诱导,但是表达不是很显著;而在非生物胁迫NaCl和PEG_(6000)处理条件下,ThBADH基因能被显著诱导;与对照相比,ThBADH基因诱导表达量最高,分别为对照的90.51倍和30.05倍。结果显示,ThBADH基因可能参与了刚毛柽柳对NaCl和PEG_(6000)胁迫响应过程,但其功能仍需进一步验证。     

旱柳在Pb、Cd胁迫下实时荧光定量PCR内参基因的筛选

为筛选适用于Pb与Cd胁迫下旱柳实时荧光定量PCR的内参基因,应用荧光定量PCR技术分析UBQ1、TUB6、Actin、EF1α、18SRNA、GAPDH、TUA8和UBQ2这8个内参基因在旱柳根部的表达情况。通过Normfinder、ge Norm和Best Keeper3个软件进行综合分析,发现在Pb与Cd胁迫下表达较为稳定的内参基因均为EF1α、GAPDH和Actin,差别是在Pb胁迫下的旱柳根组织中最为稳定的内参基因是EF1α,而在Cd胁迫下的旱柳根组织应最稳定的内参基因为GAPDH。该研究结果可用于旱柳根组织在Pb、Cd胁迫下基因表达的进一步研究。     

樟叶越桔热激蛋白基因对温度胁迫的响应表达

[目的]分析樟叶越桔热激蛋白基因响应不同温度变化的表达模式,为阐明热激蛋白在樟叶越桔响应温度胁迫过程中的生物学功能奠定理论基础.[方法]以樟叶越桔成熟叶片为材料,从建成的转录组数据库中筛选出候选内参基因(VdARP、VdGAPDH和VdEF-1α)和热激蛋白基因(VdHSP90、VdHSP70和VdsHSP)的cDNA...     

白桦BpLHY、BpTOC1与BpGI节律基因生物信息学及表达分析

[目的]探究白桦生物钟基因运行机制及在生长发育、胁迫应答中的作用。[方法]运用生物信息学方法对白桦BpLHY、BpTOC1、BpGI节律基因进行分析,预测其编码蛋白的结构功能。利用RT-PCR方法检测白桦BpLHY、BpTOC1、BpGI基因昼夜表达模式,在非生物胁迫重金属Cd、低温(4℃)、与盐(Na Cl)及信号诱导SA(水杨酸)、SNP(硝普钠)下的表达情况。[结果]白桦BpLHY、BpTOC1、BpGI节律基因编码的均为疏水性非分泌型,具有跨膜能力的mixed蛋白。白桦BpTOC1、BpLHY基因表达量均呈现白天低夜晚高的昼夜变化模式,而BpGI表达量则表现出白天高夜晚低的模式。在重金属Cd、低温(4℃)、与盐(Na Cl)非生物胁迫下,BpLHY、BpTOC1与BpGI均上调表达。SA、SNP诱导白桦BpLHY与BpTOC1表达下调,而诱导BpGI表达上调。[结论]白桦BpLHY、BpTOC1、BpGI节律基因昼夜表达模式及非生物胁迫、信号诱导下的表达特征为进一步研究白桦生物钟基因作用机制及其在植物生长发育和胁迫应答中的作用奠定了基础。     

牛奶子实时定量PCR分析中内参基因的评价与验证

【目的】实时定量 PCR结果的精确性在很大程度上取决于选择的内参基因的稳定性。通过评估候选管家基因的表达稳定性,筛选出用于牛奶子研究的最佳内参基因。【方法】设计简并引物从牛奶子中克隆12个潜在的内参基因片段,包括14-3-3、18S核糖体 RNA(18SrRNA)、β-actin (Actin)、延长因子1-α(EF1-α)、真核起始因子4A (eIF4A)、3－磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、RNA聚合酶－Ⅱ(RPⅡ)、60S核糖体蛋白(RPL7)、翻译延长因子2(TEF2)、泛素连接酶 E2(UBCE)、泛素(UBQ)和泛素延伸蛋白5(UBQ5)。采集牛奶子5个不同器官(根、茎、叶、花和红果)、4个成熟期的果实(绿果、黄果、深粉果和完全成熟的红果)、2种激素(脱落酸、赤霉素)处理4个时间点的绿果、热处理4个时间点的离体叶片、幼苗盐胁迫2个时间点的根茎叶,应用实时荧光定量 PCR 技术检测12个内参基因在各样品中的表达情况,采用基于 CT值的 geNorm、Normfinder和 BestKeeper及 CT比较4种算法评价这些内参基因的稳定性,最终的排名则由 RefFinder算法产生。【结果】器官组稳定性好的前2位内参基因为 UBCE和 RPL7,果实成熟期组排名前2的为eIF4A和UBCE,激素处理组排名前2的为eIF4A和UBCE,非生物胁迫组排名前2的则为 Actin和 EF1-α,综合分析所有样品排名前3位的是 eIF4A、RPL7和 UBCE。分别用筛选出的稳定的eIF4A、RPL7、UBCE和不稳定的 RPⅡ作为内参基因评价目的基因八氢番茄红素合成酶基因 EutPsy 在果实成熟过程中的表达,结果显示分别以3个稳定的内参基因为单内参基因与以 eIF4A 同 UBCE 组合做内参基因所得到的结论一致,而 RPⅡ给出的则不同。【结论】在应用荧光实时定量 PCR技术研究牛奶子基因转录表达时,通常情况下eIF4A、RPL7和 UBCE相对于其他9个候选内参基因更为可靠。研究结果为牛奶子及胡颓子属其他物种的基因表达分析奠定基础。     

白桦HSFA4转录因子的克隆及耐盐功能分析

【目的】热激转录因子(HSF)在植物对非生物胁迫应答中起重要的调节作用。本研究拟从白桦中克隆获得HSFA4基因(命名为BpHSFA4),研究该基因的抗逆功能,为该基因用于林木基因工程育种奠定理论基础。【方法】在白桦转录组中筛选获得1条HSFA4基因,通过RT-PCR克隆获得BpHSFA4基因序列。利用生物信息学工具进行序列分析。利用实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)分析不同逆境胁迫下BpHSFA4基因在白桦叶、茎和根中的表达模式。构建植物过表达载体pROKⅡ-BpHSFA4和抑制表达载体pFGC5941-BpHSFA4,进行白桦瞬时转化,同时以pROKⅡ瞬时侵染白桦作为对照。分析NaCl胁迫下不同瞬时转化白桦株系的MDA、H_2O_2、SOD、POD、相对电导率及二氨基联苯胺(DAB)、氯化硝基四氮唑蓝(NBT)及伊文思蓝(Evans blue)染色情况,以综合评定BpHSFA4基因的耐盐功能。【结果】BpHSFA4基因cDNA全长为1 170 bp,编码389个氨基酸,编码蛋白的相对分子量为44.15 kDa,理论等电点为5.14,具有典型HSF结构域。非生物胁迫(NaCl、PEG_(6000)、镉、高温和低温)条件下和激素(ABA、GA_3和JA)处理下,BpHSFA4基因的表达均发生了不同程度的改变,且每种处理后至少有1个时间点发生了明显上调或者下调,其中盐胁迫下表达变化尤为明显。3种瞬时表达白桦株系中的BpHSFA4基因的表达分析结果显示成功获得了瞬时过表达转基因株系(OE)和抑制表达转基因株系(SE)。进一步对不同转基因白桦株系的生理指标和生理染色进行分析,结果显示:Na Cl胁迫条件下,过表达BpHSFA4植株H_2O_2含量、MDA含量和相对电导率明显低于对照植株,抑制表达BpHSFA4植株的H_2O_2含量、MDA含量和相对电导率则明显高于对照植株;过表达BpHSFA4植株的SOD活性和POD活性明显高于对照植株,而抑制表达BpHSFA4植株的SOD活性和POD活性明显低于对照株系;NBT、DAB染色结果与H_2O_2含量测定结果一致,显示OE植株的着色明显比对照植株浅,而抑制表达株系着色明显比对照植株深,Evans blue染色结果和MDA含量测定结果一致。【结论】BpHSFA4基因能对非生物胁迫(NaCl、PEG_(6000)、镉、高温和低温)和激素(ABA、GA_3和JA)处理做出应答,特别是盐胁迫条件下,应答强烈,该基因可能参与白桦耐盐胁迫应答。在盐胁迫条件下,瞬时过表达BpHSFA4基因株系能通过提高SOD和POD等保护酶的活性从而增强活性氧清除能力、降低膜脂氧化程度,减少细胞受损或细胞死亡,进而提高白桦的耐盐能力。本研究初步证实BpHSFA4基因是一个耐盐胁迫应答候选基因。     

杨树PIF基因家族成员表达模式研究

[目的]为探究光敏色素相互作用因子(PIF)基因在杨树生长发育中的功能。[方法]利用生物信息学方法预测了杨树基因组中的PIF基因家族成员并对各成员的基因结构、保守基序进行了系统分析;在此基础上,采用实时荧光定量PCR技术检测了PIF成员在不同组织及低温、干旱和Na Cl胁迫下的表达模式。[结果]表明:杨树基因组中至少含有10个Pt PIF成员,这些成员在进化上相对保守,均具有典型的b HLH结构域。基因表达分析显示:Pt PIF基因在杨树不同组织及不同非生物胁迫条件下存在明显的表达差异。[结论]杨树Pt PIF基因家族包含10个成员参与不同的生物学过程,研究结果将为深入解析杨树Pt PIF基因的功能奠定了基础。     

梨果实细胞分裂期内参基因表达稳定性分析

【目的】果实细胞分裂期是果实品质调控的关键时期,qRT-PCR技术在果实品质研究中发挥着重要作用,qRT-PCR技术中内参基因的选择关系到检测结果的准确性。为了筛选出适合分析梨果实细胞分裂期基因表达水平的内参基因。【方法】分别以杜梨、香梨和鸭梨梨花露红期、盛花期的花托和授粉后10、20、30、40 d的梨果肉为研究材料,应用qRT-PCR技术,对TUB2、TUB1、TUB3、Actin1、Actin2、UBI、EF1α和GAPDH这8个内参基因在不同梨品种果实细胞分裂期的表达情况进行了分析,利用geNorm和NormFinder对候选内参基因的稳定性进行了分析评价;以FWL1为目标基因,验证了候选基因在同一花期不同梨品种之间表达的稳定性。【结果】Actin1在花期花托中的表达稳定性最高,TUB2在果期的表达稳定性最高,TUB2在总样本中的表达稳定性最高。以FWL1为目的基因对表达稳定性不同的TUB2、Actin1、Actin2和TUB1这4个候选基因的验证结果表明,以TUB2、Actin1和Actin2为内参基因时,FWL1在同一时期不同梨品种之间的表达模式基本一致,使用TUB1作为内参基因得到的FWL1在杜梨、香梨和鸭梨中的表达模式与应用TUB2作为内参基因时的表达模式完全不一致。【结论】Actin1是研究梨花期花托基因表达分析的首选内参基因;TUB2是研究果期果肉基因表达分析的首选内参基因,也是梨果实细胞分裂期基因表达分析的首选内参基因。     

刚毛柽柳NAC24基因的表达及抗逆功能分析

【目的】NAC类转录因子是植物特有的最大的转录因子家族之一,广泛参与植物的生长发育过程,并在植物响应盐、干旱等多种非生物胁迫的过程中发挥至关重要的调控作用。本研究拟从盐生木本植物刚毛柽柳中克隆获得一个NAC转录因子基因,研究该基因的耐盐、抗旱功能,以期为研究木本植物NAC转录因子的抗逆分子机制奠定理论基础。【方法】在刚毛柽柳NaHCO_3胁迫转录组数据库中筛选获得一个NAC转录因子基因,将其命名为ThNAC24(GenBank登陆号:KF031949)。利用生物信息学工具将其与其他9个物种的NAC蛋白进行多序列比对,与拟南芥105个NAC蛋白进行进化树分析。分别用300 mmol·L^-1 NaCl和400 mmol·L^-1甘露醇对刚毛柽柳进行胁迫,在胁迫6、12、24和48 h后分别取刚毛柽柳根及叶组织。通过实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)技术分析盐、干旱胁迫下ThNAC24基因在不同胁迫时间点及不同组织的表达情况,初步鉴定其是否响应盐、干旱胁迫。为进一步研究ThNAC24基因的抗逆功能,分别构建植物过表达(pROKⅡ-ThNAC24)及抑制表达(pFGC5941-ThNAC24)载体。利用农杆菌介导的高效瞬时遗传转化体系获得ThNAC24基因瞬时过表达(OE)、抑制表达(IE)及对照(Control)刚毛柽柳植株。在盐、干旱胁迫下分析比较了ThNAC24基因瞬时过表达、抑制表达及对照刚毛柽柳植株的二氨基联苯胺(DAB)和氯化硝基四氮唑蓝(NBT)染色情况,过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性,及电解质渗透率、失水率及丙二醛(MDA)含量,鉴定ThNAC24基因的耐盐、抗旱功能。【结果】ThNAC24基因的开放阅读框为1 023 bp,编码340个氨基酸。多序列比对结果显示ThNAC24在N端的氨基酸序列相似度比较高,具有NAC家族的序列特征;系统进化树分析结果显示ThNAC24与ANAC103和ANAC082的亲缘关系较近。qRT-PCR结果显示:盐胁迫下,ThNAC24基因上调表达,在根组织中胁迫12 h表达量最高,而叶组织中胁迫24 h的表达量最高;干旱胁迫下,ThNAC24基因上调表达,在根组织中胁迫6 h表达量最高,在叶组织中胁迫12 h的表达量最高。ThNAC24基因在刚毛柽柳根和叶组织中均有表达且响应盐和干旱胁迫。过表达ThNAC24基因显著降低了刚毛柽柳H_2O_2和超氧阴离子含量,增强了POD和SOD酶的活性,从而减少活性氧(ROS)的积累。过表达ThNAC24基因能够降低刚毛柽柳在逆境胁迫下的电解质渗透率、失水率及MDA的积累,从而保护细胞膜结构的完整性。【结论】刚毛柽柳ThNAC24基因能够响应盐、干旱胁迫,过表达ThNAC24基因植株通过增强POD和SOD活性,进而提高ROS清除能力,减少细胞受损或死亡,从而提高刚毛柽柳的耐盐及抗旱能力。     

平榛ChWRKY28基因克隆及表达模式分析

[目的]研究平榛ChWRKY28基因序列特征及其在不同非生物胁迫下的表达规律.[方法]以平榛为试材,采用RACE-PCR方法进行基因克隆;利用实时荧光定量PCR方法检测基因在不同组织及不同非生物胁迫下的表达模式.[结果]表明:克隆得到的WRKY基因,全长1 342 bp,基因内部包含1个长963 bp的完整开放阅读框,编码320个氨基酸残基,命名为ChWRKY28.构建的系统发育树表明:该序列与拟南芥AtWRKY28及杨树PtrWRKY93的关系最近,相似性分别为49%和60%.基因表达分析表明:ChWRKY28在雄花序、雌花芽及茎中均有表达,但在茎部(皮)中的表达量高于雄花序和雌花芽中的表达量,具有组织表达特异性;低温、干旱及盐胁迫均能诱导ChWRKY28基因的表达,但受诱导程度存在差异.亚细胞定位分析结果表明:ChWRKY28蛋白分布在细胞核内,是一个核蛋白.[结论]推测ChWRKY28基因可能参与植物响应非生物胁迫的信号转导过程.     

毛果杨PLD基因家族全基因组水平鉴定及其盐胁迫下的表达分析

[目的]对木本模式植物毛果杨PLD基因家族的进化中的选择压力、启动子中顺式作用元件、组织表达特性以及盐胁迫下表达模式进行分析,为挖掘PtrPLD在非生物胁迫中作用提供参考.[方法]利用拟南芥PLD基因家族蛋白序列比对得到毛果杨基因组同源基因,再经过保守结构域鉴定后确定PtrPLD基因;利用软件ClustalW和MEGA...     

‘84K’杨组氨酸激酶基因PaHK3b的克隆及功能分析

[目的]本研究克隆了银腺杨‘84K’(Populus alba×P. glandulosa ‘84K’)组氨酸激酶基因PaHK3b启动子及编码区,并对其表达进行检测及功能鉴定,为深入研究PaHK3b基因在杨树生长发育的调控作用提供线索,为杨树分子育种及品种改良奠定基础。[方法]根据毛果杨(P. trichocarpa Torr.Gray)基因组信息,设计引物克隆‘84K’杨组氨酸激酶基因PaHK3b启动子及CDS序列,并对其保守结构域和启动子顺式作用元件进行分析;同时,对‘84K’杨进行植物激素处理(10μmol·L~(-1)ABA、10μmol·L~(-1)6-BA、10μmol·L~(-1) IBA、10μmol·L~(-1)GA3及10μmol·L~(-1)水杨酸(SA))及非生物胁迫处理(42℃高温、0℃低温、200 mmol·L~(-1) NaCl和5%PEG6000),利用实时定量PCR(qRT-PCR)方法检测PaHK3b基因表达情况与表达响应差异,并采用原核表达方法初步确定PaHK3b基因的生物学功能。[结果]PaHK3b基因编码框区长度为3 060 bp,编码1 019个氨基酸,PaHK3b蛋白具有CHASE、HisKA和REC等典型的细胞分裂素受体结构域。PaHK3b基因启动子序列中不仅含有大量TATA框和CAAT框常见核心元件,还包含低温响应元件LTR、防御与胁迫响应元件TC-rich repeats、赤霉素响应元件GARE-motif、水杨酸响应元件TCA-element等顺式作用元件,这些元件与杨树的激素响应和逆境胁迫响应密切相关。qRT-PCR分析表明:PaHK3b基因在叶片中表达最高,根部中等,茎中最少;另外,与正常条件下相比,在高温、低温、NaCl及PEG处理时,PaHK3b基因表达量与对照明显增高,分别为对照的2.67、2.61、2.28、1.87倍;用IBA诱导处理时,基因表达量与对照相比差异不大,而在6-BA、ABA、GA3及SA处理时,基因表达量与对照相比均呈下调表达;在添加5%PEG6000的LB液体培养基中,转入PaHK3b基因原核表达载体的大肠杆菌菌株生长速度显著高于对照,在添加50～150 mmol·L~(-1)NaCl的LB固体培养基上,转入PaHK3b基因原核表达载体的大肠杆菌菌株单克隆生长均好于对照。[结论]‘84K’杨PaHK3b基因启动子含有逆境和激素响应元件,表明PaHK3b基因与杨树植物激素信号及非生物胁迫信号响应密切相关。经非生物胁迫处理、激素处理及原核表达证实,杨树PaHK3b基因参与杨树植物激素信号响应,并在其抗逆境胁迫过程中发挥重要调控作用。     

杉木实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择

[目的]筛选适用于杉木不同组织荧光定量PCR分析的稳定内参基因,提高杉木实时荧光定量PCR试验准确性,为杉木体内各个基因表达分析提供合适内参基因。[方法]通过实时荧光定量PCR获取GAPDH、EF1α、18S rRNA、28S rRNA、UBQ、UBC与Actin 7个候选内参基因在杉木无性系的根、茎和叶中的溶解曲线与Ct值;利用软件geNorm、Normfinder和BestKeeper对候选内参基因的表达稳定性进行评价;通过分析2个纤维素合酶基因ClCesA1和ClCesA2在杉木不同组织部位的相对表达情况,对候选内参基因的稳定性进行验证。[结果]geNorm、Normfinder和BestKeeper分析结果均表明:在杉木根和茎中最稳定的内参基因是EF1α和Actin; geNorm、Normfinder结果显示杉木叶中稳定的内参基因是UBQ和EF1α, BestKeeper显示杉木叶中最稳定合适内参基因是EF1α和Actin。以Actin与EF1α作为内参基因,荧光定量PCR分析表明,ClCesA1和ClCesA2基因的相对表达量在杉木不同组织中均有所不同,ClCesA2的相对表达量在各个组织中均高于ClCesA1。以不同内参基因作为试验内参基因分析ClCesA1和ClCesA2的表达情况得到,ClCesA1和ClCesA2在各个组织中的相对表达量排序主要为茎叶根。[结论]7个候选内参基因中,杉木不同组织中稳定表达的为Actin与EF1α,适合作为表达分析的内参基因;28S rRNA的表达稳定性低,不适合作为杉木定量PCR分析的理想内参基因。     

欧李Dof基因家族鉴定及非生物胁迫表达分析

【目的】探究欧李Dof(DNA-binding with one zinc finger)锌指蛋白在非生物胁迫条件下的功能，为ChDof基因的研究与利用奠定基础。【方法】基于欧李全基因组和转录组数据对Dof基因家族进行鉴定，并利用实时定量PCR分析Dof基因在非生物胁迫下的表达情况。【结果】欧李共有23个Dof基因家族成员，其编码区CDS序列长度为226～515 bp，相对分子质量为24 227.52～55 368.21，理论等电点为4.78～9.36，且其在欧李的8条染色体上都有分布。在构建欧李和拟南芥的系统进化树中发现，欧李共分为9个亚组，同一亚族成员中的基因结构和蛋白保守基序均具有较高的相似性，且欧李Dof基因家族成员主要分布在D1亚组中。在对其亚细胞定位时发现，绝大多数ChDof基因主要分布于细胞核中。对欧李Dof家族成员启动子区域顺式调控元件的预测结果表明，其启动子区存在着至少1个激素调节及逆境胁迫反应元件。qRT-PCR分析结果表明，绝大多数的ChDof基因在盐、高温和低温胁迫下的表达量均上调，而ChDof11、ChDof12、ChDof17基因在盐、渗透（PEG）、高温和...