巴什拜羊重组BPI蛋白的体外功能检测

研究巴什拜羊重组杀菌性/通透性增加蛋白(recombinant bectericidal/permeability increasing protein,rBPI)的体外生物学特性。向体外培养的鼠脑内皮细胞MBECs(mouse brain endothelial cell)中加入rBPI,利用Annexin V FITC/PI染色法在荧光显微镜下鉴定凋亡细胞,再用琼脂糖凝胶电泳观察DNA ladder,以检测rBPI诱导MBECs凋亡的作用;在体外培养的绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)中加入rBPI,利用real-time PCR技术检测rBPI对MO的抑制作用;在体外培养的大肠杆菌中加入rBPI,利用微量肉汤稀释法检测rBPI的抑菌作用;在体外培养的绵羊中性粒细胞中加入MO,利用real-time PCR技术检测BPI mRNA的表达水平。结果表明,Annexin V FITC/PI染色法可观察到凋亡早期细胞呈绿色,凋亡晚期或死亡细胞呈红色,在540nmol/L rBPI浓度诱导作用下可见清晰的DNA ladder条带;rBPI作用于MO3h时,MO16SrRNA表达水平显著低于对照组(P0.05);20、40和80mg/L的rBPI与阳性对照组相比均能够显著抑制大肠杆菌的生长(P0.05);绵羊中性粒细胞受到MO感染后3h和4h时表达BPI mRNA的水平均显著高于对照组(P0.05)。     

新疆巴什拜羊ISG15基因的克隆表达及活性检测

克隆表达新疆巴什拜羊ISG15基因,并对其表达产物的活性进行检测。利用RT-PCR和RACE技术克隆了巴什拜羊ISG15基因的cDNA全长序列,将ISG15基因克隆至真核表达载体pPIC9K,经电击转化至GS115中并用甲醇进行诱导表达,用Ni2+螯合亲和层析法对表达的蛋白进行纯化,通过淋巴细胞转化试验来检测表达蛋白的活性。结果表明:克隆得到的巴什拜羊ISG15基因cDNA全长为646 bp,开放阅读框为474 bp,编码157个氨基酸。经酵母重组菌株GS115/pPIC9K-ISG15表达,SDS-PAGE结果显示表达的蛋白约为33 ku,表达的蛋白可用Ni2+螯合亲和层析方法纯化,淋巴细胞增殖试验结果显示,表达的ISG15蛋白能够显著地刺激淋巴细胞增殖(P<0.05),表明表达的蛋白具有生物学活性。     

野生盘羊·家羊及其杂交F1代的血液生化指标比较

[目的]了解盘羊及其杂交后代的血液生理生化指标。[方法]对新疆野生盘羊、绵羊及其杂交F1代的血液生理指标和生化指标进行了测定与比较。[结果]盘羊及与其绵羊的杂交F1代的血红蛋白含量高于绵羊,而其碱性磷酸酶含量低于绵羊,差异极显著(P0.01)。盘羊的红细胞总数、红细胞压积、淋巴细胞、谷丙转氨酶和钠含量高于绵羊与杂交F1代,差异极显著(P0.01),而杂交F1代与绵羊之间差异不显著(P0.05)。杂交F1代白细胞和粒细胞数目极显著高于野生盘羊(P0.01),显著高于绵羊(P0.05)。杂交F1代的血小板数目高于盘羊和绵羊,差异极显著(P0.01)。杂交F1代的钙含量低于盘羊与绵羊,差异显著(P0.05)。盘羊的中间细胞、总胆红素、直接胆红素和氯含量显著低于绵羊和杂交F1代,而杂交F1代与绵羊之间差异不显著(P0.05)。绵羊、盘羊及其杂交F1代的平均红细胞体积、红细胞平均血红蛋白含量、葡萄糖、镁、磷和钾含量差异不显著(P0.05)。[结论]该研究可为今后盘羊的杂交繁育研究提供基础数据。     

盘羊杂交羊SPLUNC1融合蛋白的真核表达

为构建盘羊杂交羊SPLUNC1基因的真核表达载体并在巴斯德毕赤酵母中表达,从盘羊杂交羊口腔上颚的上皮细胞中提取总RNA,并反转录成c DNA,以该c DNA为模板采用逆转录PCR(RT-PCR)法克隆盘羊杂交羊SPLUNC1基因开放阅读框,并克隆到p PIC9K载体中,构建真核表达载体p PIC9K-SPLUNC1,再将重组质粒电转至毕赤酵母GS115中进行表达,表达产物经Ni-NTA琼脂亲和层析纯化,并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western Blot)方法检测。结果显示,目的基因大小758 bp,重组表达质粒p PIC9K-SPLUNC1经双酶切、PCR及测序鉴定构建成功;表达产物经SDS-PAGE分析,可见大小为25.96 ku的目的条带,且在72 h表达量最大;纯化后经SDS-PAGE和Western Blot分析,可见大小为25.96 ku的目的条带。研究结果表明,利用真核表达系统在体外成功表达并纯化了盘羊杂交羊r SPLUNC1蛋白,为深入研究盘羊杂交羊SPLUNC1蛋白的生物学功能奠定基础。     

野生盘羊与巴什拜羊的杂交研究

对野生盘羊与巴什拜羊进行导入杂交,通过对带有1/2、1/4野血的杂种羔羊生长状况、肉用性能、尾型、外形体质和毛质的变化进行观察及测定,并与纯巴什拜羔羊进行了比较.研究结果表明:第一、二代杂种羔羊在胚胎期四肢生长强度比躯体强,这一点继承了盘羊的遗传特性,从初生到断奶期间躯体的生长速度和强度较好,这方面继承了巴什拜羊早期生长发育快的遗传特征,在体尺指标和外部特征上野生基因占优势,毛质和毛的颜色基因巴什拜羊占优势.研究为今后家养绵羊与野生盘羊杂交和充分利用野生动物资源,提供科学数据.     

福建省羊支原体性肺炎分子流行病学研究

为了解福建羊支原体性肺炎和山羊传染性胸膜肺炎的分子流行情况,于2014-2016年从福建省6个市采集到疑似羊支原体性肺炎或山羊传染性胸膜肺炎病料61份,用支原体目引物、绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种、山羊支原体山羊肺炎亚种、山羊支原体山羊亚种、精氨酸支原体、莱氏无胆甾原体和无乳支原体的特异引物,通过PCR方法进行检测。挑取部分PCR阳性病料进行支原体分离和纯化,用16SrRNA基因通用引物进行克隆测序。结果显示61份样品中检出绵羊肺炎支原体45份(73.77%),检出丝状支原体山羊亚种4份(6.56%),检出莱氏无胆甾原体4份(6.56%),检出精氨酸支原体2份(3.28%)。该研究结果表明福建省发生的类传染性胸膜肺炎是以绵羊肺炎支原体为主的羊支原体性肺炎,为福建省羊支原体性肺炎的有效防治提供了科学依据。     

绵羊肺炎支原体P208蛋白质的分子特征分析及免疫原性

为了研究绵羊肺炎支原体P208蛋白质的结构及功能,本试验在对p208基因进行生物信息学分析的基础上,对其部分基因片段进行了克隆及原核表达,并采用Western-blot对其免疫原性进行分析。结果显示,p208基因与猪肺炎支原体黏附素p216基因、殊异支原体细胞表面蛋白基因以及絮状支原体P97/LPPS家族蛋白基因具有较高的同源性。重组P208蛋白以可溶性形式在大肠杆菌BL21(DE3)工程菌中成功得到表达;纯化的重组蛋白与山羊抗绵羊肺炎支原体全菌血清发生结合反应,表明P208蛋白质是绵羊肺炎支原体的免疫原之一。研究结果为进一步分析其功能及其应用提供了重要的依据。     

oar-miR-133的表达对巴什拜羊骨骼肌细胞增殖和分化的影响

以巴什拜羊为对象,初步研究oar-miR-133的表达与巴什拜羊骨骼肌发育的关系。结果表明,oar-miR-133在巴什拜羊胎儿期第100天的骨骼肌和心肌中高表达;在巴什拜羊骨骼肌发育的不同阶段,oar-miR-133的表达量有明显的变化,在胎儿期的第100天和初生当天前后,骨骼肌中oar-miR-133的表达量均出现上调;当巴什拜羊骨骼肌卫星细胞处于增殖状态时,oar-miR-133表达量较低,而当骨骼肌卫星细胞处于诱导分化状态时,oar-miR-133表达量迅速升高,显著高于增殖状态(P0.05);当骨骼肌卫星细胞中的oar-miR-133表达水平升高时,骨骼肌卫星细胞几乎停止增殖,细胞有相互融合转化为肌管的趋势,同时细胞内可检测到细胞分化的标志基因MyHC基因的表达;生物信息学分析共预测到96个oar-miR-133的靶基因,GO分析及KEGG信号通路分析结果表明,这些基因在细胞内通过参与一些重要的信号通路而发挥其生物学功能。     

新疆巴什拜羊BPI基因cDNA全长的克隆及序列分析

【目的】克隆巴什拜羊杀菌/通透性增强蛋白(BPI)的cDNA序列,为研究该蛋白的结构和功能奠定基础。【方法】采集巴什拜羊外周血液,从中分离得到中性粒细胞后提取RNA。根据GenBank中牛BPI基因的cDNA序列设计兼并引物,用RT-PCR方法扩增巴什拜羊BPI基因部分序列,再根据已知的巴什拜羊BPI基因部分序列设计RACE引物,分别扩增出5′和3′端目的片段,分别回收克隆的目的基因片段,再与pMD18-T载体连接,分别转化到大肠杆菌DH5α中,筛选阳性克隆,将重组菌测序后进行拼接,获得巴什拜羊BPI基因全长cDNA序列,并对序列进行分析。【结果】克隆的巴什拜羊BPI基因cDNA序列全长1 922bp,其中开放阅读框为1 452bp,共编码483个氨基酸;BLAST分析表明,巴什拜羊BPI基因的核苷酸序列与绵羊、牛、虎鲸、野猪、猕猴、人、家兔、小鼠、非洲爪蟾核苷酸的一致性分别为99%,91%,78%,74%,64%,61%,58%,53%和50%;氨基酸进化分析显示,巴什拜羊首先与绵羊聚为一类,其次与牛聚为一类,该聚类分析结果与生物学分类结果表现一致。【结论】通过RACE方法成功地克隆了1 922bp的巴什拜羊BPI基因cDNA全长序列,且基因进化树聚类结果与生物学分类结果相一致。     

绵羊IL-6启动子的克隆及pIL6-TLR4载体构建

为生产抗病转基因绵羊,并确保转基因羊的安全性。克隆绵羊IL-6启动子序列,以IL-6为启动子构建TLR4过表达载体,转染绵羊成纤维细胞验证功能。用1μg·L-1的LPS刺激转染后的绵羊成纤维细胞,利用q PCR技术和ELISA方法检测受LPS刺激后的成纤维细胞TLR4 m RNA表达量和TLR4蛋白表达量。结果表明,转染后的TLR4 m RNA表达量在2、4、24、48 h显著高于对照组(P0.05),其中2、4、24 h极显著高于对照组(P0.01),TLR4蛋白表达量始终高于对照组。说明p IL6-TLR4过表达载体构建成功。     

绵羊miRNA-411a与其靶基因FLT3的相互作用

miRNAs是一类长约22 nt的非编码单链小RNA分子,主要与靶基因的3′UTR结合参与生物体基因的表达和调控过程。已经证实许多miRNA通过对靶标的调控,在支原体肺炎感染过程中起重要作用。为验证miRNA-411a与预测的靶基因 FLT3间存在相互作用,采用生物信息学方法分析预测其二级结构,利用荧光定量PCR技术分析miRNA-411a的正常表达和过量表达后靶基因 FLT3的相对表达量,双荧光素酶报告基因试验验证两者的相互作用。结果表明,miRNA-411a与其靶基因 FLT3能形成典型的二级茎环结构;在过量表达miRNA-411a后,其靶基因 FLT3的表达量显著降低。综上所述,miRNA-411a是通过与 FLT3的3′UTR结合而发挥作用,确定 FLT3是miRNA-411a的靶基因。     

3个新疆绵羊品种中BMPR-IB基因的RFLP分析及比较

通过比较研究哈萨克羊、吐鲁番黑羊和策勒黑羊3个新疆绵羊群体中BMPR-IB基因的多态性,为后期分子育种提供理论依据。利用PCR-RFLP技术检测BMPR-IB基因在3个新疆绵羊群体中的多态性,并利用生物信息学软件分析其与绵羊产羔数的关联性,筛选与新疆绵羊高繁殖力性状相关的分子标记。结果显示:吐鲁番黑羊只存在1种基因型,没有多态性。哈萨克羊和策勒黑羊群体中的BMPR-IB基因具有多态,存在3种基因型:++、B+和BB,其中BB基因型个体的产羔数显著高于++基因型个体产羔数(P0.05)。所得结论为:BMPR-IB基因可能是影响哈萨克羊和策勒黑羊繁殖性状的主效基因,BMPR-IB基因是否是影响吐鲁番黑羊繁殖性状的主效基因,有待深入研究。     

小花棘豆中毒对和田羊瘤胃溶纤维丁酸弧菌的影响

通过研究小花棘豆(Oxytropis glabra DC)对和田羊瘤胃溶纤维丁酸弧菌数量的影响,探讨小花棘豆中毒对绵羊纤维素降解效率的影响。将12只和田羊随机分为对照组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组。试验组分别按10g/kg和20g/kg的剂量饲喂小花棘豆,至典型临床症状出现为止。攻毒前及攻毒后每隔7d取瘤胃液,利用巢式PCR技术检测瘤胃液中溶纤维丁酸弧菌数量的变化,并检测甘油三酯消失率和纤维素降解率。结果显示,与对照组相比,试验羊瘤胃液中溶纤维丁酸弧菌数、甘油三酯消失率和纤维素降解率均极显著下降。试验表明,小花棘豆中毒可显著影响和田羊瘤胃溶纤维丁酸弧菌数量和纤维素降解能力,且具有一定的时间和剂量效应关系。     

陕西某羊场莎能奶山羊球虫分离鉴定及感染情况

对陕西省某羊场莎能奶山羊的球虫感染情况进行调查研究,应用球虫卵囊富集技术,结合形态学方法对采自该场2～12月龄的49份（≤2月龄22份;3～5月龄13份;6～12月龄14份）奶山羊新鲜粪便样品进行球虫卵囊分离,显微镜检测和OPG（Oocysts per gram）统计。结果显示,莎能奶山羊球虫总感染率为98.0%（48/49）,OPG统计发现,3～5月龄羔羊球虫平均OPG最高,为2 442个/g。最高OPG存在于2月龄羔羊样品中,为15 083个/g,且该羊只出现严重腹泻症状。对富集分离到的球虫卵囊进行孢子化和种类鉴定,共鉴定出7种山羊艾美耳球虫。进一步对随机提取的277个孢子化球虫卵囊进行优势虫种统计分析,其中雅氏艾美耳球虫（Eimeiria ninakohlyakimovae）、阿氏艾美耳球虫（E.arloingi）和柯氏艾美耳球虫（E.christenseni）占比最高,依次为17.3%（48/277）、15.9%（44/277）和15.2%（42/277）,是该羊场莎能奶山羊球虫的优势虫种。综上所述,初步明确该羊场莎能奶山羊不仅普遍存在球虫感染,而且存在多种球虫混合感染和致病力较强的优势虫种。     

绵羊Noggin基因的克隆、序列分析与原核表达

根据同源序列克隆原理设计一对引物,以绵羊脑组织总RNA的反转录产物为模板,利用RT-PCR扩增绵羊Noggin基因cDNA全长编码区,克隆到pMD-18T载体。测序验证后,提取pT-Noggin质粒经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切回收目的条带,亚克隆到pET41a原核表达载体,转化BL21(DE3)菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。序列分析表明,绵羊Noggin基因的cDNA全长编码区(GenBank登录号为FJ751853)为699bp,编码232个氨基酸,与其他哺乳动物氨基酸序列同源性达到95%以上。SDS-PAGE结果显示,诱导表达的融合蛋白大小为60ku,与预期蛋白大小一致。Western blot检测结果显示,该蛋白为His融合蛋白。说明成功克隆了绵羊Noggin基因的编码区序列,构建了原核表达载体,在大肠杆菌中成功表达出目的融合蛋白。     

绵羊NICD基因的克隆、真核表达及其序列分析

采用RT-PCR技术扩增绵羊Notch基因胞内段功能结构域(NICD),将其克隆到慢病毒表达载体中,在293T细胞中对其进行真核表达,通过Western blotting鉴定其蛋白表达,进一步对NICD核酸和氨基酸序列进行分析。结果表明,首次克隆获得绵羊NICD基因,该基因序列为2 388bp(GenBank登录号为KF318190.1),编码795个氨基酸,重组蛋白分子质量为110ku左右。序列分析结果显示,核酸序列与牛、马、人和小鼠的同源性分别为96%、90%、87%和83%,进化上与牛的关系最近;蛋白序列与牛、马、人和小鼠的同源性分别为96%、90%、87%和84%,预测二级结构可能存在26个α-螺旋、13个β-折叠、66个转角和64个无规则卷曲。     

绵羊Spry4基因的克隆、真核表达及序列分析

为探究Spry4在绵羊毛囊发育过程中的作用,以美利奴羊皮肤组织总RNA的反转录产物为模板,采用PCR技术扩增获得Spry4基因全长编码区,并克隆至pCRTMBluntⅡ-TOPT@vector载体进行测序。随后将ToPo-Spry4亚克隆至pcDNA3.0真核表达载体,再经脂质体转染至293T细胞表达,通过Western Blot鉴定表达产物,分析Spry4核酸和氨基酸序列。结果表明,首次克隆获得绵羊Spry4基因编码序列(GenBank登录号KP280032),序列长954bp,编码298个氨基酸,与其他哺乳动物氨基酸同源性达91%以上;预测Spry4蛋白不存在信号肽和跨膜结构域;Western Blot检测显示,重组表达的蛋白分子质量为36ku,与预期一致。     

2个绵羊群体BMPR-IB基因多态性与绵羊产羔数的关系

旨在探讨BMPR-IB基因在不同绵羊群体中的遗传变异及其与产羔数的关系,利用RFLP技术分析杜泊及滩寒杂交羊群体中BMPR-IB的基因型和基因频率,以及不同基因型对母羊产羔数的影响。结果显示:杜泊羊群体均为野生型,未检测到突变纯合或杂合基因型个体。滩寒杂交群体中突变纯合子(BB型)、杂合子(B+型)和野生型(++型)个体数分别为13、48和120。在滩寒杂交羊群体中,BB、B+及++基因型母羊的多羔率分别为63.64%、47.06%和32.08%;BB型经产个体平均产羔数比杂合型(B+)及野生型(++)个体产羔数分别高出0.5和0.59,而杂合子母羊产羔数高于野生型个体,但差异不显著。表明BMPR-IB基因Fec B突变位点对滩寒杂交群体产羔数有显著影响,因此可通过杂交手段提高后代群体Fec~B基因频率来增加产羔数,但BMPR-IB基因是否为调控杜泊羊产羔数的主效基因有待进一步探讨。     

不同绵羊品种FSHR基因多态性及其与产羔数的关联分析

旨在探究阿勒泰羊、和田红羊、吐鲁番黑羊中FSHR基因g.75132817C>T、g.75320579G>A、g.75320741G>A突变位点的多态性与产羔数的关系,为高繁殖力绵羊的选育提供新的分子标记。利用竞争性等位基因特异性PCR（The kompetitive allele specific PCR genotyping system,KASP）技术对FSHR基因的3个突变位点进行分型,利用SPSS 19.0进行关联分析。结果表明,g.75132817C>T位点在3个群体中均表现为中度多态（025A和g.75320741G>A位点在3个群体中均为低度多态 （PIC<0.25）。g.75132817C>T位点中,和田红羊突变型TT个体产羔数显著高于野生型CC个体（P< 0.05）。g.75320579G>A位点中,阿勒泰羊野生型GG个体产羔数显著高于杂合型GA个体。g.75320741G>A位点中,阿勒泰羊野生型GG个体产羔数极显著高于杂合型GA个体和突变型AA个体;吐鲁番黑羊突变型AA个体产羔数显著高于野生型GG个体。因此,推测FSHR基因g.75132817C>T位点适用于和田红羊产羔数的选育;g.75320741G>A位点适用于吐鲁番黑羊产羔数的选育。     

E.coli对藏羊EECs相关凋亡因子表达的影响

为了探究大肠杆菌(E.coli)对藏羊子宫内膜上皮细胞(EECs)相关凋亡因子表达的影响,采用酶消化法培养EECs,用不同感染复数(MOI)进行E.coli感染试验,通过流式细胞术(Flow CytoMetry,FCM)检测EECs的凋亡率,用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及免疫印迹法(Western Blot)...