油茶ACP基因的全长cDNA克隆及序列分析

酰基载体蛋白是脂肪酸合成中的关键蛋白质,位于脂肪酸合成酶系的中央,作为脂酰基的载体将脂酰基从一个酶反应转移到另一个酶反应.以油茶近成熟种子cDNA文库和EST文库为基础,采用分子生物学技术分离克隆了油茶酰基载体蛋白基因全长cDNA序列.结果表明：油茶酰基载体蛋白基因的全长cDNA为669bp,包含1个完整的CDS及3′UTR和5′UTR,编码141个氨基酸,该基因被命名为co-acp并提交至GeneBank,登录号是EU717697;油茶酰基载体蛋白基因的推导氨基酸序列与其它15种植物的ACP进行AlignX比较的结果表明,油茶酰基载体蛋白与油橄榄ACP的相似性最高,而且遗传距离最近;预测油茶酰基载体蛋白的二级结构以α螺旋为主,没有跨膜结构域和信号肽,其等电点约为4.995.     

油茶DGAT1基因植物表达载体的构建

DGAT酶是三酰甘油(TAG)合成的Kennedy途径中唯一的限速酶,因此直接影响三酰甘油(TAG)的累积.本研究在已克隆分离到Co-DGAT1基因全长cDNA序列的前期基础上,利用含有双酶切位点的特异引物扩增出Co-DGAT1基因的开放读码框,定向克隆到植物转化载体pBI121中,并采用冻融法导入农杆菌LBA4404,为进一步通过转基因技术研究该基因的功能奠定了基础.     

油桐LEC1基因的cDNA克隆与序列分析

为了解LEC1(Leafy Cotyledon 1)基因对油桐油脂合成过程的调控机理,以油桐种仁转录组数据库中基因的部分c DNA序列为基础,采用RT-PCR技术从油桐种子中克隆LEC1基因的全长c DNA,并对其进行序列分析。油桐LEC1基因全长c DNA为1 152 bp,编码区为729 bp(142~870),编码243个氨基酸,5′端非编码区和3′端非编码区分别为141 bp和263 bp。该基因编码蛋白质的相对分子质量为27 025.4 Da,理论等电点为6.97;蛋白二级结构以不规则卷曲和α螺旋为主,是不具有跨膜结构的膜外蛋白。经对比发现,油桐LEC1具有典型的HAP3结构特点,在不保守的N端和C端中间有1个十分保守的结构域,与拟南芥、玉米、麻风树、黄连木等的LEC1氨基酸序列高度同源。     

茶树2个MYB转录因子基因的克隆及表达分析

MYB类转录因子是一类包含一段保守的DNA结合结构域的基因家族,广泛地参与植物发育和植物次生代谢的调节。根据前期芯片杂交和文库筛选得到的2个MYB转录因子的部分序列,采用RT-PCR和RACE技术分离得到它们的全长基因:CsMYB1和CsMYB2,在GenBank的登录号分别为HQ660373和HQ660374。序列分析表明:CsMYB1基因全长1132bp,开放阅读框长879bp,编码292个氨基酸,推测的蛋白分子量约为32.9ku,理论等电点为8.13;CsMYB2基因全长1020bp,其中开放阅读框长675bp,编码224个氨基酸,推测的蛋白分子量约为25.4ku,理论等电点为9.05。2个基因编码的蛋白均具有明显的R2R3MYB结构域,且在R3结构域的下游都含有1个相对保守的C1(LIXXGIDPXTHR)基序。同源性分析表明:茶树CsMYB1和CsMYB2编码的氨基酸序列与其他植物的MYB类转录因子具有较高的相似性,其中CsMYB1编码的氨基酸序列与陆地棉MYB1的相似性为57%,CsMYB2编码的氨基酸序列与葡萄MYBC2的相似性为75%。利用荧光定量PCR技术检测2个转录因子基因在遮荫处理条件下的表达规律,及其在茶树不同组织中的表达特性,结果表明:CsMYB1和CsMYB2在不同组织中均有表达,但表达量具有明显区别,其中CsMYB2在叶片中的相对表达量是根中的100多倍;而遮荫处理能明显降低叶片中的花青素含量,并提高CsMYB1的表达,但对转录因子CsMYB2的影响不大。     

基于油茶组59万条EST序列的转录组学初步分析

油茶组(Camellia Sect.Oleifera)植物是我国特有的木本油料植物,主要分布全国14个省(区),种植面积达300万hm2.茶油为油茶组多个树种种仁油的统称,其中以油茶(Camellia oleifera)最为常见,其次是浙江红山茶(C.chekiangoleosa)和短柱茶(C.brevistyla)等.     

油茶脂氢过氧化物裂解酶基因的克隆与序列分析

以油茶近成熟种子为材料,根据油茶EST文库中已知的脂氢过氧化物裂解酶EST序列,利用3’RACE与5’RACE技术,克隆到脂氢过氧化物裂解酶的全长cDNA序列。该基因全长1648bp,,包含一个1476bp开放阅读框长,编码491个氨基酸,5’与3’非编码分别为52bp、121bp。预测该蛋白相对分子量为54.7779KDa,等电点为6.77,是个叶绿体转运肽,N端包含有22个疏水氨基酸残基组成的序列,不仅具有转运肽富含的丝氨酸,还含有大量转运肽中很少存在的脯氨酸。多序列比对发现油茶脂氢过氧化物裂解酶核苷酸序列与茶的相似性达到96%,因此将该基因命名coHPL。     

馥郁滇丁香LgFKF1基因的克隆及节律表达分析

[目的]研究馥郁滇丁香LgFKF1基因的结构特点及其在特异组织中的节律表达特征,探索其在成花调控过程中的作用。[方法]采用RACE技术克隆获得馥郁滇丁香LgFKF1基因的cDNA全长序列,利用生物信息学方法对获得的基因核苷酸序列及编码蛋白质序列进行分析,利用qRT-PCR技术对特异组织的节律表达模式进行分析。[结果]序列分析表明:LgFKF1基因cDNA全长为2 271 bp,开放阅读框为1 917 bp,编码一个638个氨基酸的蛋白质;推导的氨基酸序列与扁果树、软枝黄蝉、纳塔尔倒吊笔、马利筋的FKF1蛋白具有较高同源性,达92.59%;预测LgFKF1蛋白属于不稳定的亲水性蛋白,定位在细胞核,无信号肽和跨膜区;结构主要由无规则卷曲结构、α螺旋结构、扩展长链和β-转角构成;遗传进化关系与扁果树最亲近。qRT-PCR分析表明:LgFKF1在诱导光周期下处理7 d时较非诱导光周期下的表达量高,而诱导光周期下处理10 d后其表达量则低于非诱导光周期的表达。一天中,LgFKF1在各组织中均有表达,且以叶片中的相对表达量较高。LgFKF1因组织不同在不同的时间呈现出单峰和双峰表达,其中,根、芽及...     

平榛ChWRKY2转录因子的克隆及在低温胁迫下的表达分析

根据平榛花芽转录本高通量测序的结果,采用RACE-PCR技术克隆到一个全长675 bp,编码179个氨基酸的平榛WRKY基因,命名为ChWRKY2。ChWRKY2蛋白序列中只含有一个WRKY结构域,锌指结构为C-X4-C-X23-H-X1-H,属于WRKY家族第Ⅱ类成员。对ChWRKY2基因进行实时荧光定量PCR表达分析,结果表明:平榛雌花芽中ChWRKY2在12月份的表达量最高,随后表达量逐渐下降。4℃低温胁迫处理根蘖苗4 h后,叶片中ChWRKY2的表达量快速升高,并在8 h达到最大表达量。此外,ChWRKY2在不同器官中的表达具有差异性,雄花序中表达量最高,其次是雌花芽,树皮(韧皮部)中表达量最低。     

油茶查尔酮合酶和异构酶基因的cDNA克隆

查尔酮合酶和查尔酮异构酶是类黄酮代谢与色素苷代谢的关键酶.以油茶近成熟种子cDNA文库和EST文库为材料,通过分子克隆方法鉴定了1条查尔酮合酶基因全长cDNA和1条查尔酮异构酶全长cDNA.结果表明:油茶查尔酮合酶基因的cDNA含1479 bp,编码412个氨基酸,为目前最长的查尔酮合酶,与其它物种的查尔酮合酶具有极高的相似性,在进化上高度同源;油茶查尔酮异构酶基因的cDNA含899 bp,编码206个氨基酸,与茶的查尔酮异构酶基因高度同源,但与其它物种的相似性较低.     

百合MDHAR基因的克隆与表达分析

抗坏血酸(ascorbic acid,AsA)作为植物细胞内重要的自由基清除剂,是通过参与一系列的氧化还原反应而发挥抗氧化剂的功能.单脱氢抗坏血酸还原酶(monodehydroascorbate reductase,MDHAR)在抗坏血酸-谷胱甘肽循环中,可以将氧化型抗坏血酸(MDHA)还原为还原型抗坏血酸(AsA),在维持植物体内抗坏血酸的正常代谢和植物体氧化还原平衡方面起着重要作用(Chen et al.,2003;2005).     

重瓣山茶花器官发育相关基因CjAPL1的全长克隆与表达分析

为研究A功能基因在山茶花重瓣形成过程中所发挥的功能,利用同源克隆和RACE扩增方法,从重瓣山茶花品种‘金盘荔枝’发育早期的花芽中获得了山茶花AP基因全长cDNA,命名为CjAPL1,GenBank登录号JX657332。该基因全长1 149 bp,其中,开放阅读框(ORF)长度为741 bp,5’非编码区长度206 bp,3’非编码区长度202 bp。经氨基酸序列分析表明:CjAPL1基因编码一条含有246个氨基酸的蛋白质,与猕猴桃、八仙花等植物的Ap1蛋白同源性均在75%以上。Rea-time PCR结果显示,CjAPL1基因在‘金盘荔枝’不同发育时期花芽中的表达量为:花芽发育早III期>花芽发育早II期>花芽发育早I期>现蕾期,表达趋势表现为先逐渐升高而后急剧降低;花器官不同部位中的表达量为花柱最高,其次为子房和萼片,在雄蕊下部和外轮花上部中的表达量最低。这些差异表明,CjAPL1基因可能在‘金盘荔枝’重瓣花形成中发挥作用。     

中国水仙ZDS基因的克隆及表达分析

中国水仙(Narcissus tazetta L.var.chinensis Roem)是我国著名的传统名花,其花姿秀美,花香馥郁,在花卉出口中占有重要份额;但长期以来,中国水仙品种稀少,花色单一,所以花色创新一直是中国水仙育种的重要目标之一.     

油茶种子EST文库构建及主要表达基因的分析

为研究油茶种子在油脂转化高峰期的基因表达并分离克隆与油脂合成等有关的重要基因,以油茶优良无性系湘林1号和湘林4号近成熟种子为材料构建cDNA文库;随机挑取2 327个克隆进行3'端测序构建EST文库.将数据完整并无X、N的1 979条cDNA序列与NCBI核酸数据库的非冗余序列进行同源性比较,确认763条cDNA序列与核酸数据库中其他物种的DNA序列具有很高或较高的同源性,可确认266种基因;有1 216个克隆序列为未知功能的基因序列.各类基因表现出不同的表达丰度,其中贮藏蛋白基因、与基因表达调控相关的基因、抗逆相关基因、种子成熟和胚胎发育相关的基因等为高丰度表达,与脂肪酸代谢相关的基因等为中丰度表达,另外还有大量的其他基因和未知功能基因在种子中表达.各类基因表达的数量和趋势与种子接近发育成熟阶段相吻合.     

杉木木质素合成酶基因CCR的克隆和序列分析

以杉木(Cunninghamia lanceolata)茎叶为材料,根据已报道的肉桂酰辅酶A还原酶(Cinnamoyl-CoA reductase,CCR)基因保守区设计简并引物,采用RT-PCR结合RACE的策略克隆获得杉木CCR基因的全长cDNA(命名为CLCCR),该基因cDNA序列全长1 379 bp,具有一个975 bp的开放阅读框(Open Reading Frame,简称ORF),编码324个氨基酸,序列分析表明:杉木CCR基因核苷酸序列与已报道的欧洲云杉(Picea abies,CAK18610.1)CCR基因具有87%的相似性;与其他植物氨基酸序列聚类分析显示杉木与松科植物欧洲云杉、马尾松(Pinus massoniana)、火炬松(P.taeda)的亲缘关系较近。     

灰楸CfPPR1基因的克隆及表达分析

【目的】挖掘调控‘麦缘锦楸’黄色边缘形成的关键基因,明确该候选基因的保守结构域、进化关系及表达特征,为下一步揭示该基因的分子生物学功能奠定基础。【方法】基于前期RNA-seq数据,筛选并克隆了与叶色相关的三角状五肽重复(pentatricopeptide repeat,CfPPR1)基因全长;利用ExPASy、InterProScan和CBS等在线工具对CfPPR1进行等电点、蛋白质结构及不同物种同源序列的进化关系和保守结构域分析;比较了CfPPR1基因在不同光照强度下的表达模式。【结果】该CDS序列全长为1902 bp,编码633个氨基酸,推测蛋白相对分子质量为71.31 kD,理论等电点(pI)为7.26;二级结构分析发现,CfPPR1序列编码的蛋白质空间结构是相对稳定的。系统进化树结果显示,CfPPR1不仅与黄化风铃木、芝麻、丹参等菊分支植物聚为一支,还与非菊分支的苹果、桃和橡胶树等具有较高的同源性,说明CfPPR1具有较高的保守性。对CfPPR1基因的表达模式分析发现,CfPPR1基因表达的上调很可能参与调控了‘麦缘锦楸’黄色边缘的形成。【结论】首次克隆得到了与叶色相关的CfPPR1基因,该基因的获得为进一步后期转基因验证CfPPR1基因功能提供有价值的参考。     

日本落叶松 UDPGDH基因的cDNA克隆和表达分析

以日本落叶松杂交Solexa转录组测序获得的数据为依据,经拼接后获得尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶(UDPGDH)原序列,以该序列两端设计引物,在落叶松亲代和子代幼嫩针叶中成功克隆了UDPGDH基因cDNA序列,序列长1 443 bp,编码480个氨基酸。qRT-PCR结果分析表明:UDPGDH基因的表达量在落叶松杂交子代中远远高于亲本,正交子代的表达比反交子代高,说明UDPGDH在形成细胞壁半纤维素前体物过程中起着非常重要的作用,暗示UDPGDH在子代的高表达有利于杂种优势的形成。     

油茶WRKY基因家族鉴定及逆境胁迫表达分析

【目的】WRKY转录因子在植物应对生物和非生物胁迫中起重要调控作用。油茶是我国南方丘陵地区重要的经济树种,常受各种逆境胁迫影响。深入挖掘油茶WRKY基因家族成员并探讨其应对逆境胁迫的表达调控模式具有重要意义。【方法】以油茶全基因组数据为参考,利用生物信息学方法,鉴定分析了CoWRKYs基因家族成员,并基于油茶逆境胁迫的相关转录组数据,明确CoWRKYs在低磷、干旱和低温等非生物胁迫下的表达模式,最后基于qRT-PCR方法解析CoWRKYs在不同逆境胁迫下的瞬时表达特征。【结果】CoWRKYs基因家族包含89个成员（CoWRKY1～CoWRKY89）。根据系统发育特征可将其分为3大类,I类、II类和III类的数量分别为20、55和14。保守基序分析表明,进化关系密切的CoWRKYs蛋白具有相同或相似的基序组成。CoWRKYs在低磷、干旱、低温等非生物胁迫下表达谱分析的结果显示,65个CoWRKYs呈现显著表达差异,其中17个CoWRKYs同时受三种非生物胁迫的调控,且大部分基因在逆境胁迫下表现为上调表达,推测这些CoWRKYs在油茶的非生物逆境胁迫中可能起正调控作用。qRT-PCR结果表...     

银杏过氧化氢酶基因CAT1的克隆及表达分析

利用RACE技术从银杏中克隆到过氧化氢酶基因(GbCAT1)的cDNA全长。进化树分析结果表明:GbCAT1和其他物种的CAT源自于相同的祖先。Southern杂交显示:GbCAT1属于1个小的多基因家族。实时定量RT-PCR分析表明:GbCAT1在银杏的根、茎、叶和果中都有表达,在叶中的相对表达量最高,其次为果、茎和根。GbCAT1的转录受到ABA、渗透压、紫外、低温和高温胁迫的诱导。水杨酸处理下,GbCAT1相对表达量迅速降低。CAT1基因在逆境条件下的相对表达变化与环境胁迫有关。     

杨树热激转录因子HsfA1d的克隆、表达及单核苷酸多态性分析

利用RT-PCR方法,首次由小叶杨受热激胁迫后构建的cDNA文库中扩增获得一热激转录因子HsfA1d cDNA克隆,测序结果表明克隆的PsHsfA1d cDNA片段总长为2036bp,基因内部含有完整的开放阅读框架,大小为1449bp,可编码长度为482个氨基酸残基的蛋白质,所推导的蛋白质氨基酸序列在HSF DBD结构功能域与拟南芥AtHsfA1d和水稻OsHsfA1蛋白的相似性分别为86.3%和87.4%。组织特异性Realtime-PCR结果显示,PsHsfA1d主要在杨树叶片和根部组织中高丰度表达。非生物胁迫、激素及糖诱导表达表明,PsHsfA1d不仅受高温、干旱与盐诱导表达,还受到激素中GA_3与ABA,及葡萄糖与蔗糖信号的上调表达。组合利用MEGA4.0和DnaSP4.50.7软件对小叶杨36株基因型个体的PsHsfA1d序列进行比对和分析,共检测到207个单核苷酸多态性(SNP)位点,SNP频率为1/16bp,多样性指数π为0.00772。在编码区域,共检测到69个SNP位点,其中37个为同义突变,31个为错义突变,1个为无义突变;非同义突变与同义突变的比率0.132<1,推测在小叶杨物种演化过程...