2012年-2015年我国部分地区禽偏肺病毒的分子流行病学分析

为了调查鸡群中禽偏肺病毒（aMPV）的流行情况,本研究从江苏、辽宁、河南、山东、河北等地有肿头症状的鸡群中取其鼻甲骨和鼻黏液进行 RT-PCR 检测,随机选取9株 PCR 阳性产物对其 F 基因进行序列测定与遗传进化分析。结果表明,280份病料中检出阳性样品142份,阳性检出率达50．7％;9个试验毒株之间 F 基因同源性为99．4％～100％,与 B 型 aMPV 代表株的同源性为97．7％～99．9％,而与 A 型、C型和 D 型 aMPV 代表株的同源性为71．9％～79．4％;由遗传进化树可见,这9株 aMPV 均属于 B 型分支。说明我国鸡群中目前存在 aMPV 感染,B 型毒株是优势流行基因型,从而为禽偏肺病毒疫苗的开发提供了流行病学资料。     

犬瘟热病毒水貂分离株F基因的克隆及原核表达

根据GenBank中登录的犬瘟热病毒F基因序列设计了1对引物，以从水貂犬瘟热病毒中提取的RNA为模板，扩增出一约1000bp的F基因片段。将PCR产物按相应的阅读框架克隆到原核表达载体pET-32a中，并将重组质粒转化E．coli BL21（DE3），用1．0mmol／L IPTG在30℃下诱导表达。结果显示，F基因的表达量约占细菌总蛋白的35％。SDS-PAGE电泳显示，表达产物的分子质量约为55ku，与预计大小相符；经Western-blotting试验进一步证实，该基因获得了正确表达。     

禽偏肺病毒实验室检测方法研究进展

禽偏肺病毒实验室检测方法包括:在细胞生物学方面,主要依靠病毒分离培养、ELISA法等病毒特异性抗原及其抗体的检测等;在分子生物学方面,主要依靠国内外相继建立起来的RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR、LAMP和核酸杂交技术等。本文在综述各种检测方法研究进展的同时,比较了各种方法的优缺点和实用性,为临床兽医科技工作者建立快速、简便、准确、实用的检测方法提供参考。     

禽偏肺病毒研究进展

禽偏肺病毒(avian metapneumovirus,aMPV)可感染火鸡、鸡、鸭以及一些野生禽类,传染性强、传播迅速,易造成继发感染,导致严重的上呼吸道感染和产蛋率下降等症状。该病在世界范围内广泛流行,并呈地方性流行,给养禽业造成严重经济损失。本文以国内外对aMPV在禽类中的流行病学调查和基因分析研究报道为基础,从病原学、流行病学、病毒分离鉴定和防治的角度,对其在禽类中的感染情况和引起的相关疾病进行简要概述;比较多种分子生物学检测方法的优缺点和实用性,为建立快速、简便、实用的aMPV检测方法提供参考。     

B亚型禽偏肺病毒逆转录套式PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank发布的B亚型禽偏肺病毒Fusion(F)基因的保守序列设计2对引物,建立了一种适用于B亚型禽偏肺病毒的逆转录套式PCR检测方法.采用该方法对B亚型禽偏肺病毒山东分离株进行检测,可以特异性地扩增出415 bp的目的片段.此方法具有高度特异性和敏感性,以H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒作为模板进行扩增,结果均为阴性.经检测,该方法第1次PCR扩增的敏感性为102 copies/μL,第2次扩增的敏感性为102 copies/μL,第2次扩增敏感性比第1次高105倍.应用本方法对采自山东省不同地区的64份可疑临床病料进行检测,最终从64份疑似病料中检测出37份为阳性.结果表明,所建立的套式PCR检测方法具有特异、敏感、实用等优点,为B亚型禽偏肺病毒的快速诊断以及深入研究奠定了基础.     

新城疫病毒F基因在大肠埃希菌中的表达及其抗原性分析

构建新城疫病毒融合蛋白F基因的原核表达载体,并将其在宿主菌BL21(DE3)感受细胞中表达.以含有融合蛋白F基因的重组质粒pMD19T-F为模板,设计特异性引物,应用PCR技术扩增获得F基因的F1片段,定向插入原核表达载体pET-28a,构建重组质粒pET-F1,将构建成功的重组质粒pET-F1转化宿主菌BL21(DE3)感受态细胞经IPTG诱导,将其在宿主菌细胞中表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot方法检测.结果显示,成功克隆出了新城疫病毒F1基因片段序列852 bp.构建的pET-F1载体经PCR、双酶切、测序鉴定均无误,转化表达宿主菌后经SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,目的基因被成功表达,并具有良好的反应原性.成功构建了新城疫病毒的融合蛋白F基因原核表达载体,转化宿主细胞后成功表达了融合蛋白F1重组蛋白片段.     

新城疫病毒F蛋白抗原表位串联基因的构建及其原核表达

用自行设计的3对引物,通过RT-PCR从接毒的SPF鸡胚的尿囊液中克隆了新城疫病毒F基因3段抗原表位区段,大小分别为81、108、105bp。应用添加互补性酶切位点的基因工程方法,将3段抗原表位基因片段拼接成多表位串联基因,大小为306bp。将此基因片段插入含组氨酸(His)基因的质粒pET-32-a中,构建了重组质粒pET-32-a-F306。经诱导表达,获得相对分子质量约为31000的融合蛋白,其中F蛋白抗原表位串联基因片段表达产物约为11000。经亲和层析,获得纯化His-F306融合蛋白,进一步用该蛋白免疫小鼠,制备了鼠源抗新城疫病毒F蛋白抗体。经过琼扩、ELISA及Western-blot检测,表明该融合蛋白中的抗原表位串联基因所表达的蛋白具有良好的抗原性。     

蓝舌病病毒VP5蛋白的原核表达及其抗原性分析

为表达蓝舌病病毒(BTV)VP5蛋白并检测其生物学活性,本实验采用RT-PCR方法扩增血清12型BTV的VP5基因,构建重组质粒pMAL-VP5。将重组质粒转化TB1感受态细胞,以0.4 mmol/L的IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果显示,融合了大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP)标签的VP5重组蛋白以可溶形式表达,分子质量约为112.2 ku。利用MBP标签对重组蛋白进行纯化,并以其作为包被抗原,间接ELISA检测山羊血清样品,结果 5份羊血清P/N值均大于1,其中有1只羊检测结果 P/N值为2.396,鉴定为阳性血清,表明重组蛋白可以与VP5抗体反应,可以作为检测BTV VP5抗体的抗原,为今后进一步开展BT诊断研究奠定了基础。     

西尼罗病毒NS1基因的原核表达与抗原性鉴定

为进行西尼罗病毒(WNV)NY99株NS1蛋白的免疫学研究,通过PCR方法扩增WNV NY99株NS1基因,并将其克隆至原核表达载体pMAL-c2X上,构建出重组表达质粒pc2X-NS1,经IPTG诱导得到可溶性的麦芽糖结合蛋白(MBP).NS1融合蛋白(MBP-NS1),其分子质量约为90 ku,约占可溶性菌体蛋白质量的50%.利用直链淀粉树脂柱对MBP-NS1纯化后的重组蛋白的纯度达到60%,westem blot和间接ELISA检测证明纯化的MBP-NS1具有良好的抗原性和特异性,为进一步开展关于WNV NS1蛋白的研究奠定了基础.     

禽呼肠孤病毒σC蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

通过RT-PCR扩增禽呼肠孤病毒σC基因,经EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切处理后与pET-30a原核表达载体连接,获得重组质粒pET-30a--σC.将重组阳性质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后通过Westem blot分析表明重组目的蛋白获得表达,分子量约为42 ku,主要以包涵体形式存在.重组蛋白经纯化后免疫新西兰白兔,三次免疫获得抗σC蛋白的高效免疫血清.经ELISA检测,该血清抗体效价为1:105,并且能够与重组杆状病毒表达的σC蛋白发生特异性反应.禽呼肠孤病毒σC蛋白的表达与兔抗血清的制备为进一步研究该蛋白功能奠定了基础.     

禽流感病毒M2基因在原核系统中表达及其抗原性分析

M2蛋白是禽流感病毒的跨膜蛋白，该结构蛋白具有潜在的抗原性，是禽流感病毒的3种表面抗原之一，在机体内不仅能刺激产生抗体，而且能引起CTL反应。由于其氨基酸序列高度保守，因此以M2蛋白作为抗原，可对不同亚型的禽流感毒产生一定的保护性免疫。     

A、J亚群禽白血病病毒感染肉用种鸡的诊断

通过流行病学调查、剖检病变和组织病理学观察,结合PCR技术检测病原核酸,确诊肉用种鸡群发生了由ALV—A和ALV—J感染而导致的淋巴细胞性白血病和骨髓细胞瘤型白血病。在检测的6只病鸡中,6只病鸡均感染了ALV—J,2只病鸡感染了ALV-A.     

绵羊肺炎支原体P113蛋白N端原核表达及其抗原性分析

绵羊肺炎支原体可感染绵羊及山羊,并导致非典型肺炎的发生.P113蛋白是绵羊肺炎支原体推测的粘附素,为进一步研究P113蛋白的功能,本试验对其N端1～231位氨基酸的片段进行了原核表达,并采用Western b1ot方法对P113蛋白免疫原性进行了分析.结果显示,重组蛋白以包涵体的形式在Rosetta(DE3)工程菌中成功获得表达;经纯化的重组蛋白与抗绵羊肺炎支原体全菌血清发生特异性结合反应,表明P113蛋白是良好的免疫原.     

O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的原核表达与抗原性分析

研究分析了O型口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP1与当前猪FMDV疫苗血清的免疫反应性.将VP1基因克隆至原核表达载体pET32c,并在大肠埃希菌BL21中得到了表达,Western blot分析表明该重组蛋白与豚鼠O型FMDV标准阳性血清具有良好免疫反应性.目的蛋白经纯化后用ELISA分析其与猪疫苗血清的免疫反应性,结果显示该重组VP1蛋白(rVP1)只能与部分O型FMDV疫苗血清反应.推测当前使用的不同O型FMDV疫苗毒株在VP1重要中和抗原位点G-H环(134 aa～158 aa)与C末端(200 aa～213 aa)存在较大差异.     

禽流感病毒蛋白的抗原性和对机体保护作用的研究进展

禽流行性感冒(Avian Influenza,AI)简称禽流感,是由正黏病毒科A型流感病毒(AIV)引起的一种禽类疾病综合征.慢性或亚临床感染可使家禽的生产力严重下降,如增重减缓、产蛋量下降等;高致病性禽流感(HPAI)可造成家禽100%死亡.     

七彩山鸡F亚群禽白血病病毒的分离与鉴定

为了解广东某七彩山鸡种禽场禽白血病流行情况,通过接种DF-1细胞、ELISA抗原检测、聚合酶链式反应(PCR)、囊膜基因克隆测序等方法分离并鉴定出两株ALV-F,分别命名为FGD1801和FGD1802。为进一步了解分离株遗传进化特点,利用PCR方法扩增出env基因并测序,同时与各亚群参考毒株的gp85核苷酸序列进行对比。结果显示:这两个分离株env基因gp85片段长度都为1080 bp,预计编码360个氨基酸,FGD1801和FGD1802分离株gp85基因核苷酸序列的相似性为92.8%,与A、B、E、J和K亚群共26株ALV参考毒株相似性在47.0%~64.5%之间,而与F亚群参考株的相似性在92.0%~92.5%,显著高于其他亚群,且位于同一进化分支上。研究表明,从七彩山鸡分离的FGD1801和FGD1802属于ALV-F,是我国华南地区新发现的ALV亚群。     

J亚群禽白血病病毒囊膜蛋白胞浆区酪氨酸基序及其变体的表达

J亚群禽白血病病毒(ALV-J)囊膜蛋白Env被认为与其致病致瘤密切相关,然其分子基础尚不清楚.在Env胞浆区发现免疫及肿瘤疾病发生相关的酪氨酸基序(YxxM、ITIM、类ITAM)基础上,研究对GenBank中不同ALV-J毒株Env进行了统计分析.结果发现,34.7％ ALV-J毒株Env仅存在ITIM,63.9％ALV-J毒株Env同时具有ITIM以及YxxM,1.4％ ALV-J毒株Env具有YxxM以及类ITAM.同时,还构建了JS-NT以及4817毒株Env相应酪氨酸变体表达质粒,并在DF1细胞中获得了良好的表达.这些发现及构建的表达质粒,为进一步研究ALV-J Env在ALV-J致病致瘤中的作用及其分子机理奠定了基础.     

猪流行性腹泻病毒CH/GX/2015/750A株S2蛋白的原核表达及抗原性分析

本研究旨在了解猪流行性腹泻病毒（PEDV）S2蛋白的抗原性,为下一步诊断试剂盒及亚单位疫苗的研究奠定基础。试验通过反转录PCR的方法扩增PEDV CH/GX/2015/750A株S2基因部分片段（S2A）,将其克隆后插入原核表达载体pET-32a（+）中,构建原核表达质粒pET32a-S2A。将原核表达质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达重组蛋白,Ni柱亲和层析法纯化重组蛋白,Western blotting检测重组蛋白S2A的反应原性。纯化复性的重组蛋白S2A免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测获得的多克隆抗体效价,间接免疫荧光法验证制备的多克隆抗体的特异性。结果显示,重组S2A蛋白在IPTG终浓度为0.2 mmol/L时,37 ℃诱导表达3 h可获得最高表达量,该重组蛋白主要以包涵体的形式存在;Western blotting结果显示,纯化复性后的重组蛋白S2A能够与PEDV阳性血清发生特异性结合,具有良好的反应原性。制备的多克隆抗体效价可达1：32 000,间接免疫荧光结果表明,制备的多克隆抗体能够特异性识别和结合PEDV。结果表明,PEDV S2A蛋白具有良好的抗原性,可作为诊断试剂盒或亚单位疫苗的候选抗原。     

犬细小病毒北京分离株VP2基因的表达与抗原性分析

本研究基于犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)VP2基因序列设计引物,利用PCR技术扩增该基因。扩增的VP2基因连入表达载体pET-32a(+),经PCR及双酶切鉴定基因连入正确。重组表达载体转入大肠杆菌后,经IPTG诱导,SDS-PAGE及Western blotting分析表明有特异蛋白的表达,分子质量大小为87 ku。将表达的蛋白包被酶标板后用抗犬细小病毒单抗与其反应,表明表达的VP2蛋白可以与相应抗体特异结合。