禽白血病抗原检测试剂盒通过验收

由中国农业大学动物医学院研制的禽白血病抗原检测试剂盒 ,最近通过了国家“948”项目组的验收 ,同时通过了农业部有关专家的评审。专家一致认为 ,此项研究成果填补了国内空白 ,达到国际先进水平。禽白血病病毒是普遍存在的内源性白血病病毒 ,其主要宿主是鸡 ,发病率通常在 3 %～ 3 0 %之间 ,对养禽业危害巨大。但该病临床特征不明显 ,极易与其他疾病混淆 ,过去国内检测只能用进口试剂盒 ,价格高达 5 0 0 0元以上 ,大多数企业难以承受高额检测费用。该课题组用 6年时间 ,对引进技术及资源进行了充分消化吸收 ,并不断探索创新 ,终于研制出具…     

单抗直接Dot-ELISA检测禽脑脊髓炎病毒抗原

本研究在已制备的 AEV单抗基础上建立了检测 AEV抗原的直接 Dot- ELISA方法。该方法对 AEV最低检出量为 8.0 3μg.m L-1。人工感染 1日龄 SPF鸡 ,取临床发病鸡 (6～ 1 3日龄 )相应病料 ,各病料样本病原阳性检出率分别为 :脑 98% ,胰 94% ,十二指肠 80 % ,腺胃 85%。对 1 0 0份临床自然发病鸡病料检测 ,阳性检出率为 90 %。对 1 0份 AEV病原分离阳性样品检测阳性率为 1 0 0 %。     

禽白血病检测方法的建立和比较

提纯的禽成骨髓细胞增生病病毒(AMV)经用吐温-80和乙醚裂解后免疫兔,能获得抗禽白血病病毒(ALV)群特异性(gs)抗原的高特异性抗体,试验结果表明这种抗体能满意和有效地用于各种检测方法中。葡萄球菌 A 蛋白的酶联免疫吸附试验(PPA-ELISA),酶联免疫吸附访验(ELISA),免疫酶组化法(IHCA)和琼脂扩散沉淀试验(AGP)四种方法的比较结果为:PPA-ELISA 的检出率最高,ELISA 的检出率为略低,其次为 IHCA 的检出率,AGP 的敏感性为最低。综合评定为ELISA 是一较为理想和经济的检测方法。广东省部分鸡场抽样检查的结果表明,各鸡场的 gs 抗原的阳性率是很高的,蛋清和胚胎中 gs 抗原的阳性率也很高,显然 ALV 的先天性传递在本病的流行病学中是非常重要的。     

活毒疫苗中禽白血病病毒污染的检测方法探讨

[目的]探讨活毒疫苗中禽白血病病毒污染的检测方法.[方法]随机抽取安徽省鸡群使用的国内外活毒疫苗,使用对禽白血病病毒（ALV）群特异性p27抗原ELISA检测试剂盒进行检测,同时根据禽白血病痛毒各亚群保守的pol基因设计引物,进行PCR检测.[结果]7个国内公司鸡传染性法氏囊B87株检测结果均为阳性,某国外公司鸡痘、鸡传染性喉气管炎检测结果呈阳性,某国内公司为阳性.鸡新城疫lasota株共检测疫苗35份,检出率达28.57％.ELISA检测结果与PCR结果相一致.[结论]使用p27抗原ELISA检测试剂盒和PCR法均可作为活毒疫苗中ALV污染检测的有效方法,说明活毒疫苗中ALV污染是ALV传播的重要因素.     

禽白血病病毒多重PCR检测法的建立及初步应用

根据GenBank中登录的禽白血病病毒A、B、J亚群的核苷酸序列设计合成了3对引物,各对引物可分别扩增出大小约为195、260、924bp的核苷酸片段;经优化建立禽白血病病毒多重PCR检测法,并进行其敏感性试验及对马立克病病毒(MDV)、火鸡疱疹病毒(HVT)、新城疫病毒(NDV)、传染性囊病病毒(IBDV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染性支气管炎病毒(IBV)和DF-1细胞基因组的特异性试验;应用该方法对1 294份临床样品进行禽白血病病毒检测,对阳性检出样品抽样进行测序鉴定.结果表明:该方法的最小检出拷贝数为103,特异性试验均为阴性,检出临床样品中的核苷酸片段与参考毒株核苷酸序列的同源性达98%以上,符合率100%,具有良好的特异性、敏感性和符合率,可为禽白血病病毒感染的临床诊断及流行病学调查研究提供有效借鉴.     

实验感染肉鸡组织中J亚群禽白血病病毒的抗原定位

从实验感染J亚群禽白血病病毒（ALV—J）的髓细胞性白血病肉鸡病例中，选取典型病例。用J亚群禽白血病病毒单克隆抗体通过免疫酶组化试验对不同组织进行了抗原定位观察。结果显示；在实验感染阳性肉鸡体内实质组织细胞及瘤细胞的核膜和细胞浆里可见不同程度的棕黄色阳性反应．可为探讨ALV—J对体内组织细胞的嗜性提供依据。     

草鸡J亚群禽白血病病毒的PCR检测

通过对GenBank发表的ALV的基因序列的分析,针对J型ALV保守区设计并合成1对特异性引物。通过对反应条件的优化,确定了检测ALV的PCR检测方法,对来源于江苏地区不同草鸡养殖基地的10份病料组织样本提取DNA进行PCR扩增。结果对疑似J亚群ALV病料和正常鸡肝脏组织的病原核酸检出率分别为90%和0,同时将扩增的目的基因进行克隆测序,并与GenBank中的参考毒株进行比较,结果表明目的基因片段序列长300 bp左右,与参考毒株核苷酸序列同源性为97%以上。试验表明,江苏地区草鸡群中确实存在J亚群鸡白血病病毒感染的情况。     

实验感染肉鸡组织中J亚群禽白血病病毒的抗原定位

从实验感染J亚群禽白血病病毒(ALVJ)的髓细胞性白血病肉鸡病例中,选取典型病例,用J亚群禽白血病病毒单克隆抗体通过免疫酶组化试验对不同组织进行了抗原定位观察。结果显示:在实验感染阳性肉鸡体内实质组织细胞及瘤细胞的核膜和细胞浆里可见不同程度的棕黄色阳性反应,可为探讨ALVJ对体内组织细胞的嗜性提供依据。     

不同样品对黄羽种鸡禽白血病病毒净化检测效果的影响

【目的】评估黄羽种鸡禽白血病的净化工作,比较源于同一鸡群不同样品对禽白血病病毒(ALV)检测结果的影响.【方法】采用ALV抗原ELISA方法对广东一黄羽种鸡场采集的2 691枚种蛋进行检测,根据检测结果采集其中70份不同S/P区间所对应的母鸡抗凝血,分离血浆后分别同时接种于CEF和DF-1细胞,用病毒分离方法进行检测,并用PCR方法进行亚群鉴定.【结果和结论】从送检种蛋蛋清共检出ALV p27阳性样品243份,阳性率为9.03%(243/2 691);蛋清不同ELISA S/P区间所对应的病毒分离情况分别为:蛋清ELISA S/P≥2.0的鸡只其血样CEF和DF-1细胞病毒分离率均为100%;1.5≤S/P2.0的鸡只病毒分离率均为88.9%;1.0≤S/P1.5的鸡只病毒分离率均为85.7%;0.2≤S/P1.0的鸡只病毒分离率分别为60%~75%(CEF)和40%~50%(DF-1);0.1≤S/P0.2的鸡只病毒分离率为62.5%(CEF)和50%(DF-1);S/P0.1的鸡只分别为27.2%(CEF)和9.1%(DF-1)的病毒分离率.PCR结果显示,所有7份CEF+DF-1-的CEF培养物中有6份为内源性ALV-E.研究表明,在蛋清ELISA检测时,S/P越高的阳性蛋清样品其对应母鸡越可能是外源性ALV病毒血症阳性;有一定比例S/P较低的阳性蛋清样品是由对应母鸡体内的内源性ALV排毒所致;而净化初期少数蛋清S/P为阴性的蛋清,其对应母鸡仍可能检出外源性ALV,说明在黄羽种鸡外源性ALV净化方案中单独使用1次蛋清ELISA检测可能会给禽白血病的净化检测造成一定的"误诊"和"漏检".     

禽白血病病原学和检测方法研究进展

禽白血病是一种肿瘤性疾病,给我国养禽业造成了巨大的损失,而病原和检测方法直接影响ALV净化工作的开展。就ALV病原学和检测方法进展进行阐述,为种鸡场开展禽白血病净化提供参考。     

禽白血病病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法建立和应用

针对禽白血病毒p27基因保守区,设计引物和探针人工合成基因片段,连接到载体,构建重组质粒禽白血病-p27,以重组质粒禽白血病-p27为模板进行条件优化,建立禽白血病病毒Taq Man-MGB荧光定量PCR检测方法。验证试验表明方法特异性强,不与其他常见禽的病原发生反应。重复性试验表明该方法具有较好的稳定性,检测灵敏度达到1.68×10copies/μL。同时,应用该方法对临床68份样品进行检测,检出阳性样品26份,与商品试剂盒做对比,二者符合率100%。结果表明建立的方法特异性强,敏感性高,实用性强,为禽白血病净化提供了技术支撑。     

荧光定量PCR方法检测禽白血病病毒的研究

根据禽白血病病毒各亚群pol基因序列相对保守的特点,在其保守区内设计了1对引物,进行RT-PCR反应,扩增产物为214 bp,将该产物连接T载体作为Real-time PCR反应的标准品,利用SYBR Green I染料进行Real-time PCR反应,建立了标准曲线,并进行反应灵敏性、特异性和重复性试验。试验结果表明：标准曲线线性关系R值均为0.999以上,检测极限约为8.21E＋01拷贝数质粒DNA,比RT-PCR灵敏100倍以上;特异性分析表明只有禽白血病病毒能检测到特异性的熔解度峰值;批内和批间重复性试验的变异系数均小于5%;用已建立的方法对人工感染SPF鸡的不同组织进行3次重复检测,病毒RNA的检出率为100%。以上结果表明：该方法稳定可靠,为禽白血病的早期诊断建立了特异、灵敏和快捷的方法。     

长沙市某鸡场混合感染禽白血病与马立克氏病毒的分子诊断

为了解长沙市某鸡场发病鸡死亡具体病原,该文对采集病鸡组织病料进行病原的鉴定及重要基因的测序分析,结果表明,引起病鸡全身内脏器官肿大,肝脏、脾脏及肾脏,出现不同程度的肿瘤结节主要由禽白血病病毒和马立克氏病毒混合感染导致。进一步对毒株ALV的env和MDV-meq基因进行序列分析表明,ALV env基因与内源性ALV处于同一进化分支,MDV-meq基因与我国MDV野毒株处于同一进化分支。说明该鸡群为MDV野毒株和内源性ALV混合感染,建议后期鸡场在种源净化、疫苗免疫及生产管理方面做好疫病防控。     

间接Dot—ELISA检测EDS—76病毒抗原的研究

本研究成功地建立了间接酶联免疫吸附试验（Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ）用于检测ＥＤＳ－７６病毒抗原的标准化程序。对纯化ＥＤＳ－７６病毒抗原的最低检出量为１ｎｇ／Ｄｏｔ,其敏感性约为ＨＡ的１５．６倍。ＥＤＳ－７６阳性鸡血清特异性阻断试验及交叉反应试验证明,该法对ＥＤＳ－７６病毒抗原的检测具有特异性。试验结果表明,间接Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ检测ＥＤＳ－７６病毒抗原,具有敏感性高、特异性强、重复性好、经济、方便、快速等优点,适合于大规模样本的检测。     

J亚群禽白血病病毒TD-PCR检测方法的建立及初步应用

采用J亚群禽白血病病毒(ALV-J)感染DF1细胞提取的总DNA作为模板,以H5和H7为特异性引物,建立检测ALV-J的降落PCR(TD-PCR)方法,并对反应体系进行优化。结果表明:建立TD-PCR方法灵敏度高、特异性强,可检测0.105 ng的DNA,该方法与网状内皮组织增生症病毒、马立克病病毒、鸡贫血病毒及I群禽腺病毒没有交叉反应。运用TD-PCR、ELISA以及病毒分离对临床病料进行检测,TD-PCR方法与ELISA检测结果一致(100%),均比病毒分离检出率(75%)高。证明TD-PCR检测ALV-J的方法具有快速、灵敏、特异等优点,可满足临床、生产实际检测的需要。     

鸡传染性法氏囊病毒抗原捕获ELISA检测方法的建立及应用

为快速检测鸡传染性法氏囊病毒,使用纯化的鸡抗IBDV多克隆抗体和鼠抗IBDV单克隆抗体,建立了抗原捕获ELISA检测鸡传染性法氏囊病毒的方法.使用建立的方法可以检测到1:160倍稀释的IBDV疫苗及阳性法氏囊组织中的病毒.检测禽流感、新城疫、鸡传染性支气管炎病毒及沙门氏菌、葡萄球菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、肺炎球菌等结果均为阴性.检测IB-DV超强毒和疫苗毒人工感染鸡的法氏囊、脾、肝及临床样品78份,检出阳性24份,与RT-PCR检测结果相符率为96%(75/78).说明建立的方法敏感、特异,可用于法氏囊病的诊断和监测.     

禽白血病J亚型病毒分离鉴定及其gp85基因克隆表达

禽白血病(Avian leukosis)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)和禽肉瘤病毒(Avain sacroma viurs,ASV)群中病毒引起禽类多种肿瘤性疾病统称.文章从临床疑似病鸡中经临床症状观察、病理学检查和分子生物学鉴定等方法分离出一株ALV J亚型病毒.从感染鸡病料提取前病毒DNA,根据NCBI发表ALV基因序列设计引物,扩增该病毒gp85基因,扩增出924 bp目的条带,利用pET-30a载体构建原核表达质粒,鉴定正确后转化入Rosetta中进行诱导表达,表达40 ku蛋白以包涵体形式存在,有良好免疫原性,为ALV进一步研究提供实验材料.     

J亚群禽白血病病毒中国分离株的人工致病性试验

 通过接种 1日龄AA肉用型鸡和 11日龄SPF鸡胚 (蛋用型鸡 )对 4个J亚群禽白血病病毒 (ALV J)中国分离株的致病性进行了研究。在连续观察的 6个月中 ,只有从病鸡分离到的SD990 2株ALV J可诱发急性髓细胞瘤(ML)。在SD990 2株病毒人工接种的 12只 1日龄的AA肉用型鸡中 ,有 9只分别在 2 2～ 38日龄死亡 ,其肝、脾显著增生性肿大 ,并显现弥散性分布的细小的灰白色结节 ,心肌上可见许多大小不一的肿瘤结节。病理组织切片中 ,在肝脏、心肌和骨骼肌等组织中均可见胞浆中大量充满嗜酸性颗粒的髓细胞样肿瘤细胞。其余 3株病毒感染的肉用型鸡无肉眼可见的肿瘤性变化 ,生长和临床表现正常。显然 ,SD990 2株ALV J为急性转化型病毒 ,而SD990 1、YZ990 1和YZ990 2这 3株病毒仍属致病性较弱的非转化型病毒。 11日龄的SPF鸡胚 (蛋用型鸡 )在接种这 4株病毒后孵出的鸡 ,在近 7个月的连续观察中 ,没有发现肿瘤性变化 ,其生长和临床表现基本正常 ,表明这 4株中国株ALV J对蛋用型鸡不表现致瘤性