饲料与动物产品中牛、羊源性成分的多重PCR检测

以鱼粉、奶粉、牛奶、果乳、鱼油及牛油为试验材料,进行了18S rDNA片段、牛源性成分和羊源性成分之间的多重PCR检测。多重PCR检测结果与单一PCR检测结果完全一致。结果表明,多重PCR方法用于进出口饲料及动物产品中牛、羊源性成分的同时检测是可行的。     

动物源性饲料中牛源和羊源性成分的检测方法

主要介绍了几种动物源性饲料中牛源和羊源性成分检测较为常用的检测法:显微组织检测法、免疫学法、近红外光谱检测法和PCR检测法以及不同检测方法的适用范围,重点介绍了PCR检测法及注意事项。     

饲料中牛、羊源性成分现场可视化检测方法的建立

根据牛、羊线粒体中物种特异性序列设计引物,应用可视化环状等温扩增技术（visual loop-mediate isothermal amplification,vLAMP）对牛、羊源性成分进行快速扩增及可视化判断,同时建立牛、羊源成分人工污染的饲料模型,考察vLAMP检测方法的灵敏度。结果表明,牛源性引物和羊源性引物仅分别对牛、羊源性成分产生特异性扩增,灵敏度高达0.001%。本试验所建立的牛、羊源性成分现场可视化筛查方法具有较高的特异性与灵敏度,操作简单、快速,可用于饲料中牛、羊源性成分污染和食品掺伪的现场可视化检测。     

动物产品中猪源性和牛源性成分双重荧光PCR检测方法的建立

[目的]建立双重荧光PCR法,检测动物产品中猪、牛源性成分。[方法]分别针对猪、牛线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）种间保守基因,设计特异性引物与探针,通过对反应体系和反应条件的优化筛选,建立了双重荧光PCR方法,在同一个荧光PCR反应中完成2种动物源性成分的检测。并对该方法的特异性、敏感性进行评估。[结果]对16种不同的动物DNA进行检测．仅猪、牛源性成分收集到相应的典型的S型扩增曲线,对猪、牛二联模板的检测,可同时收集到相应模板的扩增曲线．其余14种动物源性成分未发现扩增曲线。双重荧光PCR对猪肉、牛肉模板的最低检出限均为10^-5,与相应的单重荧光PCR方法的检出限一致。[结论]该方法特异性强,敏感性高,适用于肉制品、奶制品、饲料等动物源性产品的检测。     

变性高效液相色谱技术鉴别猪牛源性成分的试验

建立了检测动物源性食品中猪、牛成分的PCR结合变性高效液相色谱技术,为牛、羊成分的鉴别提供一种新的分子诊断技术。以猪、牛的线粒体DNA为靶基因,设计特异性PCR引物。双重PCR扩增后,DHPLC分析。经优化DHPLC最佳条件为:使用PS-DVBC18 DNASep色谱柱(4.6 mm×50 mm,粒度3μm),设定50℃柱温,起始流动相为:45%缓冲液A和55%缓冲液B,流速0.9 m L/min;上样量:PCR产物5μL。结果表明:DHPLC法具有良好的特异性,仅能检出猪、牛源成分,而与羊、鸡、鸭源成分无交叉反应;方法的灵敏度可以达到1 000 copies核酸。     

2种PCR方法检测饲料中牛和羊源性成分灵敏度

疯牛病自发生以来已给全球畜牧业带来了巨大的损失,已成为一种严重危害人类生命安全的传染病.因此,建立起有效的饲料中牛和羊源性成分的检测方法,避免带病毒的动物和饲料在市场上和国际间流通显得刻不容缓.目前,我国主要采用PCR方法进行饲料中牛和羊源性成分的检测.文章拟对普通PCR和Realtime PCR 2种方法的灵敏度进行比较,希望寻找出一种有效和灵敏度更高的方法,为实际的检测工作提供依据.     

实时荧光PCR法检测饲料中牛、羊源性成分

为了快速准确地检测饲料中牛、羊源性成分,试验采用实时荧光PCR方法,分别以牛、羊各自物种特异性基因为研究对象,设计实时荧光PCR扩增的特异性引物及探针,建立饲料中牛、羊源性成分的实时荧光PCR检测方法。结果表明:该检测方法特异性强、灵敏度高(达到0. 01%),可以作为饲料中牛、羊源性成分检测的常规方法。通过对15种市售饲料样品进行检验,结果 2种饲料骨粉未标明含有羊源性成分,但检出;1种饲料骨粉标签中未标明成分,但检出牛源性成分,证实该方法操作简便快捷,可以快速、准确、大批量地开展饲料的日常检测工作。     

动物蛋白饲料中动物源性成分的鉴别I．同一PCR鉴别动物蛋白饲料中牛羊成分

为了防止牛海绵状脑病(俗称疯牛病)和羊痒病传入我国，对来自疫区国家的动物源性饲料进行动物种类鉴别非常必要。本研究根据牛羊特异性卫星DNA建立了同一PCR体系同时检测羊、牛源性物质的方法。应用DNA提取液制备模板，不但有效地缩短了试验时间，还大大降低了成本，有利于在生产实际中推广应用。     

反刍动物饲料产品和动物源性饲料产品中牛羊源成分检测

[目的]检测反刍动物饲料和动物源性饲料中牛羊源成分,掌握动物饲料安全情况。[方法]利用聚合酶链式反应法（PCR法）对反刍动物饲料产品（预混料、精料补充料、全价配合料等）和动物源性饲料产品（鱼粉、肉粉等）共计300个样品进行了牛羊源成分检测。[结果]牛羊源性成分检测合格率为99.33%。其中,反刍动物饲料产品260批次,牛羊源性成分合格率为99.23%;动物源性饲料产品40批次,均未检出牛羊源性成分。2个阳性样品均为牛源阳性。[结论]反刍动物饲料产品存在潜在的安全隐患。     

动物产品中牛、羊源性成分多重PCR检测方法的建立

以肉骨粉、鱼粉、猪肉干和鱼肉干为研究对象,异硫氰酸胍法提取总DNA,18S rDNA片段的扩增结果表明提取到的DNA中不存在抑制PCR的物质。应用梯度PCR技术对牛、羊源性成分检测的退火温度进行了优化,在单一PCR检测技术的基础上分别进行了18S rDNA片段和牛、羊源性成分的多重PCR分析,得到了预期的结果。试验表明,本文建立的多重PCR方法具有快速、简便、准确等特点,对动物产品牛、羊源性成分检测具有重要意义。     

实时荧光PCR和常规PCR方法检测饲料中鸡源性成分

根据鸡线粒体DNA序列,设计并筛选了鸡源性特异引物及探针,建立了饲料中鸡源性成分的常规PCR和实时荧光PCR检测方法,结果表明常规PCR方法最低可以从饲料中检出0.1%的鸡源性成分,实时荧光PCR方法最低可以从饲料中检出0.001%的鸡源性成分。该方法具有很高的特异性和灵敏性,可以作为鸡源性成分鉴别检测的常规方法。     

应用多重Taqman-LNA荧光PCR同时检测肉制品中猪鸡鸭源性成分

为了建立同时检测肉制品中猪、鸡、鸭3种动物源性成分的多重Taqman-LNA荧光PCR,给打击肉制品掺假提供技术手段。针对动物线粒体基因组的保守序列,设计特异性引物和Taqman-LNA探针,建立同时检测肉制品中猪、鸡、鸭源性成分的多重荧光PCR方法,并应用于市售肉制品的检测。建立的多重Taqman-LNA荧光PCR方法可同时检测肉制品中上述动物源性成分,与牛、羊、驴、兔、鹅等动物源性成分无交叉反应,其检测限均达到肉含量的0.001%。对170份市售肉制品检测发现,有42份样品检出与标签标示成分不符的肉种成分,样品不合格率为24.7%。本研究建立的多重Taqman-LNA荧光PCR方法可同时检测肉制品中猪、鸡、鸭3种动物源性成分,具有特异、快速、经济、高效等优点,可适应于肉制品中多种肉源性成分的高通量检测。     

动物油脂中DNA的提取及牛、羊源性成分的PCR检测

用异硫氰酸胍法提取鱼油、加入牛肉DNA的鱼油、加入山羊肉DNA的互油和牛油中的DNA。18S rDNA片段以及牛、羊源性成分的PCR扩增结果表明，建立的动物油脂DNA提取方法是可行的。用建立的DNA提取方法提取3份送检鱼油的DNA，牛、羊源性成分的PCR检测结果均为阴性。     

运用SYBR Green Ⅰ熔解曲线法检测饲料中牛、羊源性成分的研究

试验旨在建立SYBR Green Ⅰ熔解曲线法对饲料中牛、羊源成分进行检测,以SYBR GreenⅠ为荧光染料,通过优化PCR反应体系,提高了检测灵敏度。在随机抽检的145批样品中,与国标法（GB/T20190-2006）相比,SYBR GreenⅠ熔解曲线法的准确性达到了100%,此方法可作为饲料中牛羊源成分检测的一种方法。     

进口饲料中牛源性与转基因成分的检测

本文介绍了进口饲料中牛源性与转基因成分的PCR检测方法。该方法用异硫氰酸胍提取进口饲料样品DNA,以牛特异性引物扩增模板DNA,扩增产物为271bp,PCR产物经限制性酶切片段分析,与预期设想一致;方法灵敏度实验结果显示,饲料样品中含有0.1%的牛源性成分时仍能检出。同时,根据转基因农作物最常使用的外源基因设计引物,在进口饲料中检测出35S启动子和NOS中止子等转基因成分,具有快速、简便、准确等特点。     

饲料及动物性食品中山羊源性和绵羊源性成分双重荧光PCR检测方法的建立

目的建立一种能同时检测饲料及动物性食品中的山羊和绵羊源性成分的双重荧光PCR方法,应用于动物源性饲料及动物性食品的快速检验.方法分别根据山羊、绵羊线粒体种间保守序列,设计合成针对山羊和绵羊的特异性引物及TaqMan探针,通过荧光PCR反应体系和反应条件的优化筛选,建立可同时检测饲料及动物性食品中的山羊和绵羊源性成分的双重荧光PCR方法.结果本研究所建立的双重荧光PCR检测方法可同时快速检测饲料及动物性食品中的山羊和绵羊源性成分,应用本方法检测山羊肉和绵羊肉模板的检出限均为10-5,与相应的单重荧光PCR方法的检出限一致,比国标法(GB/T20190-2006)的灵敏性高100倍.结论本研究建立的双重荧光PCR检测方法特异性好、敏感性强,适用于饲料、肉制品、乳制品等动物源性食品的快速检测     

饲料中牛羊源性成分PCR方法定性检测能力验证计划的实施和结果研究

"饲料中牛羊源性成分PCR方法定性检测"是由国家认证认可监督管理委员会(CNCA)组织的A类能力验证计划.通过对本次能力验证计划的实施和对结果的分析研究,了解了国内饲料中牛羊源性成分PCR检测领域的整体水平以及各实验室在检测中存在的差异.     

动物产品的DNA提取方法

采用以异硫氰酸胍法为基础的提取方法分别提取牛肉、山羊肉、鸡肉、猪肉干、鱼粉、牛奶粉、牛奶、鱼油以及牛油中的DNA,18S rDNA片段的PCR扩增结果表明各样品已提取到DNA,且DNA中不含抑制PCR的物质。牛肉、牛奶粉、牛奶、加入牛肉DNA的鱼油和牛油的牛源性成分PCR检测结果为阳性;山羊肉和加入山羊肉DNA的鱼油的羊源性成分PCR检测结果为阳性;牛、羊源性成分PCR产物经酶切鉴定为非假阳性。这些结果显示本研究建立的动物产品DNA提取方法是可行的。     

牛源性成分LAMP检测方法的建立

根据牛cytB基因设计3对特异性引物,运用GenieⅡ等温扩增荧光检测系统,以环介导等温扩增(LAMP)荧光检测方法为基础,建立了牛源性成分LAMP检测方法,并对该方法进行了反应体系和条件的优化。试验结果表明:该方法操作简单、特异性好;灵敏度比普通PCR方法高100倍,达到5.408×10~(-2)μg/μL;反应时间短,最快的10分钟内即可完成反应。     

饲料中鸡源性成分PCR-DHPLC检测方法的建立

以鸡组织为材料,提取鸡组织的线粒体DNA,以鸡12SrRNA基因为靶基因设计引物,PCR反应扩增片段230bp;用13种畜禽和水产动物线粒体DNA验证该PCR引物的特异性,结果只有鸡线粒体DNA为阳性;PCR-DHPLC检测灵敏度在DNA水平上达到了2.04mg/L;在随机采集的22份饲料样品中,检出8份鸡源性成分样品。结果表明,本研究建立的PCR-DHPLC方法可特异、灵敏地对饲料中的鸡源性成分进行快速准确检测。