MITFa及TYR基因在红色锦鲤体色发生不同阶段的表达分析

本研究描述了红色锦鲤从出膜到体色形成的过程,总结和归纳不同发育阶段体色变化异同点,筛选出6个体色变化较显著时期,分别为1、2、3、4、12、48日龄。利用荧光定量PCR分析MITFa及TYR基因在红色锦鲤6个体色变化时期的表达情况。结果显示,MITFa基因在1日龄时表达量最高,显著高于48日龄时(P0.05),极显著高于其他4个时期(P0.01)。48日龄时表达量次之,亦极显著高于2、3、4、12日龄4个时期(P0.01)。2、3、4、12日龄4个时期MITFa基因表达量较低且不存在显著差异(P0.05)。TYR基因在1日龄时表达量最高(P0.01),4日龄时表达量显著高于12、48日龄(P0.05),与2、3日龄不存在显著差异(P0.05)。TYR基因表达量在2、3、12、48日龄4个时期差异不显著(P0.05)。MITFa和TYR基因在红色锦鲤体色形成过程中,表达水平整体呈现降低的趋势,其中MITFa基因表达量表现为先降后升,TYR基因则先降后升再降。以上结果显示MITFa、TYR基因与锦鲤体色形成具有一定相关性,但MITFa和TYR基因在体色发生中的相互作用还有待进一步研究证实。     

锦鲤墨蝶呤还原酶基因的克隆、表达和定位分析

为探究SPR在锦鲤体色形成中的作用,实验利用RACE技术获得spr cDNA全长序列,并分析其时空表达模式,同时利用Western blot和免疫组织化学方法检测SPR蛋白在皮肤、鳍条和鳞片中的分布和表达情况。结果显示,spr cDNA全长879 bp,包含132 bp和134 bp的5′和3′非编码区,开放阅读框510 bp,编码170个氨基酸残基。氨基酸序列比对和系统进化树分析显示,锦鲤SPR具有保守的adh_short_C2结构域,与金鱼相似性高达97.7%。spr在各组织中均有表达,其中皮肤的表达量最高。spr在锦鲤个体发育的4个阶段表现为先降后升。纯红、纯白及红白3种体色锦鲤皮肤、鳞片和鳍条中spr mRNA和蛋白表达水平基本一致,在纯红锦鲤皮肤中表达量最高,红白锦鲤白色皮肤、鳞片和鳍条的表达量最低。SPR组织定位分析显示,红色锦鲤和白色锦鲤皮肤中均检测到阳性信号,其中红色皮肤阳性信号强度高于白色皮肤。研究表明,spr可能与锦鲤红/黄色素细胞的分化和形成具有一定相关性,参与了锦鲤体色的形成。     

大口黑鲈MsDmrt3的基因结构、系统进化及时空表达

基于大口黑鲈(Micropterus salmoides)全长转录组数据, 克隆测序获得大口黑鲈 MsDmrt3cDNA 序列, 其开放阅读框为 1245 bp, 共编码 474 个氨基酸, 含有高保守的 DM 结构域和 DMA 结构域, 且 DM 结构域有 2 个保守的锌指样结合位点。蛋白三维预测结构与人(Homo sapiens)和青鳉(Oryzias latipes)的 DMRT3 相似。结合大口黑鲈基因组数据分析显示, MsDmrt3 位于基因组 7 号染色体上, 基因序列 3353 bp, 由 2 个外显子与 1 个内含子组成。进化树聚类分析显示, MsDMRT3 属于 DMRT3 家族, 且可能与低等节肢动物 Dmrt93B 起源于共同的原始 DMRT。对大口黑鲈 14 种组织以及 8 个发育时期的 MsDmrt3 基因的表达情况进行定量分析, 结果显示 MsDmrt3 基因在成熟个体的脊髓中高表达, 精巢和眼次之, 但在卵巢和肝脏几乎不表达; MsDmrt3 在各发育时期均有表达, 在 6 dpf 前呈逐渐上调趋势, 之后逐渐下调至最低水平。本研究表明, MsDmrt3 基因序列与结构具有高保守性, 且具有显著的性别表达二态性, 推测其与性别决定和分化有关。同时, 根据 MsDmrt3 基因在脊椎和胚胎发育早期的高表达, 推测其可能在神经系统和胚胎早期生长发育中发挥作用。本研究旨在为下一步大口黑鲈性别决定与性别分化分子机制的深入研究奠定基础。     

锦鲤酪氨酸酶基因序列分析及在不同锦鲤品系的组织表达

为了解色素控制基因与体色分布的关系,实验用分子克隆技术得到了锦鲤酪氨酸酶(tyrosinase, Tyr) cDNA 基因序列, 并利用半定量PCR的方法分析了酪氨酸酶基因在锦鲤不同品系和组织中的表达差异。实验得到了长约1 779 bp锦鲤酪氨酸酶cDNA基因, 其包括长1 608 bp开放阅读框, 编码535个氨基酸。cDNA、蛋白水平序列分析和系统发育分析都表明酪氨酸酶在鱼类间的保守性要高于鱼类与其他脊椎动物间的保守性。半定量分析研究显示,酪氨酸酶基因在皮肤、肝、心、脑和眼中都有表达, 其中眼部和黑色皮肤表达最高, 其次是脑, 红色和黄色皮肤, 肝和心的表达最低。不同品系同组织间眼、肝、心、脑的酪氨酸酶基因表达差异不显著, 但是在皮肤中有差异表达, 黑色皮肤表达最高, 其次是红色和黄色皮肤, 在白色皮肤中也有少量表达。酪氨酸酶基因在非黑色组织中有较高表达可能与存在多种形式酪氨酸酶有关, 也有可能非黑色素细胞能转化为黑色素细胞。     

四川地区一株锦鲤疱疹病毒的分离鉴定及系统进化分析

2015年5月,四川某鲤养殖场暴发一种传染性疾病,导致鲤大面积死亡,死亡率高达80%。为研究此次疾病病因和流行规律,将病料进行解剖、细菌学检查、病理组织观察、PCR鉴定、病毒分离和系统进化分析。结果显示,发病鱼眼球凹陷,胸鳍及腹鳍出现出血斑,病鱼鳃严重坏死,肾脏肿大。细菌检查为阴性。组织病理学观察,病变最明显的是鳃和肾脏。病鱼鳃丝血管扩张充血,鳃小片呼吸上皮细胞肿胀、脱落。鳃丝基部的上皮细胞大量增生,层次增多。肾小管上皮细胞组织结构紊乱,细胞肿胀,管腔变狭小,有崩裂和坏死现象。提取病鱼的肾脏和鳃组织DNA为模板,针对世界动物卫生组织(OIE)推荐的检测锦鲤疱疹病毒(KHV)的Sph基因进行PCR检测,出现特异性扩增产物。将病鱼的肾脏和肝脏组织研磨过滤灭菌后,腹腔注射20尾健康鲤,实验组表现为急性死亡(累积死亡率为90%),出现与自然发病鱼相同的症状。将组织匀浆接种到普通鲤脑细胞系(CCB),盲传3代后可稳定地观察到典型的细胞病变。细胞培养物染色超薄切片电镜观察结果显示,病毒为有囊膜的球状,病毒粒子直径为180~200 nm。对分离株的TK基因全长序列进行系统发育分析,证实该毒株属于KHV亚洲1型毒株。本研究首次报道我国西南地区养殖鲤中KHV感染引起大面积死亡,为KHV起源进化、分类以及疾病诊断和防控提供重要依据。     

锦鲤疱疹病毒主要囊膜蛋白基因的PCR扩增与序列分析

为了进一步研究锦鲤疱疹病毒主要囊膜蛋白（KHV-MEP）的功能及锦鲤疱疹病毒（KHV）的感染机制,根据KHV-MEP基因序列设计并合成1对引物,从自然感染KHV发病的锦鲤（Cyprinus carpio Koi）肝组织总DNA中扩增获得特异性基因片段。将所得基因片段克隆到pMD18-T Simple Vector载体中,获得重组质粒T-KMEP;酶切鉴定后进行序列测定,并采用氨基酸亲水性分析软件TMpred对其编码氨基酸序列进行分析;在对该片段所编码氨基酸可能抗原位点分析的基础上,进行PCR改造构建原核表达载体,获得重组表达载体pBV-KMEP1和pBV-KMEP2。所获得的基因片段大小为771bp,该基因片段与GenBank中已登录的KHV-MEP基因（AB178537）的同源性为100%,是一个完整的开放阅读框,所编码的蛋白由256个氨基酸组成,分子量为28.2kD,等电点（PI）为8.65。该序列含有4个跨膜区,可构成主要抗原决定簇。结果显示所获得的目的基因片段就是锦鲤主要囊膜蛋白全基因。     

锦鲤疱疹病春主要囊膜蛋白基因的PCR扩增与序列分析

为了进一步研究锦鲤疱疹病毒主要囊膜蛋白(KHV-MEP)的功能及锦鲤疱疹病毒(KHV)的感染机制,根据KHV-MEP基因序列设计并合成1对引物,从自然感染KHV发病的锦鲤(Cyprinus carpio Koi)肝组织总DNA中扩增获得特异性基因片段.将所得基因片段克隆到pMD18-T Simple Vector载体中,获得重组质粒T-KMEP;酶切鉴定后进行序列测定,并采用氨基酸亲水性分析软件Tmpred对其编码氨基酸序列进行分析;在对该片段所编码氨基酸可能抗原位点分析的基础上,进行PCR改造构建原核表达载体,获得重组表达载体pBV-KMEP1和pBV-KMEP2.所获得的基因片段大小为771 bp,该基因片段与GenBank中已登录的KHV-MEP基因(AB178537)的同源性为100%,是一个完整的开放阅读框,所编码的蛋白由256个氨基酸组成,分子量为28.2kD,等电点(PI)为8.65.该序列含有4个跨膜区,可构成主要抗原决定簇.结果显示所获得的目的基因片段就是锦鲤主要囊膜蛋白全基因.     

牙鲆let-7基因的克隆与表达及其靶基因预测

let-7是时序发育过程中的重要调控因子,在促进幼体向成体转变过程中起着极其重要的作用.为探讨let-7对牙鲆(Paralichthys olivaceus)从幼体到成体转变的变态发育过程的影响,本实验对let-7进行了克隆与表达研究,并预测了其可能的靶基因.利用普通PCR技术从牙鲆中成功鉴定出let-7及其前体序列,...     

黄河鲤酪氨酸酶基因的克隆、表达模式及定位分析

为探究Tyrosinase(Tyr)基因在黄河鲤体色形成中的作用,利用生物显微镜对黄河鲤黑色鳞片、银色鳞片、鳍条色素细胞的组成进行观察,并利用RACE克隆黄河鲤Tyr基因全长cDNA序列,荧光定量PCR分析其在不同组织中的表达情况,Western blot印迹和免疫组织化学方法检测其蛋白的表达定位。结果显示,黄河鲤具有黑色素细胞、黄色素细胞和虹彩细胞3种色素细胞,3种色素细胞的数量、种类和分布在不同组织中存在较大差异。黄河鲤Tyr基因cDNA全长1717 bp(GenBank ID:No.KY305667),其中ORF长1605 bp,编码535个氨基酸,5′-UTR区41 bp,3′-UTR区71 bp。蛋白同源分析发现,黄河鲤Tyr与鲤科鱼类相似性最高,与哺乳类及鸟类等脊椎动物相似性最低。系统进化分析显示,黄河鲤Tyr与鲤、瓯江彩鲤、锦鲤和斑马鱼等鲤科鱼类的亲缘关系最近。实时定量PCR分析表明,Tyr基因在黄河鲤不同组织中均有表达,肌肉中的表达量最高,其次是黑色皮肤,另外在黄色皮肤、臀鳍和尾鳍等黑色素细胞存在的组织中也有较高表达。Western blot印迹结果显示,Tyr基因在黑色皮肤中表达最高,其次是臀鳍和尾鳍,银色皮肤中没有表达。免疫组织化学结果显示,Tyr基因在黑色皮肤的黑色素细胞和黏液细胞中有表达。研究表明,Tyr基因表达水平与黑色素细胞数量和分布具有一定相关性,参与黄河鲤体色的形成。     

锦鲤疱疹病毒3型ORF126基因克隆及生物信息学分析

为研究锦鲤疱疹病毒3型(KHV-3)ORF126基因编码蛋白的功能,我们对该蛋白的结构特征进行研究分析。本实验采用PCR扩增技术获得KHV ORF126基因的完整序列,构建pMD19-T-ORF 126重组质粒,应用生物信息学方法分析ORF126基因编码蛋白的理化特征。结果显示:KHV ORF126基因翻译合成273个氨基酸;ExPasy预测该蛋白的理论分子量为29.9kDa,等电点为5.11;信号肽的切割部位最可能位于第19~20位氨基酸之间;跨膜区位于第145~168位氨基酸;抗原表位预测显示抗原性良好;编码蛋白不含N-糖基化位点,含有4个O-糖基化位点和17个磷酸化位点。     

一种免疫诱导型鲤启动子的克隆与功能分析

为发掘适用于基因工程抗病育种的鱼类启动子,通过实时荧光定量PCR实验对鲤Rab GTP酶(Ras-associated binding-GTPases 1a3,Rab1a3)基因的表达模式进行了分析,证实该基因在鳃、头肾等与机体免疫防御功能密切相关的组织内转录水平较高,且免疫激活后转录显著增强,符合基因工程抗病育种所需的外源免疫基因转录模式。从鲤细菌人工染色体文库中,使用Rab1a3基因特异引物筛选获得包含该基因区域的文库克隆,测序获得该基因完整序列,以及上下游调控序列。通过生物信息学手段,预测到长度为1014 bp的鲤Rab1a3基因启动子序列,该启动子不具有典型的TATA盒或CpG岛特征,存在多个免疫相关转录因子结合位点。在草鱼肾组织细胞系内验证该启动子活性,结果显示,绿色荧光蛋白基因和萤火虫荧光素酶基因都能够在该启动子驱动下表达,证实该片段具有启动子活性,且启动子活性在受到免疫诱导后增强,双荧光素酶报告基因检测结果显示,该启动子活性在免疫刺激后增强至免疫刺激前的8.67倍。研究表明,鲤Rab1a3基因启动子有望被开发成为免疫诱导型的基因工程元件,驱动外源免疫基因在鱼体内适时表达,抵御外界病原感染,同时避免非必要条件下的过度表达形成生长负担。     

鲤Rhbdd3蛋白的抗病毒功能

Rhbdd3(Rhomboid domain-containing protein 3)蛋白在哺乳动物天然免疫中发挥了重要作用,但水生动物中rhbdd3基因的确定序列及Rhbdd3蛋白的功能均尚未见报道。为研究鲤(Cyprinus carpio)的Rhbdd3蛋白在鱼类细胞中的功能,探讨其过表达对鱼类病毒感染的影响,本研究通过PCR扩增得到了鲤rhbdd3基因的编码序列,并将其克隆至pCI-neo载体上,构建了真核表达质粒pCI-rhbdd3。pCI-rhbdd3转染鲤上皮瘤细胞EPC(epithelioma papulosum cyprinid)和鲑囊胚细胞CHSE-214(chinook salmon embryo)后利用制备的特异性抗体进行Western blot,检测Rhbdd3蛋白的表达情况,并利用CCK-8试剂检测其过表达对细胞增殖的影响。转染后分别进行鲤春病毒血症病毒(SVCV)和传染性胰腺坏死病毒(IPNV)的感染实验,并利用间接免疫荧光、Western blot和RT-qPCR方法检测Rhbdd3过表达对SVCV和IPNV增殖的影响。结果显示,pCI-rhbdd3转染后Rhbdd3蛋白在EPC和CHSE-214细胞中得到了过表达,且Rhbdd3蛋白的过表达能显著抑制SVCV和IPNV的复制,但不影响两种细胞的正常活性。本研究为鱼类广谱抗病毒药物的开发提供了新的实验依据,也为鱼类抗病毒新品种的培育奠定了重要基础。     

鲤lipea基因表达的时空特征及与脂肪沉积相关性分析

本文旨在克隆鲤(Cyprinus carpio)激素敏感性脂肪酶a (hormone-sensitive lipase a, lipea)基因,探究其时空表达特征及其与脂肪沉积的关系,以期为鲤脂肪沉积分子调控机制研究奠定理论基础。本实验采用RACE技术克隆获得鲤lipea基因,其cDNA全长为3379 bp,包括230 bp的5′非翻译区(5′-UTR)、1067 bp的3′非翻译区(3′-UTR)和编码693个氨基酸的开放阅读框。多序列比对显示,鲤lipea与斑马鱼(Danio rerio)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)和虹鳟(Oncorhynchusmykiss)的氨基酸序列相似性分别为88.17%、64.94%和63.35%,不同物种间序列差异主要集中在C-端的多肽序列上。蛋白质结构分析显示该蛋白含有3个功能域分别具有脂肪酶活性、乙酰基水解酶活性和水解酶活性。应用实时荧光定量PCR技术分析了lipea基因在鲤各组织、不同发育时期以及脂肪含量极端差异个体的肌肉和脂肪组织中mRNA表达量的变化。结果显示, lipea在各组织中均有表达,腹腔脂肪中相对表达量最高,其次是腹部肌肉,血液中最少。随着胚胎的发育, lipea的表达水平呈现下降趋势, 8细胞期表达量最高,其次是囊胚晚期,开口期最少。lipea表达量与背部肌肉脂肪含量呈正相关,但差异不显著(P0.05),与腹腔脂肪量呈负相关,且差异极显著性(P0.01),推测lipea基因对鲤腹腔脂肪沉积可能具有抑制作用。本实验结果可为进一步解析鲤lipea基因的功能和基因调控脂肪沉积分子机制研究提供参考。     

鲤硒缺乏的病理学研究

将健康幼鲤360尾设置3个相同平行处理,每个处理用鱼120尾,随机分为四组,分别投以0 mg/kg、0.15 mg/kg、0.30 mg/kg和0.45mg/kg硒水平的饲料,各试验组的发病率和死亡率与日粮中硒含量高低呈负相关,其发病率分别为46.7%、33.3%、13.3%和0%,死亡率分别为26.7%、16.7%、6.7%和0%。病鱼出现特征性的“瘦背病”和脊柱弯曲等症状。组织学上最突出的变化表现为营养性肌病、营养性肝病、胰腺的变性、坏死等多器官组织的退行性变化。超微结构上,骨骼肌纤维、肝细胞和肾小管上皮细胞线粒体肿胀,嵴断裂,甚至发生溶解,整个线粒体呈囊泡状。硒缺乏幼鲤血液中谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）活性升高,谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化物歧化酶（SOD）活性降低,丙二醛（MDA）含量升高。     

鲤和草鱼IL17受体基因家族的全基因组识别、起源进化及表达分析

为了研究鲤科鱼类最具代表性的二个物种—鲤和草鱼IL17受体基因家族的起源进化,实验采用比较基因组学和生物信息学的方法,分别在鲤和草鱼基因组数据库进行序列比对和注释,然后对得到的基因进行结构域和系统发育学分析,最后在12个不同组织中进行基因表达分析研究。结果显示,在鲤和草鱼中分别注释得到9个和5个IL17受体基因家族成员。系统发育分析显示,该基因家族不存在鱼类特有的基因,在硬骨鱼类中具有一定的保守性。比较基因组学结果显示,与四足动物相比,大多数硬骨鱼类中IL17受体基因没有明显增多。鲤与草鱼等其他硬骨鱼类相比,除IL17RB以外,其余IL17受体基因家族成员均加倍。不同组织的表达分析结果显示全基因组复制后不同基因拷贝的功能发生了分化。研究表明,虽然硬骨鱼经历第三轮全基因组复制,但是由于复制发生时间久远,大多数基因已经发生改变或退化,进而在基因组中丢失。而鲤第四轮基因组复制时间发生在820万年前,复制发生时间较近,故复制后的基因基本得以保留。但是对于一些具有特殊功能的高度保守基因(例如IL17RB),也会发生在极短时间内出现丢失现象。鲤和草鱼健康组织的表达谱分析结果同样表明,鲤IL17受体基因的不同拷贝之间已经发生了快速进化及亚功能化,并且这种现象在鲤四倍体基因组中普遍存在。     

Top-crossing with evaluation of slaughtering value in common carp (Cyprinus carpio L.) offspring

A three-year test of growth performance andoffspring survival from top-crossing of commoncarp hybrids in low altitude (350 m above thesea level, middle European climate) and in highaltitude (750 m above the sea level, middleEuropean climate) was terminated by assessmentof slaughtering value of edible parts in therespective strains. A recently establishedHungarian synthetic mirror carp strain (HSM)was chosen for testing as maternal strain. TheHSM, as well as wild Amur carp (AC), Ropshacarp (ROP) and Tata carp (TAT) were used aspaternal strains.The evidential strain*altitude interactioneffect was demonstrated as significant forweight of fish (0.0005), fillet without skin(0.0001), index of highbackedness (0.005),index of head length (0.0404),Fulton's coefficient (0.0497),index of widebackedness (0.0315) andgonadosomatic index (0.0082). The interactioneffect was demonstrated as insignificantbetween altitude*sex and betweenstrain*sex.The comparative test of analysis of variance(ANOVA) revealed significantly (P < 0.05)higher weight of fish after killing on lowaltitude (1611.6 g) than on high altitude(1090.3 g), but processed body yield andpercentage of fillet without skin was notsignificantly different (64.0 and 34.2 for lowaltitude, 64.2 and 33.4 for high altitude). Thepercentage of processed body weight andpercentage of fillet without skin in analysisboth altitudes were significantly better infemales (65.5 and 34.6%) than in males (62.5and 33.00%), respectively. The highestsignificant differences in weight of fish afterkilling were found between HSM (890.8 g) andHSM × AC (1283.3 g) in high altitude. In lowaltitude, it was between HSM (1527.2 g) andHSM × AC (1706.9 g) and HSM × ROP (1693.0 g).     

鲤WISP基因家族的克隆、表达及系统进化树的构建

Wnt1诱导分泌蛋白(WISP)基因家族与CYR61、CTGF、NOV基因共同构成了CCN家族。研究通过鲤基因组序列与斑马鱼WISP基因编码区全序列的比对获得WISP1a、WISP1b、WISP2、和WISP3等4条序列。经过克隆、测序、比对拼接得到其开放阅读框,分别是1 089、1 077、1 038和1 026 bp,它们都是由5个外显子和4个内含子构成,分别编码362、358、345和341个氨基酸。分子系统学分析表明,鲤4个WISP基因具有高度同源性,其中WISP1a、WISP1b和WISP2均含有4个模块,WISP3缺少第2个模块。通过RT-PCR检测WISP基因在鲤组织中的表达,结果表明,WISP1a鲤在13个组织中均有表达,皮肤中表达最高,脾、肠、卵巢次之,其他组织中表达较低。WISP1b在精巢、脑、皮肤、卵巢中表达较高。WISP2在血液、鳃中表达较高。WISP3在血液、脑、肝中表达较高。实时荧光定量PCR法分析WISP基因在鲤胚胎发育时期的表达,结果表明,除WISP3外,WISP1a、WISP1b和WISP2在前期表达较高,36 h表达最低,随后逐渐升高至第6天开始下降。     

Influence of nutrition on the lipid quality of pond fish: common carp (Cyprinus carpio) and tench (Tinca tinca)

Like marine fish freshwater fish are an important source of essential fatty acids for human nutrition. However, the fatty acid composition of pond fish can vary considerably and strongly depends on that of the ingested food. Investigations on the fatty acid composition of common carp (Cyprinus carpio) and tench (Tinca tinca) have shown that different methods of rearing and feeding cause substantial variations in the proportions of the n-6 and n-3 polyunsaturated fatty acids of these fish species. Carp reared on the basis of natural food in ponds exhibit high contents of n-6 as well as n-3 fatty acids in their muscle triacylglycerols. On the other hand carp fed supplementary wheat in ponds resulted in somewhat lower levels of these essential fatty acids. High amounts of n-3 fatty acids can be found in carp fed high-energy diets containing high levels of fish oil. Analogous results were obtained in experiments with tench reared under different nutritional conditions. While rearing on the basis of only natural food in ponds as well as feeding supplementary wheat yielded in similar levels of n-3 and n-6 polyunsaturated fatty acids, higher contents of n-3 fatty acids were recorded in tench fed pellets. High levels of n-3 polyunsaturated fatty acids in foodstuffs have positive effects on human health. Experiments with different cultured fish species proved that the fatty acid composition of the edible parts can be influenced by the diet. Therefore, a finishing diet with a suitable fatty acid profile can be used to improve the nutritional quality of fish products of farmed origin.