基于PCR技术的玉米CMS材料胞质类型的快速鉴定

1971年,Beckett依据育性恢复专效性原理将30种不同来源的细胞质雄性不育材料的胞质划分为T、C、S三个基本类型^[1]。此后,郑用琏和刘纪麟^[2]、温振民^[3]分别对育性恢复专效性方法进行了改进和发展。1978年,Levings 和 Pring首次报道了玉米4种细胞质的线粒体DNA存在限制性核酸内切酶的多型性,从分子水平证明了雄性不育基因存在于线粒体DNA（mtDNA）上,并证实mtDNA的差异既存在于各组CMS材料之间,也存在于组内^[4]。根据mtDNA的酶切图谱可将C组和S组不育胞质进一步区分为几个亚组^[4,5]。近年来,利用RFLP、RAPD等分子标记技术研究玉米胞质mtDNA多型性,证明RFLP和RAPD多态性可有效地用于不同胞质分类^[6~8];利用线粒体DNA上嵌合区域设计特异性引物进行PCR,也可准确地将CMS的不同胞质区分开来^[9]。本研究采用RFLP和特异引物的PCR方法,对3个未知细胞质类型的不育系进行分子水平鉴定,并证实了基于PCR技术的玉米CMS系胞质类型的快速鉴定方法是有效的。     

玉米S组CMS胞质与正常胞质育性相关基因基于SSP-PCR的遗传多型性研究

利用SSP-PCR技术对S组CMS与正常胞质线粒体胞质育性相关基因cox　Ⅰ, cox　Ⅱ的5′上 游、 3′下游以及基因编码区与正常N胞质进行了遗传多型性的比较研究。 结果表明在所选 用的(特异引物+随机引物)的引物组合中, 未能在cox　Ⅱ基因的5′上游 和3′下游区发 现变异, 但其基因内含子中存在基于SSP-PCR的遗传多型性。 在S组     

四种细胞质来源的烟草不育系线粒体SSR位点差异

采用线粒体SSR(mtSSR)方法对普通烟草4种不育类型的不育系、不育胞质来源的烟草野生种和保持系进行线粒体位点差异分析,探讨mtSSR位点差异与胞质不育的关系。在烟草线粒体基因组上检索到24个能重复稳定扩增出片段的mtSSR,对烟草属植物的这些mtSSR分析结果显示,普通烟草种内mtSSR较为保守,多态性比率仅10.5%;4种不育类型的各自不育系与保持系、不育胞质上存在多个差异位点,在Nta(sua.)S类型中差异位点在线粒体编码基因orf138a、orf138c以及orf102~orf210的基因间区;在Nat(gla.)S类型中,差异位点在线粒体orf138a、orf138c两个编码基因以及nad2~sdh3、rps12~orf125b、orf116~orf101b、orf102~orf210的4个基因间区;在Nta(rep.)S类型中,差异位点在线粒体编码基因orf190以及orf104c~orf202的基因间区;在Nta(rus.)S类型中,差异位点在线粒体编码基因orf137以及rps12~orf125b的基因间区。这些位点差异可能与各自的雄性不育有关。另外,mtSSR引物TMS20在Nat(sua.)S、Nat(gla.)S、Nat(rep.)S和Nat(rus.)S类型的雄性不育系中分别扩增出了184、172、212和225 bp的片段,表明可用该引物区分4种烟草CMS类型。     

玉米雄性不育性研究 Ⅷ.玉米YⅡ-1型不育胞质归群初报

从若干方面初步研究了玉米YII-1型不育细胞质与3个主要类群的不育胞质（T、C和S）间的差异。育性恢复测验表明，YII-I胞质有其独特的恢复基因，在各类自交系核背景下，其育性表现与众不同。恢复基因至少有二对，其中一对与C群不育系有别。小斑病菌测试效应，说明YII-1型不属于T群，而线粒体DNA(mt DNA)的电泳图谱说明YII-I胞     

瓣化型胡萝卜胞质雄性不育相关片段的分离及序列分析

以128对引物组合对瓣化型胡萝卜胞质雄性不育系和保持系进行cDNA-AFLP分析，筛选与不育性相关的特异片段，对其中两个表达丰度较高的cDNA差异片段进行克隆测序。序列分析表明BY1949与拟南芥质子依赖性的类肽转运蛋白在核苷酸水平有87%的同源性，蛋白质水平有58%的同源性。BY2562与瓣化型胞质雄性不育（CMS）胡萝卜线粒体ATP8、ATP9、NAD6和cob-sp基因在核苷酸水平有99%的同源性，期望值为0.0；在蛋白质水平与CMS向日葵线粒体ORFB基因，COXIII 5'端未知蛋白YMF19以及CMS胡萝卜ATP-8，orfB-F1有97%的同源性；另外与胡萝卜orfB-CMS、orfB-F2、烟草orfB、油菜orf224、拟南芥线粒体orfB、萝卜orf158以及芥菜线粒体膜蛋白、甘蓝型油菜orf474也有90%以上的同源性。     

甘蓝型油菜NCa CMS育性相关候选线粒体基因及其恢复基因的转录调控

用10个线粒体基因为探针，对NCa不育系、保持系和可育F1幼蕾的线粒体RNA进行了Northern检测。结果表明，atp6、atp1、cox1、cox2、cob、rrn5S和rnn26S等7个线粒体基因探针在不育系、保持系、可育F1中的转录没有差异，只有orf222、orf139和atp9等3个探针检测到转录本的差异。orf222和orf139分别在不育系和可育F1中产生相同大小和丰度的转录本，但是在保持系中没有检测到转录本；orf222检测到的3条转录本分别为1．1、0．9和0．6kb，orf139检测到0．8和0．6kb2条带。atp9探针在不育系和保持系中都检测到1条0．6kb转录本，而在可育F1中检测到0．6和1．2kb的转录本。NCaCMS不育的形成可能与orf222、orf39和atp9基因的表达有关。讨论了恢复基因在F1育性恢复过程中对育性相关候选基因的可能调控方式。     

结球甘蓝细胞质雄性不育(CMS)类型的分子鉴定

本研究以高代回交转育获得的6个不育率和不育度均达100%且遗传稳定的结球甘蓝胞质雄性不育系为材料,通过对orf138与orf222基因的特异扩增发现,所鉴定的24个株系64个单株结球甘蓝CMS植株中59个单株既含有orf138基因,也有orf222基因.两种基因共存的结果暗示,该类CMS可能是ogura和nap两种类型的杂合体.进一步的序列分析结果表明,6个结球甘蓝CMS中所扩增获得的orf138基因与来自萝卜CMS的orf138基因序列完全相同;而除Bo134-2 CMS的orf222基因与甘蓝型油菜CMS orf222基因相比对有2个核苷酸差异外,其余5个CMS的orf222基因与甘蓝型油菜nap CMS orf222基因的相似性均为100%.其中,Bo134-2 CMS的orf222基因第191 bp的变异导致第64位氨基酸由精氨酸(R)突变成了赖氨酸(K).     

大麦中与胞质雄性不育性的育性恢复位点（Rfml）紧密连锁的基于AFLP的STS标记

胞质雄性不育（CMS）系统是杂交种生产中的需要性状。CMS系统已被用于大规模地生产玉米、油菜、高梁、水稻杂交种。CMS在大麦上尚未进行商业化应用，但是其F1杂交种的杂种优势效应已得到认可。Favret和Ryan最早报道大麦雄性不育胞质，他们在一个突变群体中找到这种雄性不育胞质。Schooler报道，大麦的雄性不育胞质来源于芒麦草（Hordeum jubatum），但是，尚未找到满意的恢复这种胞质育性的恢复基因。     

甘蓝型油菜NCa CMS育性相关候选线粒体基因及其受恢复基因的转录调控

用10个线粒体基因为探针, 对NCa不育系、保持系和可育F₁幼蕾的线粒体RNA进行了Northern检测。结果表明，atp6、atp1、cox1、cox2、cob、rrn5S和rrn26S等7个线粒体基因探针在不育系、保持系、可育F₁中的转录没有差异；只有orf222、orf139和atp9等3个探针检测到转录本的差异。orf222和orf139分别在不育系和可育F1中产生相同大小和丰度的转录本，但是在保持系中没有检测到转录本；orf222检测到的3条转录本分别为1.1、0.9和0.6 kb，orf139检测到0.8和0.6 kb 2条带。atp9探针在不育系和保持系中都检测到1条0.6 kb转录本，而在可育F₁中检测到0.6和1.2 kb的转录本。NCa CMS不育的形成可能与orf222、orf139和atp9基因的表达有关；讨论了恢复基因在F₁育性恢复过程中对育性相关候选基因的可能调控方式。     

一种大白菜新型甘蓝型油菜CMS快速鉴定方法及应用

针对目前甘蓝型油菜Pol CMS、新型萝卜胞质Ogu CMS、新型甘蓝型油菜CMS鉴定过程中,存在必须从orf138、orf222、orf224 3种引物中选用2对引物进行分子标记互相验证鉴定的缺点。以开发快速鉴别新型甘蓝型油菜CMS的分子标记为目的,选取含有Pol CMS的CMS-AQ29和含有新型甘蓝型油菜CMS的CMS后36高的2个材料基因组DNA为模板,通过引物orf222进行PCR扩增,经测序对比2种类型细胞质雄性不育系的核苷酸序列差异,确定主要差异区域为180～210 bp。通过orf222上游引物末端T/G碱基的错配,设计开发了快速鉴定新型甘蓝型油菜CMS的专用引物O-2,该引物可扩增出470 bp的核苷酸序列,而不含有新型甘蓝型油菜CMS的材料则不能扩增出核苷酸序列,具有能一次性快速鉴定出含有新型甘蓝型油菜CMS不育基因材料的特点。利用该引物对转育了新型甘蓝型油菜CMS的材料CMS-D571、CMS-D574及对应的保持系D571、D574分别进行了鉴定,证实雄性不育系CMS-D571、CMS-D574为转育了新型甘蓝型油菜CMS的雄性不育系,结果表明该方法稳定可靠。     

甘蓝型双低油菜胞质雄性不育系384A不育性的表现与遗传

对甘蓝型双低油菜细胞质雄性不育系３８４Ａ的不育性表现、遗传方式等方面的研究结果表明,该不育系属败药型不育,其败育彻底,育性稳定,花瓣开张正常,不育性的遗传受不育细胞质（Ｓ）和一对隐性核不育主效基因（ｒｒ）共同控制,属孢子体不育,基因型为Ｓ（ｒｒ）,同时也受若干位点上微效基因的影响。     

甘蓝型油菜胞质雄性不育系22A的遗传研究

甘蓝型双低油菜CMS22A是河南省农科院棉油所利用384A中的雄性不育源、采用单株成对连续回交的方法育成的新型双低油菜细胞质雄性不育系。其突出表现为雄性不育彻底且遗传稳定,配合力高,抗病抗倒,品质优良。对CMS22A育性遗传规律研究表明,该不育系属典型的败药型雄性不育系,其雄性不育的遗传受不育细胞质(S)和一对隐性核不育主效基因(rr)的共同控制,属孢子体不育,基因型为S(rr)。     

Modified complementation test of male sterility mutants in pepper (Capsicum annuum L.): preliminary study to convert male sterility system from GMS to CMS

The male sterility system in hybrid seed production can eliminate the cost of emasculation and ensure seed hybridity through avoidance of self pollination. GMS and CMS are two types of male sterility system that currently employed in pepper breeding. Conversion from GMS to CMS will increase the male sterility proportion of female parent from 50 to 100%. In this study, segregation analysis of four male sterile mutants consisting of one CMS mutant (CA1) and three GMS mutants (GA1, GA3 and GA4) showed that each had single recessive gene inheritance. A modified complementation test was performed by replacing male sterile mutants with their maintainer line as male parent. The nuclear restorer gene for CMS was independent of all nuclear restorer genes for GMS and all nuclear restorer genes for GMS were independent each other. Further observation on CMS and GMS male sterility loci revealed that GA1 and GA3 had mutated in both nuclear restorer genes for CMS and GMS, while CA1 and GA4 each carried mutation in single male sterility system of nuclear restorer gene for CMS and GMS, respectively. Conversion from GMS to CMS in the case of lines carried mutations in both sterility systems required only S-type cytoplasm donor, while lines carried mutation in single nuclear restorer gene for GMS required not only S-type cytoplasm but also rf allele donors. The important finding is the broader function of maintainer line in certain male sterility system that can be used as a maintainer or restorer line for other male sterility systems. We also confirmed that line CC1 is the general restorer for both CMS and GMS systems.     

甘蓝型油菜细胞核 细胞质雄性不育三系的研究与利用 Ⅳ.隐性细胞核 波里马细胞质雄性不育三系的创建

甘蓝型油菜隐性细胞核雄性不育与波里马细胞质雄性不育可能具有完全不同的不育基因系统;采用有性杂交和连续回交的方法,将甘蓝型油菜隐性细胞核不育基因导入到含有波里马不育细胞质的基因型中,并得到甘蓝型油莱隐性细胞核 波里马细胞质雄性不育系RGCMS—S45A和RGCMS—117A及其相应的保持系S45B和117B;采用测交方法,从隐性细胞核雄性不育系中筛选出甘蓝型油菜隐性细胞核 波里马细胞质雄性不育保持系9个;波里马细胞质雄性不育的恢复系均是隐性细胞核 波里马细胞质雄性不育的恢复系。     

水稻细胞质雄性不育及其育性恢复基因的研究进展

细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterility,CMS）及育性恢复（restorer of fertility,Rf）是作物杂种优势利用的有效途径之一,由线粒体不育基因和核恢复基因互作产生。本文综述了水稻CMS和Rf基因的来源及其分子遗传机理,并展望了水稻CMS和Rf系统在水稻育种方面的应用。     

玉米雄性不育细胞质细胞色素氧化酶活性及ATP含量的研究

研究了玉米ＭＯ１７背景三种雄性不育细胞质（Ｔ．Ｃ．Ｓ）及正常细胞质（Ｎ）系小孢子发育过程中花药组织细胞色素氧化酶活性,ＡＴＰ含量及其变化。发现各不育胞质细胞素氧化酶活性及ＡＴＰ含量的下降。讨论了玉米雄性不育细胞质的能量亏损现象。     

Conversion of the genic male sterility (GMS) system of bell pepper (Capsicum annuum L.) to cytoplasmic male sterility (CMS)

Non‐pungent bell pepper (Capsicum annuum L.) lacks the cytoplasmic male sterility (CMS) nuclear restorer allele, Rf, and CMS cannot be employed in its F₁ hybrid seed production. To demonstrate that the genic male sterility (GMS) system in non‐pungent bell pepper can be converted to the CMS male sterility system, the conversion of GMS to CMS for non‐pungent bell pepper line GC3 was conducted by introgression of S‐type cytoplasm and the Rf allele from tropical pungent donors. After morphological traits were evaluated, two lines from BC₁F₁ containing S‐type cytoplasm and four lines from BC₂F₂ containing Rf allele, phenotypically similar to GC3, were obtained and could be employed as CMS male sterile lines and restorer lines for non‐pungent bell pepper. Four molecular markers potentially linked to traits of interest were also evaluated in BC₁F₁ and BC₁F₂ populations. This is the first time that GMS has been successfully converted to CMS in bell pepper, a significant contribution for bell pepper hybrid seed production.     

高粱A_1、A_2型核质互作雄性不育性遗传的初步研究

本试验表明,A_1型雄性不育性是由细胞质不育基因S_1与核内两对隐性不育基因ms_1ms_1 ms_2ms_2共同控制.A_2型雄性不育性是由细胞质不育基因S_2与核内一对隐性不育基因ms_2ms_2共同控制.相对的显性恢复基因MS_1MS_1 MS_2MS_2是独立遗传的,不存在累加效应,两对显性基因都与S_1存在互作关系,只要有其中一对就可实现对A_1细胞质不育系的恢复.A_2细胞质雄性不育系则只有MS_2MS_2基因才能恢复.MS_1MS_1基因在A_2细胞质遗传背景下失去了显性恢复作用,成为S_2的非互作基因.雄性不育的核质互作具有普遍性和对应性,保持系则具有多样性.     

利用分子标记鉴定白菜细胞质雄性不育类型的研究

通过对9份白菜细胞质雄性不育材料的不育胞质类型进行分子标记鉴定,以期为今后更好的利用分子标记来进行辅助育种奠定基础。通过CTAB法提取白菜的基因组DNA,根据GenBank中orf138基因保守序列设计2对特异引物,对9份白菜基因组DNA进行PCR扩增,将扩增出条带的PCR产物进行测序,在NCBI中进行同源性比对,最终确定其不育胞质类型。结果表明：2对特异引物PI/PII和PIII/PIV只在4份白菜雄性不育基因中均扩增出条带,在另外5份材料中未扩增出条带,与田间育性鉴定相符,获得4份白菜Ogura胞质雄性不育的分子标记;在GenBank中用BLAST进行同源性比对分析,发现L1-CI、L3-CI、L3-F1 3个不育材料的特异片段与已报道的青花菜Ogu CMS所具有的Ogu orf138基因（Genbank登录号：HQ149728）同源度高达100%,L1-F1的同源度达99%,出现了一个变异位点,另外5份材料的胞质不育类型有待进一步研究。通过该方法鉴定出9份材料中有4份材料是萝卜胞质雄性不育的材料,得到了4条分子标记,该结果可为白菜细胞质雄性不育的分子鉴定提供了新的标记,也为今后利用分子标记辅助育种奠定了基础。     

甘蓝细胞质雄性不育相关基因orf138的分子特性分析

为了研究甘蓝雄性不育机制,根据萝卜CMS相关基因orf138的序列信息,设计特异引物,并在甘蓝不同类型不育系和保持系中鉴定PCR产物的稳定性。随后利用Tail-PCR技术,扩增获得此基因的侧翼序列并进行了生物信息学分析。结果表明在甘蓝不育型材料中,能够稳定扩增出300 bp左右的单一条带,而在其他细胞质不育类型和可育材料中均未扩出条带,经多次验证结果稳定可靠。甘蓝中orf138的上下游侧翼序列有效碱基1789 bp,通过生物信息学分析,获得包括起始密码和终止密码的orf138的完整序列共417 bp。同源性比对结果显示：与甘蓝型油菜﹑白菜和萝卜的orf138片段具有高度保守性。分析侧翼序列表明甘蓝orf138的3’端是由ORF83、trnfM、ORF125等基因片段构成的一个复杂序列。获得了甘蓝OguCMS特异的分子鉴定标记,明确了orf138在甘蓝线粒体中的位置,以上结果为甘蓝雄性不育的进一步研究奠定良好的基础。