库尔勒香梨的苹果茎痘病毒cDNA探针检测技术研究

 以库尔勒香梨叶片和皮层为材料 ,对 2种总RNA提取方法进行了比较研究 ,从中行筛选出了适合库尔勒香梨的提取方法 ;并利用RT PCR反应体系成功合成了生物素标记的cDNA探针 ,在此基础上 ,对影响杂交灵敏度的主要因素进行了试验研究 ,结果表明 ,当探针浓度为 4 0 0ng·ml-1,甲酰胺浓度为 4 5 % ,4 2℃杂交反应 6h ,可获得最高灵敏度。进口硝酸纤维素膜的灵敏度最好 ,基本无背景。Tween2 0的封闭效果比牛血清白蛋白好。对不同组织和不同提取方法提取的总RNA进行了杂交检测 ,结果表     

苹果茎沟病毒的RT-PCR检测及其在我国苹果产区的分布

为开发苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)田间样本RT-PCR检测方法以及揭示我国AS-GV的发生情况,本研究以染病的苹果组培苗为试材,对ASGV RT-PCR检测方法进行了优化并利用优化的检测体系对我国苹果产区ASGV的发生情况进行了检测。结果表明:引物ASGVS特异性最好,优化的RT-PCR检测体系能够在4,7和11月份检测果树树皮组织的带毒情况,灵敏度达到能够检测2.5×10-2μg新鲜样本,适于苹果ASGV田间样本检测。通过对我国苹果产区ASGV的检测发现,被检测的13个省(市/区)苹果上几乎都有ASGV发生,只有甘肃省泾川样本未检测到该病毒,采集的327个样本带毒率达73.7%。     

苹果茎沟病毒CP基因质粒标准样品的研制

本研究通过扩增苹果茎沟病毒CP基因,经克隆测序后制备了ASGV核酸标准样品,分装后进行均匀性和稳定性检验,并联合外部实验室对标准样品进行定值。结果表明,制备的标准样品均匀性和稳定性均达到了国家标准样品的技术要求,可用于苹果茎沟病毒核酸检测的标准质控品。     

苹果茎沟病毒RT-PCR检测技术

用苹果的叶片作为材料,研究比较了两种提取苹果总RNA方法的效果,确定了较好的提取方法。根据苹果茎沟病毒外壳蛋白基因设计引物,通过RT-PCR扩增在苹果叶片总RNA样品中获得了524 bp的特异片断,通过对该片段的序列分析与苹果茎沟病毒外壳蛋白基因源序列比较,其同源性高达93%。通过多次重复实验验证,该方法能很好地检测苹果茎沟病毒。     

库尔勒香梨的苹果褪绿叶斑病毒cDNA探针检测技术研究

以库尔勒香梨叶片和皮层为材料,对两种植物总RNA提取方法进行了比较研究,从中筛选出了适合库尔勒香梨的提取方法;并利用RT-PCR反应体系成功合成了生物素标记的cDNA探针,在此基础上,对影响杂交灵敏度的主要因素进行了实验研究。结果表明,当探针浓度为400ng/mL,甲酰胺浓度为45%,42℃杂交反应6h,可获得最高灵敏度。Tween20的封闭效果比牛血清白蛋白好。对不同组织和不同提取方法提取的总RNA进行了杂交检测,并对库尔勒地区香梨带毒情况进行了检测。结果表明,不论幼叶、老叶、皮层及冷冻叶片均可出现杂交信号,两种提取方法提取的总RNA也都出现了杂交信号,库尔勒香梨样品有45%的带苹果褪绿叶斑病毒。     

库尔勒香梨脉黄病毒RT-PCR检测技术研究

 以库尔勒香梨叶片和皮层为材料 ,对总RNA提取方法进行了研究 ,从中筛选出了适合库尔勒香梨总RNA的提取方法。结果表明 ,要获得良好的RT PCR扩增 ,RT体系中dNTPs浓度、互补引物、AMV、模板的浓度要分别达到 0 .1mmol·L-1、0 .2 μmol·L-1、0 .0 5U·μl-1、0 .0 1μg·μl-1以上。此外 ,使用RNasin能有效抑制RT体系中RNase对病毒RNA的降解作用 ,可使RT过程顺利进行 ;PCR体系中dNTPs浓度至少要达到 0 .1mmol·L-1,0 .2～ 0 .3mmol·L-1可以获得最佳的扩增效果 ;TaqE浓度要达到 0 .0 15U·μl-1以上 ;引物浓度适宜范围 0 .3～ 0 .7μmol·L-1;Mg2 + 要达到 1.2 6mmol·L-1以上。     

苹果茎痘病毒库尔勒香梨分离物外壳蛋白基因的原核表达

[目的]苹果茎痘病毒为潜隐性病毒,该病毒寄主范围和分布广泛,能侵染多种果树.目前侵染新疆库尔勒香梨,造成了严重的经济损失,研究了解ASPV的功能基因及治病机理,并诱导其表达,制备出高效的血清,将病害的损害度降到最低.[方法]用新疆库尔勒香梨携毒枝条的韧皮部提取苹果茎痘病毒RNA,根据已经公布ASPV(EU095327)核苷酸序列,设计合成1对CP基因的引物,通过RT-PCR扩增出CP基因,将其克隆至表达载体pET-3a中.[结果]经测序表明,目的基因CP已正确地整合至表达质粒中.[结论]重组质粒转化大肠杆菌BL21,在不同时间下诱导均获得了表达,且表达蛋白产物的分子质量大小与预期值一致,并可被特异性抗体所识别.     

苹果茎沟病毒的分离纯化及血清学检测

 从苹果样品中分离到苹果茎沟病毒（ASGV）,汁液摩擦接种该病毒可侵染昆诺藜（Chenopodium quinoa）、苋色藜（C.amaranticolor）、心叶烟（Nicotiana glutinosa）、灰藜（C.niurale）、菜豆（Phaseolus vulgaris "pinto"）和西方烟（N.accidentalis"37B"）。在昆诺藜叶片汁液中,该病毒体外存活期为3d左右（25℃）,热钝化点60～65℃（10min）,稀释限点10#+(-4)。提纯病毒在-20℃下,存活期为6个月以上。提纯病毒液A260/A280=1.18。病毒粒子呈线状,大小为620～680nm×11～12nm。衣壳蛋白分子量为31.0kD。用提纯病毒免疫大耳白兔,所获抗血清用于检测提纯病毒样品和感染ASGV的昆诺藜叶片,其效价毛细管微量沉淀反应法为1:512,酶联免疫吸附法为1:10#+4以上。用该抗血清可检测出感染ASGV的苹果试管苗和田间生长植株叶片。     

分泌抗苹果茎沟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

 用苹果茎沟病毒（ASGV）免疫的BALB/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞（Sp2/0-Ag14）融合，经3次克隆化培养和ELISA筛选，建立了7株分泌抗ASGV的单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞株。上述细胞株的腹水McAb滴度在1:256000 ～ 1:4096000之间，而且均不与另一种常见的潜隐病毒苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）起交叉反应。腹水McAb经纯化和辣根过氧化物酶（HRP）标记后，用间接ELISA方法检测感染ASGV的昆诺藜汁液，具有特异性强、灵敏度高等特点。     

库尔勒香梨套袋技术研究

采用白色、黄色和紫色的塑膜果袋和白色、蓝色和淡褐色的无纺布袋进行库尔勒香梨果实套袋栽培试验,结果显示白色塑膜袋在花后30d套袋效果较好。     

库尔勒香梨的传粉生物学研究

2008年阿克苏地区库尔勒香梨4月5日进入初花期,花期持续约15 d.单花开放时间5～6 d,花粉寿命25 d,柱头可授性在开花第1～2 d内最强.花粉胚珠比(p/o值)为12 186±2 603,属异交繁育系统.花部形态具有典型的动物传粉特征,结实必须依赖传粉昆虫或人工授粉,意蜂、鼠尾管食蚜蝇等膜翅目和双翅目昆虫是有效传粉者,昆虫有效传粉距离约20 m.砀山、早酥和红香酥等梨品种与库尔勒香梨花期相遇并均能有效提高其坐果率.     

不同来源苹果茎沟病毒分离物部分序列分子特性研究

[目的]明确为害新疆不同品种梨的苹果茎沟病毒(Apple Stem Grooving Virus,ASGV)侵染状况,并对获得的病毒基因序列进行分子鉴定.[方法]采用生物学和分子生物学方法对来源于新疆梨、砂梨及红梨上的ASGV进行检测,将获得基因序列进行比对分析.[结果]从10份新疆梨、2份砂梨及3份云南红梨样品上扩增到预期大小为500 by的ASGV扩增产物.对扩增产物进行克隆和测序,序列分析的结果显示,15个ASGV分离物的CP基因核昔酸及其编码的氨基酸序列相似性分别为88.2;-100;和95.6;-100;,CP基因核苷酸序列构建系统发育树显示,来源于库尔勒香梨分离物KII-3、KII-5、KII-7和新梨7号的分离物XII-5、XII -6,与早期已报道的库尔勒香梨分离物KRL-1及砂梨分离物P-6-1-17亲缘关系较近,聚集成簇.此外,库尔勒香梨的分离物KII-10、KII-14及新粱7号的分离物XII-10与云南红梨上2个分离物YN-2和YN-4聚集成簇,遗传距离较近.[结论]CP基因核昔酸序列系统发育树显示,来源于新获不同品种梨的8个ASGV 分离物及红梨上3个ASGV分离物位于两个不同的组群,存在复杂遗传变异现象.     

建兰花叶病毒的分子生物学检测

根据建兰花叶病毒外壳蛋白基因的保守序列设计2对引物,采用IC-RT-PCR方法和质粒梯度稀释的方法,研究建兰花叶病毒的分子检测方法和灵敏度.结果表明,从21个建兰花叶病毒的病株样品中均能扩增出与预期大小相同的DNA条带,序列测定和序列同源性分析表明所测定的序列均为CyMV外壳蛋白基因的部分序列,序列同源性均达到89%以上;灵敏度检测结果表明:可检测的最低病毒含量为2.72×10-7 μg/mL.     

利用原位杂交及原位RT-PCR技术检测梨树组织中苹果茎痘病毒的分布

 【目的】搞清苹果茎痘病毒在梨树组织中的分布,为茎尖脱毒提供直接的理论依据和技术支撑。【方法】以库尔勒香梨茎尖、叶片为材料,利用非放射性标记物地高辛（DIG）,通过RT-PCR反应体系,合成了苹果茎痘病毒的cDNA探针,利用核酸探针斑点杂交检测方法对该探针特异性及灵敏度进行验证。研究制作了适合原位PCR及原位杂交的石蜡切片,利用原位反转录酶聚合酶链式反应（IS-RT-PCR）技术检测石蜡切片组织中苹果茎痘病毒RNA的定位及分布,并对影响实验结果的重要因素进行优化。【结果】梨树中的苹果茎痘病毒RNA阳性信号主要位于叶片的叶肉细胞、茎尖的外围皮层组织及相应的初生维管束。蛋白酶K消化时间以20 min为宜,要获得良好的扩增效果,RT 反应体系中RNasin的量需大于0.2 U?μl-1,dNTPs大于0.4 mmol?L-1,SuperScriptⅡ在0.1～1.3 U?μl-1,引物在0.9 μmol?L-1以上。PCR反应体系中适宜的退火温度为60℃,循环35次,引物浓度应在0.8～1.2 μmol?L-1,LA Taq酶浓度大于0.5 U?100?μl-1。【结论】梨树茎尖顶端分生组织0.25 mm的区域为无病毒区域。