细脚拟青霉液体栽培及氨基酸成分分析

[目的]对细脚拟青霉进行液体栽培研究,并对其氨基酸成分进行分析。[方法]利用马铃薯葡萄糖蛋白胨液体培养基进行液体栽培试验,测定孢梗束产量,并对液体栽培的细脚拟青霉孢梗束和摇瓶培养的细脚拟青霉菌丝体的氨基酸含量进行测定比较。[结果]液体栽培的干孢梗束产量为2.50 g/L;氨基酸分析表明,细脚拟青霉孢梗束的芳香族氨基酸是菌丝体中的2倍,但菌丝体中的人体必需氨基酸、儿童必需氨基酸和甜味氨基酸含量高于孢梗束。[结论]该研究为细脚拟青霉相关产品的开发提供了参考。     

比色法测定细脚拟青霉胞内甘露醇及羟自由基清除率

[目的]采用比色法测定细脚拟青霉菌丝体中的甘露醇含量及羟自由基清除率。[方法]以细脚拟青霉为供试菌株,用超声提取法提取细脚拟青霉菌丝体中的甘露醇,以D-甘露醇为标准品,绘制其标准曲线并计算其回归方程,通过测定甘露醇的吸光度计算细脚拟青霉菌丝体中的甘露醇含量及羟自由基清除率。同时,测定培养时间和提取时间对菌丝体中甘露醇含量和抗氧化活性的影响。[结果]甘露醇在412 nm处有最大吸收峰,质量浓度在10~80μg/m l范围内其具有良好的线性关系,其回归方程为:C=103.09A-1.381 4,r=0.998 8;平均回收率为101.47%,RSD为2.6%(n=5)。菌丝体中的甘露醇含量及羟自由基清除率的变化趋势基本不随培养时间改变,培养第6天时均达到最高值,分别为73.56μg/m l和47.95%。[结论]为进一步研究细脚拟青霉的抗氧化功能提供理论依据。     

两种常见拟青霉的rRNA基因ITS区及5.8SrRNA基因的克隆测序

对粉拟青霉和细脚拟青霉rRNA基因内转录间区(ITS)和5.8SrRNA基因进行了克隆和测序,并将之与在CenBank中已登录的粉拟青霉和细脚拟青霉的同类序列比较,发现Park et al.登录的粉拟青霉(登录号AF237664)是一个不正确的序列,实际是细脚拟青霉的序列.序列的测定为今后粉拟青霉种下分类以及这两种真菌特异性引物或探针的设计创造了条件.     

一株核桃树内生真菌的分离鉴定及活性研究

[目的]从核桃树皮内分离筛选具抑菌活性的内生真菌菌株。[方法]核桃树皮经自来水冲洗后置于培养基以产生真菌菌株,对获得的菌株进行形态学观察及抑菌活性测试。[结果]从核桃树皮内分离到一株产广谱、高活性抑菌物质的内生真菌。经测定对细菌、植物病原真菌和皮肤致病真菌共24种病原微生物有不同程度的抑制作用。形态特征表明,该菌株与拟青霉属Paecilomyces Bainier中的淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus的特征基本一致,ITS序列分析显示本菌株与各淡紫拟青霉同源性都高于99%,因此将菌株JY-1024命名为淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinusJY-1024。[结论]该研究首次从核桃树皮内分离得到淡紫拟青霉并首次报道了其抑菌活性。     

细脚拟青霉腺苷酸琥珀酸合酶基因的克隆与表达分析

腺苷酸琥珀酸合酶(ADSS)为细脚拟青霉(Paecilomyces tenuipes)有效成分腺苷合成代谢途径的关键酶,而细脚拟青霉中腺苷酸琥珀酸合酶基因Ptadss的克隆与序列分析鲜见相关报道。本文在细脚拟青霉转录组测序结果的基础上,利用PCR技术克隆得到该菌Ptadss基因的cDNA序列,对Ptadss基因及其编码的蛋白进行生物信息学分析(相关理化性质、结构域、亲水性-疏水性、亚细胞定位、信号肽和高级结构等),并构建PtADSS与相关微生物ADSS的系统进化树。同时,采用实时荧光定量PCR技术,分析Ptadss基因在不同发酵阶段的细脚拟青霉菌丝体中的表达量,以初步明确该基因的表达量对于细脚拟青霉腺苷含量的影响。结果表明:克隆得到的Ptadss基因的ORF序列为1 670bp。该基因编码的蛋白的基本性质为:423个氨基酸残基、相对分子量为46.7 663kDa、等电点(pI)为5.59,含58个磷酸化位点,且该蛋白为定位于细胞质中的非分泌性和非跨膜的疏水性蛋白。结构预测结果表明该蛋白是由α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲组成的复杂结构。序列分析结果提示,细脚拟青霉Ptadss基因与Cordyceps confragosa腺苷酸琥珀酸合酶基因同源性最高,可达91%。结合其他微生物的ADSS氨基酸序列构建系统树,结果表明细脚拟青霉与Cordyceps confragosa亲缘关系较近。另经对不同发酵阶段的细脚拟青霉中Ptadss的表达量及腺苷含量分析结果表明:Ptadss基因的表达水平与菌丝体中腺苷含量存在正相关性。     

几种虫生真菌的铜耐受性及选择分离

在含铜ＰＤＡ平板上初步测定了铜对３种虫生真菌和不同土壤微生物生长的影响。结果表明：球孢白僵菌、细脚拟青霉和金龟子绿僵菌均有很高的铜耐受性，最高生长铜浓度大于８００ｍｇ／Ｌ，一定浓度范围的铜（２００￣４００ｍｇ／Ｌ）对球孢白僵菌的生长有促进作用；所有的土壤细菌和绝大多数土壤真菌对铜（２００￣４００ｍｇ／Ｌ）敏感。据此，很容易利用含铜ＰＤＡ培养基从接种球孢白僵菌和细脚拟青霉分生孢子的土壤中分离获得该菌     

超声提取对细脚拟青霉菌丝体抗氧化活性的影响

[目的]研究超声提取对细脚拟青霉菌丝体抗氧化活性的影响,确立最佳提取工艺。[方法]以DPPH自由基清除率为指标,采用单因素试验和L9（34）正交试验法对提取溶剂、提取次数、超声温度、时间、料液比和超声功率等条件进行研究。[结果]超声提取细脚拟青霉菌丝体中抗氧化活性成分的最佳工艺条件为：以水为提取溶剂,提取温度30℃,提取时间30 min,料液比1∶30,提取功率290 W,提取次数2次。[结论]与常规提取方法相比,超声波提取法是一种简单、耗时短、效率高的提取方法。     

蝉花真菌液体发酵及活性成分测定

利用蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae)菌株进行液体发酵,并进行单因素和正交试验,以实现蝉花真菌液态发酵条件包括pH值、温度、摇床转速、培养基装液量的优化。结果表明,蝉花液体发酵的最优条件为pH值7.4、摇床转速150 r/min、温度28℃、装液量40%;在此条件下,测得的真菌多糖含量为107.45 mg/g,虫草酸含量为95.82 mg/g,真菌多糖、虫草酸含量皆高于天然蝉花。     

羊蹄内生真菌的分离鉴定及其多样性分析

[目的]为从羊蹄中寻找具有药用价值的内生真菌奠定基础。[方法]利用PDA培养基进行羊蹄内生真菌的分离、纯化和初步鉴定,并对其进行多样性分析。[结果]从羊蹄中共分离到45株内生真菌,其中根部21株,占46.67%。从茎部和叶部分别分离到14株和10株。这说明羊蹄根部的内生真菌资源比茎部和叶部更为丰富。羊蹄根部的内生真菌比茎中和叶中生长得快。形态学鉴定结果表明分离菌株中共有青霉属8株,木霉属4株,镰孢霉属3株,拟茎点霉属、黑霉属和曲霉属各1株,无孢类群27株(占整个内生真菌类群的60%)。[结论]青霉属、木霉属和镰孢霉属为羊蹄内生真菌的优势种属,而无孢类群为其绝对优势类群。     

药用蕨类植物狗脊内生真菌的初步研究

[目的]研究药用蕨类植物狗脊的内生真菌。[方法]首次从蕨类植物狗脊的根、茎、叶中分离获得内生真菌,光学显微镜下观察真菌的形态。[结果]从狗脊的根、茎、叶中共分离获得14株内生真菌,分属于3纲4目5科7属,多数属于半知菌,拟青霉属和拟盘多毛孢属为优势属,分别占总株数的28.57%和21.42%。狗脊的不同部位内生真菌的数量、分布、种群及组成存在差异。狗脊根、茎、叶分离内生真菌的频率顺序为:茎>根>叶,拟青霉属也是狗脊根、茎和叶内生真菌的优势种类。[结论]该研究丰富了内生真菌的生物种群。     

3株泰山虫草无性型的分子生物学研究

[目的]研究3株泰山虫草无性型的分子生物学特性。[方法]以野生泰山虫草子实体分离出的3个菌株为材料,通过对rDNAITS区的扩增、克隆和测序来鉴定虫草的无性型。[结果]3个菌株不是同1种,COA1为蛹草拟青霉,COA2为球孢白僵菌,COA3为细脚棒束孢,由此推断泰山虫草只是以地理位置得名。[结论]研究了3株泰山虫草无性型的分子生物学特性。     

7株细脚拟青霉代谢物中抗真菌活性物质的初步研究

以1种霉菌为指示菌,采用薄层色谱法对7株细脚拟青霉发酵的代谢产物进行抑菌活性试验.根据抑菌圈大小判定代谢物抑菌活性的大小,从而筛选出高活性菌株.同时以致病菌白色念珠菌为指示菌,采用牛津杯法对筛选出的菌株进行了进一步抑菌活性验证, 确认了RCEF0969菌株具有较高的抑制真菌的活性,其薄层色谱法的抑菌圈直径为22.65 mm.     

蚯蚓体内植酸酶的来源研究

[目的]研究蚯蚓体内植酸酶的来源,为其开发利用提供借鉴。[方法]将干蚯蚓与0.9%NaCl溶液按照1∶4的比例在50℃条件下反应8 h,获得蚯蚓自溶液,再稀释得到10-1、10-2、10-33个浓度梯度溶液,涂布在改良的细菌培养基、合成培养基、改良的查氏培养基及含有植酸钙的琼脂平板上,在不同温度下培养。[结果]在改良的查氏培养基上,28℃培养5 d,出现了透明菌圈,且该透明菌圈随着培养时间的延长而逐渐扩大;在改良的细菌培养基、合成培养基及琼脂平板上均无透明菌圈出现。[结论]蚯蚓体内植酸酶来自于蚯蚓体内的真菌,而非细菌产生或蚯蚓自身产生。     

野生毛葡萄籽原花青素对茶籽油的抗氧化活性研究

[目的]为进一步开发利用野生毛葡萄籽原花青素提供试验依据。[方法]以野生毛葡萄籽中的原花青素为抗氧化剂,采用Schaal烘箱法定期测定茶籽油样品的过氧化值。比较原花青素与PG、BHT、VE的抗氧化活性。[结果]质量百分数为0.04%的野生毛葡萄籽原花青素的抗氧化性比0.02%BHT、0.01%PG和0.02%VE的稍差,0.02%原花青素与0.01%VE混合使用的效果较好。添加0.04%的原花青素可使茶籽油在20℃下的保质期由100 d延长至175 d,而0.02%PC+0.01%VE可使其延长至352 d。[结论]野生毛葡萄籽原花青素对茶籽油有一定抗氧化作用,并且最适添加量为0.04%。单独使用时其效果不如BHT、PG和VE,与VE混合使用时,其效果优于它们。     

大叶黄杨内生真菌的分离及抑菌活性研究

[目的]从大叶黄杨中找到具有抗菌活性的内生真菌。[方法]采用PDA双抗培养基从大叶黄杨茎和叶中分离内生真菌,对其分别进行液体培养,将发酵后所得的发酵液用乙酸乙酯萃取处理,以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌为试验菌株,用纸片法对分离的真菌及其次生代谢产物进行了抑菌试验。[结果]从大叶黄杨茎和叶中分离得到28株内生真菌,其中有21株内生真菌的发酵液粗提物对指示菌株有一定的抑制作用,占总分离菌株的75%。[结论]大叶黄杨内生真菌的次生代谢产物中存在着丰富的天然活性抑菌物质,可为寻找新型抗菌物质提供资源。     

几种天然抗氧化剂清除自由基能力的比较研究

[目的]寻求比较几种天然抗氧化剂清除体外自由基能力的新方法。[方法]以TB、HQ为对照,用DPPH法、邻二氮菲-Fe2+分光光度法和邻苯三酚自氧化法比较天然抗氧化剂Vc、VE、TP和迷迭香提取物对有机DPPH.、OH.及超氧自由基O2-.的清除能力。[结果]试验条件下TP对DPPH.和OH.的清除能力强于Vc、VE和迷迭香提取物,而Vc对超氧自由基O2-.的清除效果较好。DPPH法较其他两种方法更适于比较这几种天然抗氧化剂清除自由基的能力。[结论]DPPH法可用于比较Vc、VE、TP、迷迭香提取物和TBHQ清除DPPH.的能力。