植物病毒编码RNA沉默抑制子的研究进展

RNA沉默是真核生物用来抵抗病毒入侵的一种普遍而又古老的防御机制，而病毒在进化过程中也相应地产生了一些与之抗衡的功能，其中编码沉默抑制子就是对抗RNA沉默的有效策略。它们分别能够在不同阶段，以不同的方式干扰来自于寄主的RNA沉默，从而有效地建立侵染。本文主要针对目前已经发现的由植物病毒编码RNA沉默抑制子的作用特征、鉴定方法以及作用副效应进行综述，并讨论了RNA沉默抑制子的研究及应用前景。     

烟草丛顶病毒编码的沉默抑制子初步鉴定

 烟草丛顶病毒（Tobacco bushy top virus,TBTV）为幽影病毒属成员,能在烟草上造成严重危害。TBTV基因组编码4个ORF,其中ORF3和ORF4几乎完全重叠,可能在TBTV的致病性中发挥重要作用。分别将TBTV的ORF3和ORF4与载体pGR107连接,构建植物表达载体pGR107 ORF3,pGR107 ORF4。经农杆菌与含外源GFP基因的pGREEN208共浸润转GFP基因的本氏烟16c叶片,2～5d后（days post inoculation,dpi)在紫外灯下观察发现浸润区有明显绿色荧光,其中pGR107 ORF4在12dpi后浸润区绿色荧光区域扩大,推断ORF4编码产物可能具有局部抑制本氏烟16c对外源GFP基因进行沉默的功能;而pGR107 ORF3浸润区绿色荧光逐渐恢复红色,GFP基因发生沉默,说明ORF3编码产物不具有抑制基因沉默的功能。进一步利用real time PCR定量检测发现,pGR107 ORF4浸润15 dpi 的本氏烟叶片中GFP RNA的含量要比仅接种pGR107的对照高,比未接种的本氏烟16c稍低。推断是因为ORF4编码蛋白抑制了植物对外源GFP RNA产生的沉默,使GFP得以在本氏烟内表达。由此进一步证实ORF4编码产物是TBTV的基因沉默抑制子。     

植物病毒沉默抑制子P25的原核表达及纯化

通过体外DNA重组技术将P25基因连接在pET28a（＋）载体上，构建成重组质粒。经PCR扩增、酶切鉴定及DNA序列分析，融合的P25基因序列正确。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行异丙基β-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，经过亲和层析得到纯品目的蛋白P25。     

甘蔗黄叶病毒P0蛋白分子特性及其抑制RNA沉默活性

【目的】甘蔗黄叶病（yellow leaf,YL）是一种主要的甘蔗病毒病害,在全球多数甘蔗种植国家或地区普遍发生,已对甘蔗生产造成严重威胁。其病原为甘蔗黄叶病毒（Sugarcane yellow leaf virus,SCYLV）,属于黄症病毒科马铃薯卷叶病毒属成员。研究SCYLV编码的沉默抑制子P0蛋白的分子特征、保守结构域及其在自然寄主甘蔗上抑制RNA沉默的功能,为下一步从RNA沉默水平解析SCYLV致病分子机理奠定基础。【方法】利用RT-PCR克隆技术获得SCYLV中国分离物CHN-FJ4编码的RNA沉默抑制子基因P0及其两个缺失突变体P0^Δ2-15（N端缺失15个氨基酸）和P0^Δ155-256（C端缺失102个氨基酸）,然后定向克隆到单子叶植物表达载体pUbi-nos（空载体）上,获得重组质粒。利用甘蔗嫩叶组织瞬时表达系统鉴定病毒RNA沉默抑制子技术,结合ImageJ软件定量分析P0及其两个缺失突变体抑制外源基因EYFP瞬时表达活性的变化。番茄丛矮病毒（Tomato bushy stunt virus,TBSV）编码的P19作为沉默抑制子阳性对照。【结果】P0核苷酸序列的遗传进化分析结果显示,所获得的SCYLV病毒分离物CHN-FJ4为BRA基因型,与其他BRA基因型分离物氨基酸序列一致性为96.1%-98.4%。利用MEME在线软件预测P0蛋白的保守结构域,结果表明P0蛋白含有3个显著的保守区。分别位于第1-60、76-125和161-210氨基酸残基。通过Datamonkey在线服务器（http://www.datamonkey.org）提供的5种运算方法分析P0蛋白氨基酸位点的选择压力,结果显示P0蛋白具有8个氨基酸正向选择位点。将含有P0及其缺失突变体的重组质粒连同含EYFP报告基因的pTEM12质粒采用基因枪轰击法分别导入甘蔗嫩叶组织细胞,轰击后48-120 h,P0和P19逐渐地提高EYFP荧光表达点数和荧光表达水平;在120 h,与pUbi-nos空载体（不含沉默抑制子）对照组相比,P0和P19均显著地提高甘蔗嫩叶组织EYFP荧光表达点数和荧光表达水平,分别达1.6倍和4.0倍以上。P0与P19抑制RNA沉默活性水平没有显著差异（P>0.05）。P0蛋白N端缺失15个氨基酸（P0^Δ2-15）和C端缺失102个氨基酸（P0^Δ155-256）均丧失了沉默抑制子的功能,荧光表达与不含沉默抑制子对照组相当。【结论】在甘蔗嫩叶组织EYFP瞬时表达体系上,P0能够显著地提高外源基因EYFP表达水平。P0蛋白N端15个氨基酸和C端102个氨基酸含有显著的保守区域,是P0发挥沉默抑制子功能所必需的。     

水稻条纹病毒安徽分离物NS3基因的克隆及其RNA沉默抑制子功能的初步鉴定

采集安徽马鞍山水稻条纹叶枯病感病稻株,TRIzol法提取样本总RNA,设计特异性引物进行RT-PCR扩增,获得水稻条纹病毒(RSV)安徽分离物的RNA3部分片段,克隆并测序。序列分析表明,该片段全长874 nts,含有完整的NS3基因,NS3基因序列长度为636 nts,编码211个氨基酸。序列比对发现,RSV安徽分离物NS3基因与来源于华东各省市RSV分离物NS3基因间的序列相似性高达97.6%～99.4%,而与RSV云南分离物NS3基因间的序列相似性相对较低,为93.4%～95.4%。构建RSV NS3基因系统关系树,发现RSV安徽分离物NS3基因与来源于华东各省市8个RSV分离物NS3基因聚成一个单独的分支,说明华东各省市各个RSV分离物亲缘关系最近。将RSV安徽分离物NS3基因插入植物表达载体pBIN438,构建重组植物表达载体pBIN-NS3并转化农杆菌。将含pBIN-NS3的农杆菌和含pBIN-GFP的农杆菌共浸润16c本氏烟叶片,6天后紫外灯下观察发现,共浸润区表现出强烈的绿色荧光,说明16c本氏烟GFP基因局部沉默被抑制,可以初步证明RSV安徽分离物编码的NS3蛋白是一个RNA沉默抑制子。     

水稻条纹病毒安徽分离物NS3基因的克隆 及其RNA沉默抑制子功能的初步鉴定

采集安徽马鞍山水稻条纹叶枯病感病稻株,TRIzol法提取样本总RNA,设计特异性引物进行RT-PCR扩增,获得水稻条纹病毒（RSV）安徽分离物的RNA3部分片段,克隆并测序。序列分析表明,该片段全长874 nts,含有完整的NS3基因,NS3基因序列长度为636 nts,编码211个氨基酸。序列比对发现,RSV安徽分离物NS3基因与来源于华东各省市RSV分离物NS3基因间的序列相似性高达97.6%～99.4%,而与RSV云南分离物NS3基因间的序列相似性相对较低,为93.4%～95.4%。构建RSV NS3基因系统关系树,发现RSV安徽分离物NS3基因与来源于华东各省市8个RSV分离物NS3基因聚成一个单独的分支,说明华东各省市各个RSV分离物亲缘关系最近。将RSV安徽分离物NS3基因插入植物表达载体pBIN438,构建重组植物表达载体pBIN-NS3并转化农杆菌。将含pBIN-NS3的农杆菌和含pBIN-GFP的农杆菌共浸润16c本氏烟叶片,6天后紫外灯下观察发现,共浸润区表现出强烈的绿色荧光,说明16c本氏烟GFP基因局部沉默被抑制,可以初步证明RSV安徽分离物编码的NS3蛋白是一个RNA沉默抑制子。     

植物转录后基因沉默抑制蛋白研究进展

转录后基因沉默现象广泛存在于植物、动物和真菌中。在植物中转录后基因沉默现象是对外来病毒入侵的一种防御机制。植物病毒既是转录后基因沉默的起始物、靶目标，又是编码抑制转录后基因沉默的蛋白。已经发现3种病毒抑制子作用于转录后基因沉默的不同阶段：烟草蚀刻病毒蛋白（HC-Pro）作用于转录后基因沉默的持续阶段，产生25nt小RNA的上游和产生沉默信号的下游区域；马铃薯x病毒蛋白（P25）和黄瓜花叶病毒蛋白（CMV2b）作用于转录后基因沉默的信号阶段。     

抗病毒RNA沉默和病毒拮抗RNA沉默策略研究进展

RNA沉默通指在转录或转录后水平上由RNA介导、序列特异性地降解靶标RNA从而抑制基因表达的过程。在动物、真菌和植物中,RNA沉默是通过小RNA的形成来抵御病毒侵染的,病毒自身可以作为RNA沉默的诱导子和靶标。病毒通过进化形成积极的和消极的策略来对抗RNA沉默。为此,主要讨论了siRNAs和miRNAs介导的抗病毒RNA沉默以及病毒蛋白和RNA介导的沉默抑制作用,有助于阐明病毒侵染与寄主之间的相互关系,为抗病毒研究奠定基础。     

南方水稻黑条矮缩病毒S6编码一个沉默抑制子

 【目的】分析南方水稻黑条矮缩病毒（SRBSDV）基因组S6编码的SP6蛋白的抑制子活性,明确SRBSDV是否编码RNA沉默抑制子来干扰植物的沉默。【方法】将分别含有SP6与GFP质粒的农杆菌共浸润转GFP基因的16c本氏烟纯合系,观察SP6对局部沉默和系统沉默的抑制作用;将含有SP6,GFP和dsGFP质粒的农杆菌三者共浸润,观察SP6对由dsRNA引起的沉默的抑制作用;在同一植株不同部位接种GFP和SP6,观察SP6对RNA沉默信号传导的影响;通过马铃薯X病毒（Potato virus X,PVX）在本氏烟上表达SP6,观察SP6是否能增强PVX的致病性。【结果】SP6能抑制由GFP正义RNA介导的沉默,但其抑制作用较弱,仅能延缓局部沉默和系统沉默的产生。SP6能灭活RNA沉默信号,阻止沉默信号的长距离传导,回复GFP的沉默,但不能抑制由dsRNA引起的沉默。利用PVX在本氏烟上表达SP6能增强PVX的致病性。【结论】SP6是病毒编码的RNA沉默抑制子,在RNA沉默的起始和信号传导阶段起作用。     

病毒基因沉默抑制因子与AGO蛋白结合抑制RNA沉默的研究进展

总结了RNA沉默及病毒RNA沉默抑制因子(VSRs)的研究进展,以及病毒基因沉默抑制因子利用甘氨酸/色氨酸(GW)模型作为ARGONAUTE(AGO)钩和寄主发生RNA沉默的重要作用部位相互结合从而抑制基因沉默的研究机制。通过研究发现,在酵母、动植物细胞中,一些包含GW模型的蛋白质被认为是RNA沉默效应复合物中AGOs的重要协助者。结果说明,GW模型是一种能用于调节RNA沉默途径活性的万能的、有效的工具,用GW模型竞争性结合AGOs并抑制寄主基因沉默可能是一种被许多病原菌用于抵抗寄主RNA沉默的方法。     

Reproduction of shallot virus X in absence of its own active suppressor protein of RNA silencing

By means of an agrobacterial transient expressing system, it was determined that proteins that are encoded by open reading frames 2, 3, 4, 5, and 6 in the genome of Shallot virus X do not have the function of local RNA silencing suppression.     

Measurement of suppressor transfer RNA activity

Transfer RNA (tRNA) suppression of nonsense mutations in prokaryotic systems has been widely used to study the structure and function of different prokaryotic genes. Through genetic engineering techniques, it is now possible to introduce suppressor (Su+) tRNA molecules into mammalian cells. A quantitative assay of the suppressor tRNA activity in these mammalian cells is described; it is based on the amount of tRNA-mediated readthrough of a terminating codon in the influenza virus NS1 gene after the cells are infected with virus. Suppressor activity in L cells continuously expressing Su+ (tRNAtyr) was 3.5 percent and that in CV-1 cells infected with an SV40- Su+ (tRNAtyr) recombinant was 22.5 percent.     

中国番茄黄化曲叶病毒编码的RNA沉默抑制子AC4蛋白的核酸结合特性

农杆菌共浸润试验结果表明:中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)Y10分离物编码AC4蛋白是RNA沉默抑制子.为了研究RNA沉默抑制子AC4蛋白的作用机制,将TYLCCNV-Y10的AC4基因插入到原核表达载体pET-32a的多克隆位点上,构建重组原核表达载体pET32a-YIOACA.将重组载体导入BL21(DE3)pLysS进行ACA蛋白表达,并在自然条件下纯化蛋白.利用原核表达的ACA蛋白进行电泳迁移率变动试验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA),分析ACA蛋白分别与单、双链siRNA和单、双链长RNA的结合情况.试验结果表明:TYLCCNV-Y10编码的ACA蛋白具有结合单链siRNA和单链长RNA特性,而不与双链siRNA和双链长RNA结合.     

Induction and suppression of RNA silencing by an animal virus

RNA silencing is a sequence-specific RNA degradation mechanism that is operational in plants and animals. Here, we show that flock house virus (FHV) is both an initiator and a target of RNA silencing in Drosophila host cells and that FHV infection requires suppression of RNA silencing by an FHV-encoded protein, B2. These findings establish RNA silencing as an adaptive antiviral defense in animal cells. B2 also inhibits RNA silencing in transgenic plants, providing evidence for a conserved RNA silencing pathway in the plant and animal kingdoms.     

影响RNA提取质量的因素分析

RNA提取技术已经成为分子生物学中一个基本技术.教学和有一定特殊要求的科学研究需要透彻了解影响RNA提取的详细因素.细节对RNA提取的质量至关重要.本文对CTAB法提取RNA的全过程中各种影响因子进行了分析:CTAB法可以被用于RNA的提取;在CTAB提取缓冲中的温育时间以及机械摇动力是影响所提RNA质量的两个主要因素...     

抗水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的双价RNA沉默载体的构建

为利用RNAi技术获取抗水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)和南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)植株,分别针对两种病毒的S6和S10基因构建RNA沉默载体。采用重组PCR方法将RBSDV S6基因片段(R6)和SRBSDVS6基因片段(SR6)进行融合,获得600 bp的R6-SR6融合基因;将RBSDV S10基因片段(R10)和SRBSDV S10基因片段(SR10)进行融合,获得600 bp的R10-SR10融合基因。融合基因以反向重复的方式连入pBS载体,并定向插入到pCAMBIA1301载体上,获取了含有发夹结构的植物表达载体pCAMBIA1301-hp(R6-SR6)和pCAMBIA1301-hp(R10-SR10)。抗RBSDV和SRBSDV RNA沉默载体的构建为利用RNA沉默进行植物抗病毒研究奠定了基础。