日本结缕草ZjNAC3基因在盐胁迫中的功能

盐胁迫能够加速草坪草的黄化,影响草坪的坪观质量.植物中的NAC转录因子在盐胁迫条件下发挥着重要作用,参与胁迫响应,而在日本结缕草(Zoysia japonica)中还鲜有NAC转录因子的功能研究.本研究对转ZjNAC3基因(GenBank登录号:MT254544)的YPH500酵母菌株进行盐敏感性检测,初步判定ZjNA...     

结缕草ZjNAC基因的克隆与表达分析

NAC类家族的基因是植物特有的转录因子,并且它在植物的生长发育中发挥着重要的作用。本研究以结缕草为研究材料,对结缕草转录组数据库利用local blast的办法克隆出1个NAC类转录因子。为深入探讨和研究NAC类转录因子在植物逆境生理上的作用奠定基础。通过与水稻的OsNACs家族成员进行进化树分析,结合蛋白分析,QRT-PCR等的方式探索其生物学功能。实验结果表明,该基因长度为1496 bp,包含1个完整开放阅读框(ORF),长度为1332 bp,编码449个氨基酸,该蛋白含有1个NAM结构域。与水稻的NAC类转录因子家族的系统进化树对比发现,它与OsNAC036近缘性最高,因此将该基因命名为ZjNAC036。QRT-PCR结果显示,该基因在干旱情况下表达量呈上升趋势,并且干旱处理8 h的时候,差异倍数最大,达到了50倍左右,而在盐胁迫、低温胁迫下没有规律性变化。这表明ZjNAC036在干旱逆境生理上可能有重要的作用,而在高盐及寒冷的逆境生理方面可能作用不大。     

日本结缕草ZjNAC3基因的克隆与功能分析

从日本结缕草中克隆获得ZjNAC3基因,编码区全长1167bp,并获得含1622bp的启动子序列.保守结构域分析表明,克隆的ZjNAC3基因属于NAC转录因子家族.启动子分析表明,启动子中含有多个激素、胁迫响应元件.脱落酸(ABA)、乙烯(ETH)、茉莉酸甲酯(MeJA)、氯化钠(NaCl)、甘露醇(Mannitol)...     

日本结缕草ZjZFN1基因对拟南芥的转化及其耐旱性分析

锌指蛋白在植物干旱胁迫中起重要作用,尽管已经在各种植物中克隆并鉴定了编码这些蛋白质的基因,但是它们在日本结缕草中的功能和潜在的转录机制还不清楚。通过花序侵染法将ZjZFN1基因及其启动子转化拟南芥,并通过草铵膦/潮霉素抗性筛选和PCR鉴定,获得转基因株系。ZjZFN1的启动子能够驱动GUS基因的表达,在甘露醇处理下的GUS基因表达水平显著高于对照;在拟南芥中过表达ZjZFN1降低了种子发芽率,减弱了植物对干旱胁迫的适应性和植物在干旱胁迫下的生长状况;干旱处理后,转基因植株中的丙二醛含量高于野生型植株,而脯氨酸含量显著低于野生型植株;实时荧光定量分析表明对过表达ZjZFN1的拟南芥进行干旱处理后,POD、SOD、P5CS、LEA的表达水平降低,而APX的表达水平升高。ZjZFN1基因的过表达可减弱植物的耐旱性,为进一步开发利用该基因奠定基础。     

日本结缕草ZjNAC1的克隆、转录激活活性、亚细胞定位及表达分析

采用RACE技术从日本结缕草中克隆得到ZjNAC1转录因子(GenBank No. MH428376),其开放阅读框为945bp,编码314个氨基酸。ZjNAC1编码的蛋白在N端有1个典型的NAM保守结构域,属于NAC转录因子家族。通过染色体步移的方法,获得ZjNAC1基因ATG上游1635bp序列,分析发现其包含响应脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)及逆境胁迫的作用元件。构建pGBKT7-ZjNAC1载体,转化Y2HGold酵母感受态细胞,发现ZjNAC1具有转录激活活性。农杆菌介导的35S-ZjNAC1-YFP载体注射本生烟草叶片瞬时表达结果显示,ZjNAC1定位于细胞核。实时荧光定量结果表明,ZjNAC1在日本结缕草根中表达量最高;此外,ZjNAC1的表达受10μmol/L MeJA和20%PEG4000处理的诱导,但受200μmol/L乙烯(ET)、10μmol/L ABA和300mmol/L NaCl处理的抑制。     

低温胁迫下结缕草品种的抗寒性差异

低温胁迫兰引3号结缕草、青岛结缕草和交大1号结缕草3个品种,分别测定3个品种的叶片、茎、根茎的可溶性糖含量、游离脯氨酸含量,并进行了地下茎恢复生长试验.结果表明:低温胁迫下,叶片、茎、根茎的可溶性糖含量以交大1号最高,兰引3号最低;游离脯氨酸含量以兰引3号最高,交大1号最低;-12℃低温处理后兰引3号存活率为12%,青岛和交大1号全部死亡,-10℃低温处理后兰引3号存活率57%、青岛7%、交大1号8%;可溶性糖和游离脯氨酸二者有补偿作用;游离脯氨酸积累多抗寒性强,兰引3号结缕草抗寒性最强.     

不同纬度种群日本结缕草对冷胁迫的生理反应

对不同纬度分布的日本结缕草种质资源耐寒性进行了研究,低温是日本结缕草(Zoysia japonica)冬季生长的主要限制因素。在田间条件下,探讨其对冷胁迫-2℃的生理响应。结果表明,在冷胁迫下,起源于N 35°地区的草坪质量(TQ)显著低于其他纬度地区;起源高纬度地区的日本结缕草丙二醛(MDA)含量较低,超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性最高,而起源低纬度地区的过氧化氢酶(CAT)活性最低;SOD和CAT活性与纬度之间呈正相关,而MDA含量与纬度呈负相关。高纬度地区日本结缕草游离脯氨酸(Pro)、可溶性糖(SS)和可溶性蛋白(SP)含量显著高于低纬度地区日本结缕草,并与纬度呈正相关。     

生长期内三种结缕草对盐胁迫的响应

试验以大穗结缕草、沟叶结缕草和日本结缕草为试材,研究了不同盐浓度(0,0.2%,0.4%,0.6%,0.8%)对生长期内3种结缕草叶片膜脂过氧化及生长的影响。结果表明,3种结缕草的生物量均随着盐浓度的增加逐渐减小;随着盐浓度的提高及处理时间的延长,3种结缕草的可溶性蛋白含量逐渐降低;相对电导率和丙二醛含量增加,在低盐浓度(0.2%~0.4%)下,两者增加幅度较小,当盐浓度为0.8%时,3种结缕草的相对电导率均达最大值,分别是38.71%,41.32%,40.97%,可溶性蛋白含量均达到最小值,分别为2.08,1.15和1.33 mg/g FW。Pro含量在处理后第10天达最大值,之后逐渐下降,后期变化比较平稳。在低盐浓度(0.2%~0.4%)下,CAT和SOD活性逐渐降低,而高盐浓度(0.6%~0.8%)下,两种酶活性呈上升-下降-上升的趋势。3种结缕草相比,大穗结缕草在高盐浓度胁迫下的相对电导率和丙二醛含量最低,而保护酶活性和可溶性蛋白含量最高。试验证明大穗结缕草抗盐能力最强,沟叶结缕草次之,日本结缕草较差。     

日本结缕草ZjNOL基因的克隆及转录自激活检测

NYC1-like(NOL)编码的短链氧化还原酶是叶绿素b降解的必需酶。对日本结缕草(Zoysia japonica)ZjNOL基因全长克隆结果显示,该基因开放阅读框为981个核苷酸,编码327个氨基酸。生物学分析显示,ZjNOL蛋白与高粱(Sorghum bicolor)中的NOL蛋白的亲缘关系最近。利用pGBKT7载体,通过DNA重组技术成功构建pGBKT7-ZjNOL酵母表达载体,通过PEG介导的转化方法,成功导入Y2HGold酵母中,自激活检测显示含有pGBKT7-ZjNOL的Y2HGold酵母细胞能够在SD/-Trp培养基上正常生长,而在SD/-Trp/AbA培养基上不能生长,也不能在含有X-α-Gal培养基显蓝色,证明ZjNOL蛋白没有自激活活性。生物信息学分析及转录自激活检测有助于深入研究ZjNOL基因功能,为延长结缕草绿期,改善结缕草坪用质量奠定基础。     

结缕草对干旱胁迫的响应

通过对结缕草（Zoysia japonica）进行控水处理,测定干旱胁迫期间的叶片形态、叶片相对含水量、脯氨酸和可溶性总糖含量的变化。结果表明：（1）随着干旱胁迫时间的延长,结缕草叶片受害程度逐渐增加。在干旱胁迫初期,处理组叶片1／3萎蔫,并且开始卷曲;干旱胁迫到第9d时,植株整体处于萎蔫状态,部分叶片枯黄;干旱胁迫到第12d时,植株全部萎蔫,大部分叶片枯黄;干旱胁迫到第15d时,植株叶片全部枯黄。（2）叶片相对含水量的变化呈逐渐下降的趋势,干旱胁迫到6d后叶片含水量下降幅度增加,胁迫到12d后下降趋势又变缓慢。（3）随着干旱胁迫时间的延长,脯氨酸含量逐渐增加,干旱胁迫9d后脯氨酸含量大幅度增加,第12d后脯氨酸含量增加缓慢。（4）随着干旱胁迫时间的延长,可溶性总糖含量逐渐增加,胁迫到9d后可溶性总糖含量大幅度增加,胁迫到12d时达到最高值,然后可溶性总糖含量开始逐渐下降。     

大穗结缕草对盐胁迫的响应

研究了大穗结缕草Zoysia macrostachya在1.5%NaCl胁迫过程中叶片形态、相对含水量、可溶性总糖及游离脯氨酸含量的变化对盐胁迫的响应,其结果发现,随着盐胁迫时间的延长,叶片受害程度先增加,后保持稳定,胁迫到15 d时外观又略有恢复;叶片的相对含水量表现为先下降,后保持稳定.最后又缓慢上升的趋势;叶片可溶性总糖含量和脯氨酸含量表现为逐渐增加到一个峰值后又下降的趋势.在盐分胁迫下叶片可溶性总糖和脯氨酸的积累可能是大穗结缕草抗盐的生理机理之一.     

日本结缕草ZjNAC2转录激活验证及互作蛋白的初步筛选

为了进一步探究ZjNAC2在胁迫响应中的作用机制,本试验运用酵母双杂技术筛选与日本结缕草（Zoysia japonica）中的ZjNAC2转录因子相互作用的蛋白。通过克隆获得了日本结缕草ZjNAC2的基因序列并成功构建了诱饵载体pGBKT7-ZjNAC2,同时构建高质量的日本结缕草的均一化酵母杂交全长文库。通过酵母双杂筛库的实验筛选到30个阳性菌落,其测序表明获得了20个与ZjNAC2互作的蛋白。NR（Non-redundant protein sequences）注释分析结果显示,20个注释基因NR同源物种比对到9个物种,其中比对到高粱（Sorghum bicolor）中的注释基因最多。GO（Gene Ontology）注释结果表明这些基因可分为细胞组分、分子功能和生化过程3大类。本研究初步筛选到4个与抗病、植物生长发育过程相关的候选互作蛋白,为进一步探究ZjNAC2在日本结缕草中的下游调控机制奠定了基础。     

日本结缕草滞绿基因 ZjSGR 对烟草的转化及功能分析

SGR 基因是植物体内调控叶绿素降解的关键基因之一,在调控植物衰老以及响应非生物胁迫等方面也发挥着重要的作用。 本研究利用 DNA 重组技术,构建 35S::ZjSGR:YFP 植物表达载体,并通过农杆菌介导的方法成功转化烟草。PCR 和 qRT-PCR 结果显示日本结缕草滞绿基因ZjSGR已整合到烟草基因组中,并能够在转基因烟草中高效表达。在正常生长环境下,转基因烟草表现出黄化的表型。与对照相比叶绿素含量较低,光合速率下降。亚细胞定位实验证明ZjSGR定位在叶绿体,透射电镜观察结果表明过表达ZjSGR基因使叶绿体发育异常,且有加速降解的趋势。qRT-PCR结果发现转ZjSGR基因的烟草中SAG113,SAG12,NCED和AAO3的表达量明显高于野生型,衰老进程明显加快。本研究证明ZjSGR可在调控叶绿素降解和衰老的进程中发挥重要作用。     

结缕草肉桂醇脱氢酶基因家族全基因组序列鉴定和表达分析

肉桂醇脱氢酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase, CAD, EC 1.1.1.195)是植物木质素合成途径的关键酶,通过消耗NADPH,将松柏醛等复杂醛转化成相应的醇单体,在植物生长发育过程和逆境应答中起到重要作用。本研究从结缕草基因组中鉴定获得了16个肉桂醇脱氢酶(ZjCAD)基因,对其进行了系统进化与基因结构的生物信息学分析。半定量PCR分析显示5个ZjCAD基因在叶片中特异表达,木质素染色结合不同种源材料ZjCAD基因的表达分析进一步表明ZjCAD6的表达与叶片木质素含量正相关,提示ZjCAD6可能为控制结缕草叶片木质素合成的关键基因。ZjCAD6基因全长2736 bp,有3个内含子和4个外显子,开放阅读框为1074 bp,编码357个氨基酸。ZjCAD6蛋白含有两个Zn²⁺结合位点与一个NADP(H)结合结构域,与已报道的其他植物具催化活性的CAD蛋白特征一致。上述结果为进一步研究结缕草叶片木质素含量及其机械强度等性状形成的分子机理提供了重要的参考。     

结缕草ZjSGR基因在离体模拟逆境胁迫环境下的功能

结缕草（Zoysia japonica Steud.L）是禾本科多年生草本植物,适用于运动场草坪建植等。但结缕草在北方生长绿期较短,制约了其大面积的应用,因此培育绿期长、抗性好的结缕草品种成为重要育种目标。而SGR（STAY-GREEN）滞绿基因的发现为改善结缕草持绿性提供了便利。本研究通过对野生植株与结缕草Zjsgr突变株系的叶绿素含量、MDA （Malondialdehyde,MDA）含量、可溶性蛋白含量和抗氧化酶活性等指标进行检测,探究野生植株与突变植株在离体处理模拟的逆境胁迫下各指标之间的变化。结果表明：突变植株与野生植株相比,在逆境胁迫下叶绿素含量下降幅度更小;逆境胁迫下,突变植株的MDA含量和可溶性蛋白含量更低;在非胁迫环境下,突变植株部分抗氧化酶活性更高。总体来看Zjsgr突变植株在离体处理下具有较好的持绿性,较强的抗氧化能力。综上所述,ZjSGR基因可能与植物抗逆性有关,为全面研究ZjSGR基因的功能奠定了基础,对选育结缕草滞绿、抗逆品种具有重要作用。     

杀菌剂防治结缕草大斑病效果及生理响应

结缕草(Zoysia japonica)大斑病是一种由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)引起的草坪病害,在兰引Ⅲ号结缕草上危害严重.为了探究杀菌剂对大斑病的防治效果,本研究选用'扮绿'(156 g·L?1丙环唑)、'绘绿'(50％嘧菌酯)、'赛达'(0.31％嘧菌酯+0.75％丙环唑)、'卉乐'(12％...