磺胺甲嗯唑单克隆抗体的研制及免疫金标试纸检测方法的建立

用磺胺甲嗯唑人工免疫原（BSA-SMZ）免疫BALB／C小鼠（Mus muscalus）,细胞融合技术筛选抗磺胺甲嗯唑单克隆抗体（SMZ mAb）杂交瘤细胞,体内诱生腹水法制备SMZ mAb,并鉴定其免疫学特性;应用SMZ mAb研制SMZ残留快速检测金标试纸（SMZ-strip）,并测定其性能。结果表明,筛选出3株杂交瘤细胞,其中最好的3G6株间接ELISA效价细胞培养上清为1：8.1×10^2,腹水为1：6.4×10^5,亲和常数（K=a）为3.07×10^9L／mol,对SMZ的半数抑制浓度（IC50）为12.4μg／L,与磺胺嘧啶的交叉反应率（CR％）为2.84％,与其它磺胺类药物无交叉反应;SMZ-strip目测检测限为6μg/L;其敏感性与竞争ELISA试剂盒相当,符合率为100％;SMZ-strip具有快速、敏感、特异、简便等特点,适合于SMZ残留快速检测的推广应用。     

一种杂色曲霉素胶体金免疫快速检测试纸条的研制

通过制备杂色曲霉素半抗原,研制出一种能够检测饲料中杂色曲霉素的胶体金免疫层析试纸条,检测限为1μg/kg,检测时间仅为15 min,假阳性率和假阴性率均为0,符合《农残办技术材料要求及审查程序》要求.试纸条能够在基层实验室的大批量样本检测中得到应用,具有实际意义,并且未见胶体金免疫层析法的相关文献报道,具有创新性.     

莱克多巴胺单克隆抗体的研制及阻断ELISA检测方法的建立

用混合酸酐法将莱克多巴胺(RAC)偶联于牛血清白蛋白(BSA),合成免疫原BSA-RAC,并用紫外和凝胶电泳鉴定;用BSA-RAC免疫Balb/C小鼠,细胞融合技术建立抗RAC单克隆抗体(mAb)杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备RAC mAb。应用RAC mAb研制RAC残留快速检测阻断ELISA试剂盒(RAC-Kit),并测定其性能。结果表明,BSA-RAC偶联成功,分子结合比为1∶24.5;筛选出3株杂交瘤细胞,其中最好的4D8株的亲和常数Ka为1.65×1010L/mol。RAC-Kit的标准曲线呈典型的S型,符合4参数logit曲线拟合,线性范围为1~170μg/L,灵敏度为0.52μg/L,检测限为1μg/L,饲料样、猪尿样的平均添加回收率分别为91.1%和89.2%,平均批内和批间变异系数<15%,与多巴酚丁胺的交叉反应率为22.3%,与其他化合物无交叉反应,RAC-Kit在4℃可保存180d。     

氟喹诺酮类药物残留多元快速检测试纸条的研制

为研制一种快速、简便的胶体金免疫层析法的试纸条,用于对动物源食品中氟喹诺酮类药物残留检测,研究以沙拉沙星(SALX)多克隆抗体与胶体金结合为金标抗体,将纯化好的金标抗体喷涂在玻璃纤维垫上;包被抗原SALX-OVA和山羊抗兔二抗分别包被在硝酸纤维素膜上,制成免疫层析快速检测试纸条,并对试纸条的性能进行测定。结果表明,该快速检测试纸条的灵敏度为30ng/ml,检测时间为5～10min,不但可对沙拉沙星残留进行检测,而且还可对诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的残留进行检测。表明试纸条可对氟喹诺酮残留进行多元快速检测。     

甘薯曲叶病毒PCR-层析试纸条快速检测方法的建立

为了能够快速且同时大批量检测甘薯样本是否感染甘薯曲叶病毒（SPLCV）,本研究建立了SPLCV cp基因的PCR-层析试纸条快速检测方法。首先,本研究构建SPLCV cp基因的重组质粒作为阳性对照,并对标记的特异性引物的扩增条件进行优化。结果显示,退火温度为57℃时,特异性扩增效果最佳;特异性检测结果表明,该引物对与甘薯无症状1号病毒（SPSMV-1）、甘薯杆状DNA病毒B(SPBV-B)、甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）、甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）和甘薯潜隐病毒（SPLV）均无交叉反应,表明该引物对具有较高的特异性。其次,本研究构建了PCR-层析试纸条快速检测系统,当抗体包被磁粒时,20μg地高辛单克隆抗体为0.1 mg羧基磁粒的最佳抗体标记量。特异性扩增产物在新构建的层析系统中3 min左右进行可视化检测;灵敏度检测结果表明,该层析系统的最低检测限为0.000 1 ng·μL-1基因组DNA,灵敏度是普通凝胶检测的10倍,说明该系统灵敏度较高。综上,本研究建立的PCR-层析试纸条检测系统具有可视性、灵敏度高、简便快速的特点,且可以同时对大批量的样本进行SPLCV检验,满足了脱毒薯...     

胶体金免疫层析技术应用于农药残留检测的研究进展

为了解胶体金免疫层析技术(Immunochromatography assay, ICA)在农药残留检测中的应用进展,本文对胶体金及其标记物的制备,胶体金免疫层析试纸条的组装、应用和评价等进行了总结归纳,分析了ICA的局限性,讨论了ICA在未来应用中的发展方向。     

狐狸肉源性成分快速检测方法的建立

为了规范食品安全标识,防止非食用性的狐狸肉添加到肉品中导致伦理、宗教等敏感问题,迫切需要建立狐狸肉源性成分鉴定方法.本研究以狐狸、牛、羊、猪、鸭、驴和鼠肉以及模拟掺假样本为研究对象,根据狐狸线粒体基因序列设计特异性交叉引物组合,Bst DNA聚合酶反应体系经63℃恒温扩增60 min,扩增产物经电泳检测和一次性核酸试纸...     

抗苯巴比妥单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选及ciELISA试剂盒的研制

用BSA-pAPB免疫Balb/c小鼠，用细胞融合技术制备并用间接ELISA和阻断ELISA筛选抗苯巴比妥单克隆抗体(PB mAb)杂交瘤细胞株，体内诱生腹水法生产PB mAb，应用PB mAb研制PB残留竞争ELISA(ciELISA)快速检测试剂盒(PB-Kit)，并测定其性能。结果表明，筛选出3株杂交瘤细胞，最好的3F6-C4株的PB mAb间接ELISA效价为1∶6.4×105，亲和常数(Ka)为1.96×1010 L/moL，半数抑制浓度(IC50)为5.7 μg/L，与巴比妥的交叉反应率(CR%)12.4%，与其它化合物无CR；PB-Kit的线性检测范围1.0～81 μg/L，灵敏度0.75 μg/L，检测限1 μg/L；饲料样和猪尿样的平均添加回收率85.8%和91.3%，平均批内和批间变异系数均<15%。PB-Kit具有快速、敏感、特异、简便等特点，适合PB残留快速检测的推广应用。     

庆大霉素单克隆抗体的研制及ELISA分析方法的建立

用与牛血清蛋白(BSA)交联的庆大霉素人工抗原(GM-BSA)免疫的BALB/C鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选、克隆,得到1株能稳定分泌抗庆大霉素单抗的杂交瘤细胞株(6H8),经鉴定6H8的抗体类型及亚类均为IgG1,其轻链为κ链.制备单克隆抗体腹水,腹水的间接ELISA效价在1×10-7以上.该单克隆抗体与庆大霉素结构类似物均无交叉反应,具有高度特异性.以制备的单抗建立间接竞争ELISA方法,其线性回归方程为y=16.122ln(x)-2.0143(R2=0.9934),抑制中浓度IC50为25.2μg·L-1,最低检测限IC20为3.9μg·L-1.竞争ELISA方法检测鲜奶中的庆大霉素平均回收率在92％～110％之间.抗庆大霉素单抗的制备和竞争ELISA方法的建立为庆大霉素快速检测奠定了基础.     

禽流感病毒H5亚型金标快速诊断技术方法的建立及试剂盒研制

应用纯化禽流感病毒(AIV)H5抗原免疫Balb/c小鼠,得到2株配对良好的抗AIV H5单抗;采用金标免疫层析法制备AIV H5亚型金标快速诊断试剂盒,并对试剂盒性能进行评价.实验结果表明,AIV-H5金标试剂盒与AIV H5以外其它亚型及其它禽类病毒不发生交叉反应,其灵敏度达1/27,稳定性良好:试剂盒检测人工感染AIV H5的鸡脏器组织,结果除心脏、泄殖腔拭子和喉拭子外,其余脏器均呈阳性,与鸡胚病毒分离培养结果相符;田间试验结果与荧光RT-PCR试剂盒检测符合率达100%.     

马γ-干扰素单克隆抗体的制备及其特性的鉴定

摘要：将原核表达的重组马-干扰素成熟蛋白（mEIFN-）免疫BALB/c小鼠,经4次免疫后,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,以昆虫杆状病毒表达系统获得的重组马-干扰素作为检测抗原进行间接ELISA检测,共筛选到15个阳性细胞株。分别经过3轮亚克隆后,最终得到了12株能稳定分泌抗体的单细胞克隆株。利用间接免疫荧光（IFA）实验对12株单克隆抗体进行鉴定,结果证实所获得的12株细胞分泌的抗体均为针对马-干扰素的特异性抗体。单克隆抗体亚型鉴定结果显示,4株为IgG1、2株为IgG2a、3株为IgG2b、3株为IgM,而且所有单克隆抗体的轻链均为链。将此12株单克隆抗体分别与用原核系统分节段表达的重组马-干扰素GST-mEIFN-(1-84)、GST-mEIFN-(80-146)蛋白进行特异性ELISA检测,结果表明有7株单克隆抗体识别GST-mEIFN-(1-84),而另5株单克隆抗体与GST-mEIFN-(80-146)发生反应,说明所获得的12株单克隆抗体至少针对两个或两个以上不同的抗原表位。这将为今后建立马-干扰素检测方法、监测机体免疫状态和研究机体免疫机制奠定了基础。     

水牛γ-干扰素单克隆抗体的制备及其特性分析

将原核表达的重组水牛(Bubalus bubalis)γ-干扰素成熟蛋(rGST-WBIFN-γ)以100 μg/只剂量免疫8周龄Balb/c小鼠(Mus musculus),经5次免疫后,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,以rHIS-WB-IFN-γ和rGST-WBIFN-γ蛋白共同作为检测抗原进行间接ELISA检测,筛选并最终得到了2株能稳定分泌抗体的单细胞克隆株(分别命名为IE4和4A11),分泌抗体亚型均为IgG1型,轻链均为κ链.Western-blotting检测显示:2株单克隆抗体与原核表达的rWBIFN-γ蛋白均能特异性结合,具有良好的免疫反应原性.     

马白细胞介素-18单克隆抗体的制备及其特性的初步鉴定

摘要：利用纯化的用原核系统表达的重组马白细胞介素-18成熟蛋白(pET-mEIL-18)抗原免疫BALB/c 小鼠，取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，同时以昆虫杆状病毒表达系统获得的马白细胞介素-18成熟蛋白(mEIL-18)作为抗原进行间接ELISA检测，筛选并最终得到了9株能稳定分泌抗体的单细胞克隆株。利用IFA试验对9株单克隆抗体进行鉴定，结果证实所获得的9株细胞分泌的抗体都是针对mEIL-18的特异性抗体。将此9株单克隆抗体分别与用原核系统分段表达的重组马白细胞介素-18成熟蛋白pET-mEIL-18-(1)(mEIL-18 1～78位氨基酸残基)和pET-mEIL-18-(2)(mEIL-18 79～157位氨基酸残基)蛋白进行特异性ELISA检测，结果表明，9株单克隆抗体有5株识别表达的pET-mEIL-18-(1)(mEIL-18 1～78位氨基酸残基)，而另外4株单克隆抗体与pET-mEIL-18-(2)(mEIL-18 79～157位氨基酸残基)发生反应，说明所获得的9株单克隆抗体至少针对pET-mEIL-18 2个或2个以上不同的抗原表位。单克隆抗体亚型鉴定试剂盒的鉴定结果显示，除M1F11、M3A11和N7D9为IgM，其余的单克隆抗体均为IgG1，而且所有单克隆抗体的轻链均为?资链。     

鉴别牛病毒性腹泻病毒基因型单克隆抗体的制备及其特性

为制备可以区分牛病毒性腹泻1型病毒(BVDV1)和2型病毒(BVDV2)的单克隆抗体,利用纯化的BVDV1和BVDV2为抗原免疫BALB/c小鼠(Mus musculus),取脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,同时以BVDV1和BVDV2病毒作为包被抗原进行间接BVDV1-ELISA和BVDV2-ELISA检测,获得了3株单克隆抗体,其中1株是针对BVDV1的特异性抗体命名为BV1,另外1株是针对BVDV2的特异性抗体命名为BV2,第3株与BVDV1和BVDV2病毒都反应命名为BV12.交叉实验表明,3株单抗中仅有BV12与猪瘟病毒(Hog chorera virus,HCV)反应.BV1、BV2和BV12单抗腹水效价分别为106、107和106,均具有中和活性,中和效价最高达1:524288,分别属于鼠IgG1、IgG2a和IgG2a亚类,轻链均为κ链.3株杂交瘤细胞的染色体数目分别为102、99和100条.本研究获得3株单克隆抗体可以区分BVDV1和BVDV2的杂交瘤细胞.     

毒死蜱单克隆抗体的制备及鉴定

本文合成毒死蜱的半抗原并对其进行结构鉴定,将半抗原与牛血清白蛋白和鸡卵清蛋白共价偶联分别制备免疫原和包被原,再取已免疫的Balb/c小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,建立2株分泌毒死蜱单克隆抗体的杂交瘤细胞。以琼脂双扩散法鉴定抗体亚类类型,间接竞争ELISA方法测定了抗体对毒死蜱的灵敏度、特异性和亲和性。结果表明该抗体分泌IgG1亚类的单克隆抗体,且与毒死蜱的亲和性较高(1.5×107 L / mol),与其他结构类似物的交叉反应均小于1%。本研究成功制备了毒死蜱特异性的单克隆抗体,为今后ELISA方法的建立提供了条件。     

小反刍兽疫N蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA方法的建立

小反刍兽疫(PPR)是由小反刍兽疫病毒(PPRV)引起的一种危害严重的急性接触性传染病。为了检测血清中存在的抗PPRV的抗体,本研究利用纯化后的真核表达的PPRVN蛋白重组蛋白(rBacmid-PPRN)作为免疫原免疫BALB/c小鼠(Mus musculus),并使用原核表达的PPRVN蛋白重组蛋白(rpET-PPRN)作为间接ELISA检测抗原,共筛选得到8株抗PPRVN蛋白的单克隆抗体(mAb)。其中1D5单抗腹水效价达1∶106,分泌单抗亚类为IgG2b。以1D5作为竞争抗体、纯化后的rpET-PPRN蛋白作为包被抗原,建立了检测小反刍兽疫血清抗体的单抗竞争性ELISA(c-ELISA)方法。所建立的c-ELISA方法能够特异性的区分牛瘟阳性血清和小反刍兽疫阳性血清,并具有较高的灵敏度和特异性。应用建立c-ELISA检测方法检测共129份山羊(Capra hircus)血清样品,与标准c-ELISA试剂盒的符合率为96.9%。本研究成功地建立了可特异性检测动物血清中抗PPRV抗体的竞争性ELISA方法,对小反刍兽疫的诊断、疫苗免疫水平的监控及控制其流行具有重要意义。     

检测多杀性巴氏杆菌毒素抗体的单抗竞争ELISA方法的建立

本研究以纯化的多杀性巴氏杆菌毒素基因片段的原核表达产物作为抗原免疫小鼠制备单抗,并利用表达蛋白和多杀性巴氏杆菌毒素单抗酶结合物建立了竞争ELISA方法检测多杀性巴氏杆菌毒素抗体。经过研究确定抗原包被浓度为223ng／mL,待检血清最佳稀释度为1：2,酶标单抗工作浓度为1：3200,血清抑制率大于50%为阳性。应用单抗竞争ELISA和细胞毒性中和试验同时对82份血清进行猪多杀性巴氏杆菌毒素抗体检测,竞争ELISA的检出率为40.2％,细胞毒性中和试验检出率为36.6％,两者符合率达91.5％。试验结果表明,该ELISA方法特异性强,敏感性高,稳定性和重复性好,操作简便。本方法的建立在实验室诊断的标准化、猪群萎缩性鼻炎疫苗免疫效果的评价及流行病学调查方面具有应用价值。     

甜瓜细菌性叶枯病菌胶体金ICA检测试纸条的研发与应用

甜瓜(Cucumis melo)作物上会存在甜瓜细菌性叶枯病菌(Pseudomonas syringae pv.lachrymas)和瓜类细菌性果斑病菌(Acidovorax citrulli)两种细菌病害,二者混合发生,症状极其相似,不易区分.为了快速、准确地在田间检测区分出两种病害,本研究利用甜瓜细菌性叶枯病菌单克隆抗体制备了免疫层析试纸条,并建立一种快速、简便地现场检测甜瓜细菌性叶枯病菌的胶体金免疫层析分析方法(immunochromatography assay, ICA).在定性检测中,本方法对甜瓜细菌性叶枯病菌的定性检测限为2.5×103cfu/mL,与细菌性果斑病菌不存在交叉反应,具有很强的特异性.在半定量检测中,甜瓜细菌性叶枯病菌在2.5× 103～1×105 cfu/mL浓度范围内,T线和C线读数的比值与甜瓜细菌性叶枯病菌浓度的对数值呈显著的线性关系,线性方程=0.392 2x-1.263 8,相关系数R2达到0.988 1.因此,本研究制备的快速、简便、经济的高特异性甜瓜细菌性叶枯病菌ICA是一种非常实用的检测方法,不仅可以在田间实时原地快速检测甜瓜细菌性叶枯病菌,同时还能与瓜类细菌性果斑病菌进行有效区分,为甜瓜等瓜类种植业的发展带来很大帮助.