影响水牛胎儿成纤维细胞转染效率的因素

实验对电穿孔法和阳离子脂质体法转染水牛胎儿成纤维细胞的条件进行了系统摸索,获得了较好的DNA转染参数。电穿孔法转染时脉冲时间为15ms,电场强度为40～50V/m时,细胞的死亡率处于20%～50%之间,比较适合外源DNA转入水牛胎儿成纤维细胞。将脂质体与DNA的比例控制在8μL:2μg,可获得较高的转染率。相同培养条件下,脂质体法比电穿孔能获得更多的转基因抗性细胞集落,转染DNA的纯度和细胞的状态也明显影响脂质体法的转染效率。     

3种介导猪NR2F2基因转染PK15细胞方法的比较研究

试验旨在研究3种转染方法对猪肾上皮细胞(PK15)的转染效率,为以PK15细胞为模型研究外源基因的功能提供参考。本研究以PK15细胞为研究对象,用脂质体、电穿孔、慢病毒3种转染方法转染后,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,采用实时荧光定量PCR检测EGFP和NR2F2基因的表达情况,采用CCK-8检测细胞存活率,进而比较3种方法的转染效果。结果显示,转染PK15细胞后,电穿孔和慢病毒方法转染效率极显著高于脂质体(P0.01),但电穿孔方法和慢病毒方法之间差异不显著(P0.05);EGFP和NR2F2基因的实时荧光定量PCR结果显示慢病毒方法效果最好,脂质体方法较差,与细胞转染效率基本一致;CCK-8结果显示,电穿孔转染后细胞存活率最低,极显著低于对照组(P0.01),脂质体方法显著低于对照组(P0.05),慢病毒方法与对照组间差异不显著(P0.05)。综合考虑转染效率及细胞活性,本研究认为慢病毒转染方法最适合转染PK15细胞,为今后高效转染PK15细胞提供了理想的方法。     

3种介导猪NR2F2基因转染PK15细胞方法的比较研究

试验旨在研究3种转染方法对猪肾上皮细胞（PK15）的转染效率，为以PK15细胞为模型研究外源基因的功能提供参考。本研究以PK15细胞为研究对象，用脂质体、电穿孔、慢病毒3种转染方法转染后，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，采用实时荧光定量PCR检测EGFP和NR2F2基因的表达情况，采用CCK-8检测细胞存活率，进而比较3种方法的转染效果。结果显示，转染PK15细胞后，电穿孔和慢病毒方法转染效率极显著高于脂质体（P<0.01），但电穿孔方法和慢病毒方法之间差异不显著（P>0.05）；EGFP和NR2F2基因的实时荧光定量PCR结果显示慢病毒方法效果最好，脂质体方法较差，与细胞转染效率基本一致；CCK-8结果显示，电穿孔转染后细胞存活率最低，极显著低于对照组（P<0.01），脂质体方法显著低于对照组（P<0.05），慢病毒方法与对照组间差异不显著（P>0.05）。综合考虑转染效率及细胞活性，本研究认为慢病毒转染方法最适合转染PK15细胞，为今后高效转染PK15细胞提供了理想的方法。     

不同体细胞类型和基因转染方式对绵羊克隆胚胎体外发育的影响

首先获得绵羊胎儿成纤维细胞、成年耳组织成纤维细胞及前脂肪细胞,用脂质体介导法、BTX电转法及Nucleofector核转法对上述细胞系转染绿色荧光蛋白(gfp)基因,并对转染效率进行比较,最后探讨3种转gfp基因细胞对绵羊转基克隆胚发育的影响。结果:核转法的转基因效率最高,3种细胞的转基因效率分别为86%,87%和90%,显著高于BTX电转法和脂质体法基因转染效率;脂质体转染效率显著低于BTX电转效率(P<0.05)。而对同一种转染方法而言,基因转染效率在3种细胞间差异均不显著(P>0.05)。在以上述3种转基因细胞为核供体的转基因克隆试验中,胚胎融合率、卵裂率均无显著性差异(P>0.05),胎儿成纤维细胞组的囊胚率显著高于前脂肪细胞组(P<0.05),但耳组织成纤维细胞组与胎儿成纤维细胞、前脂肪细胞间差异均不显著(P>0.05)。结果表明核转法基因转染效率最高,胎儿成纤维细胞最适合于胚胎克隆研究。     

睾丸注射转基因技术研究进展

睾丸注射法将外源DNA直接注入睾丸内转染各级生精细胞,通过生精细胞的增殖分化而获得大量转基因精子,通过人工授精或自然交配生产转基因动物,是一种操作简便、成本低和适宜于大群生产的精子介导的转基因方法。本文对睾丸注射法获得转基因精子的原理以及曲精细管注射法、睾丸间质注射法和睾丸网注射法3种睾丸注射方法进行介绍,对睾丸注射制备转基因动物所应用的阳离子脂质体介导法、高分子载体介导法、二甲基亚砜(DMSO)介导法和电穿孔法、基因枪法5种转染方法进行综述,并指出了睾丸注射法存在的问题,对睾丸注射法的研究前景进行了展望。     

利用载体基因增强电介导基因传递的研究

在临床治疗中,靶基因的低转染和表达一直是基因传递中的一个重要问题。本研究提出了一种用载体基因电穿孔增强靶基因转染效率的方法。为了检测转染效率,试验用荧光基因(pGL3-control)转染HeLa细胞,用原核表达载体pCR2.1作为电介导基因传递的一个载体基因,对荧光素酶活性进行了测定。结果表明,在载体基因的作用下,荧光素酶基因成功转入细胞膜内,且有载体基因的荧光素酶活性是无载体基因的2～3倍。此外,试验还通过计算荧光素酶基因/载体基因的比值分析了其转染效率,发现两者之间无显著差异。因此,在生物学研究中,载体基因的使用有利于增强靶基因的转染和表达。     

牛输卵管上皮细胞转人胶原蛋白cDNA基因及转基因克隆胚胎

以2岁奶牛输卵管为材料,用胰酶消化法分离得到了牛输卵管上皮细胞。输卵管上皮细胞在DMEM／F12培养基中生长良好。用一代牛输卵管上皮细胞为靶细胞,对其进行了电穿孔转染,转染对象是分子大小为31085bp的以β-casein启动子为基础的含有人胶原蛋白cDNA基因和EGFP、Neor双标记基因的质粒。电穿孔试验发现,牛输卵管上皮细胞在低渗缓冲液中电转染可以获得阳性转染子,其中以90mOsm／kg为最佳。电压以800V为好,电压高和低都不利于电穿孔的成功。成功转染的细胞用800mg/L G418进行筛选,在10d后获得了较大的阳性细胞克隆簇。对获得的阳性细胞克隆簇进行扩大后,得到了较纯的阳性细胞克隆系,流式细胞仪检测其纯度为81．6％。在荧光显微镜下选择阳性细胞作为核移植供体细胞进行了转基因克隆试验,结果显示以转基因和非转基因细胞为核供体获得的重构胚融合率差异显著（51．9％比63．2％）,获得的桑椹胚／囊胚率差异不显著（20．3％比25．5％）。对获得的具有绿色荧光的胚胎进行DNA分析,结果显示这些胚胎成功转入了外源基因,并且转入的外源基因结构完整。     

电穿孔法转染水牛脂肪干细胞与成纤维细胞的研究

本研究以不同培养代数(P)水牛脂肪干细胞(buffalo adipose-derived stem cells,BASC)和成纤维细胞(buffalo fetal fibroblasts,BFFs)为研究对象,采用电穿孔法对其进行转染,比较转染后细胞的相对存活率和转染效率,为生产高效转基因供体细胞奠定基础。以绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,电转染48 h后观察荧光表达,收集细胞采用血细胞计数法和流式细胞仪分析细胞相对存活率和转染效率。结果表明:电转后的BASC和BFF表达EGFP,BASC相对存活率低于BFF,P10之前BFF存活率更稳定;BASC和BFF转染效率随培养代数增加出现不同程度的降低,P10之前BFF转染效率更稳定。电转技术可用于转染BASC和BFF,并获得较高的转染效率;使用体外培养早期代数的BASC(P8之前)和BFF(P10之前)可以获得更稳定转染效率的转基因细胞。     

鸡胚精原细胞体外转染EGFP方法的比较

以增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein,EGFP）为报告基因体外转染鸡胚胎精原细胞（Chicken embryonic spermatogonial cells,CESCs）,比较磷酸钙、脂质体（梭华-Sofast）、电穿孔3种方法转染EGFP的效率,以获得高效的体外转染方法。本研究分离孵化16d的鸡胚睾丸,获取CESCs,体外培养和传代扩增,传至第2代后进行碱性磷酸酶（AKP）活性和阶段特异性表面抗原-1（Stage specific embryonic antigen-1,SSEA-1）免疫荧光鉴定。运用磷酸钙、脂质体（梭华-Sofast）、电穿孔3种方法体外转染第2代CESCs,荧光细胞计数法分析转染效率。结果表明：与磷酸钙法、脂质体法相比,电穿孔法可获得更高的细胞成活率和转染率（68％ vs 39％、65％,19．70％ vs 2．92％、9．73％）,差异显著（P〈0．05）。因此得出,电穿孔法是将外源基因导入鸡胚精原细胞的适宜方法。     

脂质体法转染山羊骨骼肌特异细胞条件的优化

试验旨在通过脂质体转染法检测pIMAU-EGFP载体在山羊骨骼肌细胞中的表达情况,并探索其最佳的转染条件。在构建的适合携带外源基因的山羊骨骼肌特异表达载体pIMAU-EGFP基础上,以绿色荧光蛋白为报告基因,采用脂质体转染法检测了pIMAU-EGFP载体在山羊骨骼肌细胞中的表达,并对转染条件进行了摸索。试验结果表明,成功把测序验证正确的pIMAU-EGFP载体转染到山羊骨骼肌细胞中,筛选的最佳转染条件:脂质体与质粒的最佳比例为1：2,质粒浓度为3.5 μg/μL,细胞密度不低于80%,以转染24~36 h观察记录转染效率为宜。本试验初步建立了转染山羊骨骼肌细胞的方法,绿色荧光蛋白可作为报告基因优化脂质体转染条件,这将为快速和规模化筛选山羊肉质特性相关基因提供新思路和研究方法。     

二甲双胍对牛骨骼肌卫星细胞增殖与分化的影响

为探究二甲双胍对牛骨骼肌卫星细胞增殖和分化的影响，本研究将体外培养的牛骨骼肌卫星细胞分别用0（对照组）、1、2、4 mmol/L二甲双胍进行处理，采用CCK-8法筛选出二甲双胍作用于牛骨骼肌卫星细胞的最适浓度，接着通过EdU染色法检测二甲双胍处理牛骨骼肌卫星细胞后对其增殖的影响，然后对二甲双胍处理的牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化，通过显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞分化时期的细胞状态，然后利用Western blotting技术检测牛骨骼肌卫星细胞的分化标志因子肌球蛋白重链（MyHC）、肌细胞生成素（MyoG）在分化24、48和72 h的表达情况。结果表明，二甲双胍作用于牛骨骼肌卫星细胞的最适浓度为2 mmol/L。2 mmol/L二甲双胍处理牛骨骼肌卫星细胞后，其细胞增殖率显著降低（P<0.05），说明二甲双胍可以抑制牛骨骼肌卫星细胞的增殖；牛骨骼肌卫星细胞诱导分化后形成的肌管数量和直径均呈现减少趋势，牛骨骼肌卫星细胞成肌分化标志因子MyHC、MyoG在分化24、48和72 h的表达均显著低于0 mmol/L （对照）组（P<0.05），说明2 mmol/L二甲双胍能够抑制牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。研究结果表明，二甲双胍可以显著抑制牛骨骼肌卫星细胞的增殖及成肌分化过程。该研究为二甲双胍在肌肉发育调控及肌损伤修复方面的应用提供一定的理论依据。     

Effect of Basic Fibroblast Growth Factor on the Proliferation of Bovine Skeletal Muscle Satellite Cells

To investigate the effect of basic fibroblast growth factor (bFGF) on the proliferation of bovine skeletal muscle satellite cells,bovine skeletal muscle satellite cells were isolated and cultured in the medium with bFGF,the growth and differentiation state of muscle satellite cells were observed,and the growth curve and EDU cell proliferation assay were conducted.The results showed that cell morphology of bovine skeletal muscle satellite cells cultured in medium containing bFGF was better and proliferation rate was significantly higher than that in control group (P<0.05).The results indicated that bFGF could promote proliferation of bovine skeletal muscle satellite cells efficiently in growth medium and differential medium.Our study established an efficient method to culture bovine skeletal muscle satellite cells,which could provide reference for studying and using of skeletal muscle satellite cells.     

碱性成纤维细胞生长因子对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响

为研究碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响,试验对牛骨骼肌卫星细胞进行体外分离培养,在生长培养基和分化培养基中分别添加bFGF,观察细胞生长及分化情况,绘制细胞生长曲线,并进行EDU细胞增殖检测试验。结果显示,添加了bFGF培养基的细胞生长状态较对照组良好,细胞增殖速度快,细胞增殖率显著高于对照组(P<0.05),说明bFGF对牛骨骼肌卫星细胞在生长培养基和分化培养基中增殖都具有良好的促进作用。本研究建立了一种高效的牛骨骼肌卫星细胞培养方案,为骨骼肌卫星细胞的研究利用提供参考。     

长链非编码RNA(H19)在小鼠骨骼肌生长发育过程中的表达

本试验旨在研究长链非编码RNA(H19)在骨骼肌发育和损伤修复过程中表达量的变化,为研究H19在小鼠骨骼肌发育中的作用机制奠定基础。以C2C12细胞系和ICR小鼠为试验素材,通过生物信息学方法分析H19的非编码特性和在物种间的低保守性,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测H19在C2C12细胞分化,ICR小鼠骨骼肌发育不同时期和成体小鼠骨骼肌损伤修复过程中表达量的动态变化。结果表明,H19在小鼠骨骼肌中的表达量随出生后日龄的增长逐渐下降;在诱导C2C12细胞分化过程中,H19的表达量先是逐渐升高,进而在较高水平维持不变;在肌肉损伤模型中修复的第4~6天,H19的表达量维持在较高水平。鉴于上述H19在C2C12细胞分化和肌损伤修复过程中的表达特点,推断H19可能具有促进肌纤维形成和成体骨骼肌损伤后修复的功能。     

The Expression of Long Noncoding RNA (H19) in Mouse Skeletal Muscle Development

This experiment was intend to study the changes of long non-coding RNA (H19) expression levels in skeletal muscle development and regeneration,and lay the foundation of its mechanism reach in skeletal muscle development.C2C12 cell line and ICR mice were used as experimental material,bioinformatics assay was used to exploit its non-coding character and low conservatism in different species,and the expressions of H19 in C2C12 cell differentiation,skeletal muscle development and the phase of muscle regeneration were detected by quantitative Real-time PCR (qRT-PCR).The results showed that,H19 expression levels in postnatal mouse skeletal muscle decreased with increasing age;during C2C12 cell differentiation,H19 mRNA increased gradually,and then maintained a high level;The expression of H19 was maintained at a high level through days 4 to 6 after injury.In consideration of its express character in C2C12 cell differentiation and skeletal muscle damage repair model,H19 may play an important role in promoting myogenesis and skeletal muscle regeneration.     

骨骼肌卫星细胞的研究进展

目前已证实骨骼肌是具有多向分化潜能的成体干细胞的一个储存库。研究者认为骨骼肌中至少有两种干细胞:肌肉卫星细胞(muscle satellite cells)和肌源干细胞(muscle-derived stem cells),由于骨骼肌卫星细胞占了绝大部分,因此肌肉干细胞主要指骨骼肌卫星细胞。作者主要对肌肉卫星细胞的分离、培养、纯化、鉴定及影响其增殖与分化的机制做了简要概述。     

表观遗传修饰在骨骼肌细胞增殖分化过程中的研究进展

骨骼肌是肌肉的主要构成部分，骨骼肌细胞发生增殖和分化的过程都是肌肉发育的基础，直接影响着家养动物的产肉性能。研究发现表观遗传修饰作用对骨骼肌细胞增殖分化具有重要的调控作用，表明该遗传修饰作用对家养动物肌肉发育具有重大的意义。作者从DNA甲基化对骨骼肌细胞增殖分化影响、组蛋白乙酰化所含因子调控基因选择表达作用、非编码RNA调控和染色体重塑作用所起的影响等方面分别介绍了表观遗传在骨骼肌细胞增殖分化过程中的研究进展，简述了不同修饰方式和不同作用因子对骨骼肌增殖和分化两个过程的影响。同时也回顾了前人在研究骨骼肌增殖分化过程所用到的方法和手段，进而分析了表观调控作用因子在骨骼肌生长过程中所起到的作用。旨在进一步阐述表观遗传修饰在骨骼肌增殖和分化过程中所起到的重要作用，增强对骨骼肌增殖分化调控过程的了解，为和动物生产实际相结合提供参考途径，同时也为骨骼肌生长发育等分子调控提供更多参考素材。     

Research Progress of Epigenetics Modification in the Process of Skeletal Muscle Cell Proliferation and Differentiation

Skeletal muscle is the most abundant tissue and the main component of muscle in animals.The process of skeletal muscle cell's proliferation and differentiation is the basis of muscle development and it's directly affects the meat production performance of domestic animals.It has been found that epigenetic modification plays an important role in regulating the proliferation and differentiation of skeletal muscle cells.In this study,the effects of epigenetics on skeletal muscle in terms of the effects of DNA methylation on the proliferation and differentiation of skeletal muscle cells,the selection and expression of factors regulated by histone acetylation,the regulation of non-coding RNA,and the effects of chromosome remodeling.Research progress in the process of muscle cell proliferation and differentiation,briefly describes the effects of different modification methods and factors on the two processes of skeletal muscle proliferation and differentiation.At the same time,the methods and means used by predecessor in the study of skeletal muscle proliferation and differentiation were reviewed,and then the role of apparent regulatory factors in skeletal muscle growth was analyzed.The purpose was to further explain the important role of epigenetic modification in the proliferation and differentiation of skeletal muscle,enhanced the understanding of the regulation of skeletal muscle proliferation and differentiation,provided a reference path for integration with animal production,and also provided skeletal muscle.Molecular regulation of such as growth and development provided more reference materials.     

干扰MSTN对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

为研究肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响,本试验以牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型为对象,以前期设计合成3个干扰RNA（si-MSTN-1、si-MSTN-2、si-MSTN-3）并对其进行干扰效果筛选为基础,将干扰效果极显著的si-MSTN-2（si-MSTN）转染牛骨骼肌卫星细胞,通过EdU染色法检测干扰MSTN对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响;进一步对干扰MSTN的牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,通过肌管形成状态和分化标志因子综合分析干扰MSTN对牛骨骼肌卫星细胞分化的影响：首先通过显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞分化时期的肌管形成状态,然后利用实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测牛骨骼肌卫星细胞分化标志因子MyoG和MyHC在mRNA和蛋白水平的表达情况。结果显示,干扰MSTN后,牛骨骼肌卫星细胞中EdU阳性细胞率极显著增加（P < 0.01）,说明下调MSTN表达极显著促进了牛骨骼肌卫星细胞的增殖;牛骨骼肌卫星细胞诱导分化后形成的肌管数量和直径均呈现增大趋势,牛骨骼肌卫星细胞成肌分化标志因子MyHC在mRNA和蛋白水平的表达均极显著高于对照组（P < 0.01）,说明下调MSTN表达能够促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。本研究结果表明,干扰MSTN可以显著促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖及成肌分化过程。本试验结果为进一步开展MSTN对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的调控机制研究提供了参考。     

一日龄大通牦牛和平原黄牛骨骼肌显微结构的比较

为了探讨1日龄大通牦牛骨骼肌组织学特点及对低氧的适应,以平原黄牛为对照,利用光镜和计算机图像分析系统测定骨骼肌肌纤维直径、表面积密度;通过透射电镜比较骨骼肌线粒体的面数密度、面积密度、体积密度、平均体积等结构参数。结果显示,1日龄大通牦牛骨骼肌肌纤维直径显著细于1日龄平原黄牛,表面积密度明显大于平原黄牛,差异极显著(P<0.01);1日龄大通牦牛骨骼肌细胞中线粒体平均体积小于1日龄平原黄牛,并具有极显著差异(P<0.01);而1日龄大通牦牛骨骼肌细胞中线粒体体积密度、面积密度、面数密度均大于1日龄平原黄牛,且差异极显著(P<0.01)。以上结果表明,大通牦牛通过增加骨骼肌线粒体面数密度、面积密度、体积密度,降低线粒体平均体积来提高其在低氧环境中对氧的利用,并且在长期进化中形成了肌纤维直径小,表面积密度大的组织学特点。