海南油茶AFLP体系的建立及优化

该文以海南油茶DNA为材料,对AFLP反应体系中的油茶基因组DNA用量、酶切连接反应时间、酶切连接液稀释倍数、预扩增反应产物稀释倍数、Mg2+浓度等5个因素进行优化。结果表明:Eco RI和Mse I酶切连接反应14h需基因组DNA用量为400ng,预扩增反应过程酶切连接液稀释倍数10倍,选择扩增中预扩增产物稀释倍数40倍,两次扩增选用Mg2+浓度均为2.0mmol/L。采用该技术体系得到的AFLP指纹式样清晰,适宜用作海南油茶品种鉴别和遗传多样性分析。     

人心果品种资源亲缘关系的AFLP分析

利用荧光AFLP分子标记技术对27个人心果品种(类型)及4个蔓妹人心果品种资源的亲缘关系进行研究.9对引物(Pst Ⅰ-Mse Ⅰ)共扩增得到1131条带(75～500 bp),其中多态性带1096条(96.90%).28个品种(类型)具特征性条带,特征带大小为350～500 bp.品种间多态性比例在22.19%～45.89%之间,遗传相似性系数为0.40～0.87.UPGMA聚类结果将31个品种聚为蔓妹人心果类群(MAM)和2个人心果类群(SAP1和SAP2).在遗传相似性系数0.52处,4个蔓妹人心果品种首先被区分开,单独聚为一类(MAM).人心果类群中,11个美国品种和10个国内地方类型在相似性系数0.66处聚为一大组(C、D组),相互之间表现出较近的亲缘关系.大部分栽培品种聚于D-2亚组,与地方类型有一定的遗传距离,说明栽培种的亲缘关系较为相近.人心果表型标记与分子标记结果间存在一定差异,二者的相关性不高.     

桉树AFLP标记反应体系的建立

为获得桉树种质鉴定、辅助育种所需稳定的分子标记,本研究以生产中常用的24个桉树无性系基因组DNA为材料,对AFLP的反应体系和参数进行优化,发现高纯度的模板最低用量为100 ng;EcoRⅠ、MseⅠ用量不低于0.5 U;酶切连接时间需要大于4 h,但不多于14 h。预扩增获得50～700 bp产物;该产物稀释5倍后用于选择性扩增。聚丙烯酰胺胶电泳检测温度以20℃为佳。     

刺槐AFLP分析体系的建立与优化

以10份刺槐种质资源为试材,通过对影响AFLP反应体系关键因素的优化,建立了刺槐AFLP分析的反应体系,即15ng/μL模板DNA在37℃下双酶切(MseI、EcoRI各0.15U/μL)2h,0.075U/μL T4DNA连接酶连接12h,连接产物、预扩增产物稀释10倍后扩增效果最佳。并利用该体系筛选出引物E+3/M+3,构建了刺槐种质资源的AFLP指纹图谱。     

构树ISSR反应体系的优化与建立

利用正交试验对Taq酶浓度、引物浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度和模板DNA浓度5个因素进行优化,从而建立了一套适宜构树的ISSR-PCR反应体系.在20 μL的反应体系中,各反应物的最适宜含量为:0.07 U·μL-1 TaqDNA聚合酶、0.35 μmol·L-1ISSR引物、0.3 mmol·L-dNTPs,2.0 mmol·L-Mg2+、1.2 ng· μL-1模板DNA.PCR扩增程序为:94℃预变性5min,94℃变性30 s,46℃退火45 s,72℃延伸2 min,40个循环.     

枣叶片DNA的提取以及AFLP反应体系的建立

扩增片断长度多态性(AFLP)实验过程中,DNA提取质量和适合的PCR扩增反应体系是2个关键因素.利用CTAB法对枣树叶片DNA的提取方法进行探讨.结果表明:改良CTAB法抽提到了较高质量的枣基因组DNA,可用于AFLP实验分析;通过对酶切-连接体系和PCR扩增体系中的关键因素实验分析,建立了适合枣AFLP荧光反应体系,并得到清晰的DNA指纹图谱.     

杉木 SRAP-PCR 反应体系优化与建立

采用L16（45）正交实验设计,对杉木SRAP-PCR反应体系中Mg^2＋、 dNTPs、 Taq DNA聚合酶用量、引物浓度及模板DNA用量等5个因素进行了优化,并确立了适宜杉木的最佳SRAP-PCR反应体系。杉木的SRAP-PCR最佳反应体系为：反应体系总体积为25μL,含2.0 mmol／L Mg^2＋、0.3 mmol／L dNTPs 、0.3μmol／L引物,1.0 U Taq DNA聚合酶、50 ng模板DNA及1×PCR buffer。各因素对杉木基因组DNA SRAP-PCR扩增结果的影响程度不同,其中dNTPs浓度影响最大, Mg^2＋浓度的影响最小。运用杉木单株基因组DNA对优化SRAP-PCR反应体系进行验证,均获得多态性丰富、条带清晰的扩增图谱,表明所确立的杉木SRAP-PCR反应体系稳定可靠。     

闽楠、红楠AFLP反应体系建立

以闽楠、红楠总基因组DNA为模板,对AFLP分析各环节的条件进行了优化和筛选,建立了适合于闽楠、红楠AFLP分析的最佳反应体系.其中:酶切反应条件为在20μL反应体系中,加入模板DNA 150 ng,Buffer22μL,BSA 0.2μL,EcoRI 3U,Msel 2U,37℃酶切4 h,65℃变性10 min,4℃保存;连接反应条件为将酶切产物中加入5μL连接体系(包括T4 Buffer 2.5μL,EcoRI接头5 pmol,MseI接头50 pmol,T4连接酶1U),16℃连接过夜.预扩增反应条件为在20μL体系中,加入稀释25倍的连接产物5μL,Mg2+(25 mM/L)1.6μL,dNTP(2 mM/L)2 μL,预扩增引物E00、M00各30 ng,Taq酶1U.选择性扩增反应条件为:在20μL体系中,加入稀释100倍的预扩增产物5μL,Mg2+ 1.2μL,dNTP 2μL,选择性扩增引物(E+3/M+3)60 ng,Taq酶1U.本实验结果为闽楠、红楠AFLP分析打下了良好的实验基础.     

红松SRAP-PCR反应体系的优化

通过单因素试验,对红松SRAP—PCR反应体系的主要影响因子（Taq DNA聚合酶、Mg^2＋、模板DNA、dNTPs、引物浓度）进行了优化筛选,得出红松SRAP—PCR反应的最佳体系：20μL反应体系中,模板90ng,Mg^2＋1．0mmol／L,dNTPs0．15mmol／L,Taq DNA聚合酶1．5 U,引物0．3～0．4μmol／L。     

樟树ISSR-PCR反应体系优化研究

以樟树基因组DNA为材料,分析了影响樟树ISSR-PCR的主要参数,确立了适用于樟树的ISSR反应体系和扩增条件。结果表明获得清晰、重复性高的樟树ISSR-PCR扩增条件为:20μL PCR反应体积中,1×PCR Buffer(10 mmol.L-1Tris.HCl,pH8.3,50 mmo.lL-1KCl),2.0 mmo.lL-1MgCl2,200μmol.L-1dNTPs,50 ng模板DNA,200 nmo.lL-1引物,0.5 UTaq DNA聚合酶。在扩增过程中,引物的适宜退火温度比其Tm值平均高3℃。这为今后利用ISSR标记技术开展樟树种间遗传多样性分析提供参考。     

人心果原生质体分离初探

以人心果幼嫩叶片组织为材料,研究了酶液组合、酶解时间、酶液中甘露醇含量、pH值、温度等因素对其原生质体分离的影响,结果表明:以3%纤维素酶R-10+0.4%果胶酶Y-23为混合酶液,0.6 mol.L-1甘露醇为渗透压稳定剂,pH 5.6的酶液组合,在28℃的黑暗条件下振荡,酶解时间2 h,分离出的原生质体产量最佳,可达到12.4×106个.g-1。     

人心果高压苗和嫁接苗繁育技术

人心果是一种具有广泛用途的珍稀热带、亚热带果树.但由于其树体富含胶液,苗木繁育较为困难.通过对人心果高压苗、嫁接苗繁育技术深入细致地研究,总结出了一套比较成熟的人心果苗木快繁技术方案,详细阐述了高压苗繁育技术中高压时期的选取、枝条的选择、压条方法、高压苗的假植与管理,嫁接苗繁育技术中砧木苗的培育、嫁接时间、接穗的采集与处理、嫁接方法及注意事项、嫁接苗的管理等,对开发利用人心果这一珍稀果树资源和促进我国人心果产业发展具有重要意义.     

人心果细胞悬浮培养的初步研究

对人心果愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养结果表明,人心果愈伤组织诱导培养基为MS 6-BA0．2mg／L NAA0．1mg／L 2.4-D1．0mg／L PVP3．0g／L;继代培养基为MS 6-BA0．5mg／L NAA0．1mg／Lt 2.4-D1．0mg／L PVP3．0g／L。最佳的细胞悬浮培养基为MS 6-BA0．2～0．5mg／L NAA0．1mg／L 2．4-D0．5～1.00mg／L 蔗糖30g／L。培养液体积为40mL时,以4～6mL的接种量为宜。悬浮细胞在生长前期,pH下降较明显,而在细胞对数生长期,pH变化不明显。此项研究为进一步选育高产人心果胶细胞株打下了良好的基础。     

美国佛罗里达州人心果考察报告

美国佛罗里达州是人心果的适生区,主要分布在迈阿密戴德县(Miama-Dade)境内,栽培面积不大,但商品化、产业化程度较高,已成为佛罗里达州颇具特色的小水果。以佛罗里达大学热带作物研究与教育中心(TREC)为代表的科研机构在人心果品种资源收集、优良品种培育、栽培管理及产品贮藏保鲜等方面做了大量研究工作。其生产与科研经验对于我国人心果产业发展具有重要的借鉴和参考意义。     

人心果成熟胚离体培养及愈伤组织诱导

对越南人心果的成熟种胚进行离体培养诱导无菌苗．最佳培养基是MS,最佳激素配比是NAA0．2mg／L BA5．0mg／L。再以无菌苗的茎为外植体进行不定芽的诱导试验,其结果表明．不定芽诱导的最佳培养基及其激素配比为MS NAA0．2mg／L 2．4-D5．0mg／L．最佳环境条件是光照13h／d．光强2000lx．温度30℃。而以无菌苗的幼叶为外植体进行愈伤组织诱导和继代培养的最佳培养基为MS 6-BA2．5mg／L 2．4-D1．0mg／L 1AA0．5mg／L。在继代培养过程中,5mg／L或10mg／L的AgNO3和2000mg／L PVP可抑制愈伤组织褐变。     

南宁市人心果梢部主要刺吸害虫的初步研究

广西南宁市郊区及人心果引种基地调查研究结果表明,南宁市人心果梢部刺吸害虫有同翅目、半翅目、缨翅目,共3目17 科29种,其中以同翅目为最多,有13科21种。主要的梢部刺吸害虫种类有褐软蜡蚧、红蜡蚧和垫囊绿绵蜡蚧。幼树比成年树被害严重。     

木麻黄AFLP分析体系的建立及引物筛选

采用CTAB法改良技术提取木麻黄基因组DNA,在提取液中加入2%β-巯基乙醇防氧化和2%的PVP去除酚类等物质,获得高质量的基因组DNA,以满足AFLP对模板DNA高质量的要求;采用分步酶切和连接后,进行预扩和选扩,摸索建立和优化了木麻黄AFLP分析体系,探讨了木麻黄AFLP分析的影响因素;从64对AFLP核心引物组中筛选出了8对适合木麻黄分析的引物组合.同时探讨了AFLP技术在木麻黄研究领域的应用前景.     

刺五加AFLP分子标记技术体系的建立

用改良的的试剂盒法提取刺五加叶片的基因组DNA,可以获得高质量的刺五加基因组DNA,DNA降解较少、污染低、电泳条带清晰,可以用于PCR扩增反应,可以被内切酶EcoRⅠ和MseI彻底消化。通过优化酶切反应、引物连接、预扩增、选择扩增,建立了优化的刺五加AFLP分析技术体系,从64对引物中筛选到5对高效扩增引物,并利用这5对引物在6个刺五加种源中获得了89个多态性AFLP分子标记。建立了利用红外荧光检测技术和Li-Cor4300DNA分析系统,进行刺五加AFLP分析的分子标记技术。