卷叶贝母愈伤组织超低温保存关键技术研究

[目的]建立一套完整、快速和经济的卷叶贝母超低温保存关键技术。[方法]对卷叶贝母愈伤组织超低温保存技术中的预培养时间、保护剂类型和解冻方式进行了研究。[结果]预培养时间、冷冻保护剂类型和解冻方式均是影响卷叶贝母愈伤组织冷冻保存过程中的关键因素。经预培养9 d、由10%二甲基亚砜和0.5 mol/L山梨醇组合的复合冷冻保护剂冷冻、在40℃水浴条件下解冻的卷叶贝母愈伤组织其保存效果最佳,保存后细胞的存活率可达87.39%。[结论]为更好地保护卷叶贝母种质资源提供了参考。     

红松胚性愈伤组织的超低温保存技术

本文初步研究报道了红松胚性愈伤组织的超低温保存方法,结果表明,预处理、保护剂与解冻方式对胚性愈伤组织存活率均有一定影响.效果较好的方法为:利用0.4 mol·L- Sorb(山梨醇)预处理愈伤组织24 h,5%DMSO(二甲基亚砜)+0.4 mol·L-1 Sorb为冷冻保护剂,冷冻方式为程序降温盒在-70℃停留3 h后投入液氮罐中保存,解冻方式为20℃流水冲洗.胚性愈伤组织解冻后再培养,其存活率可达71.4%.     

中国红豆杉种子超低温保存技术研究

【目的】探索中国红豆杉种质资源的超低温保存技术,为红豆杉种质资源的开发利用提供支持。【方法】采用多重单因素试验法,将中国红豆杉种子前处理后,采用9种不同的冷冻保护剂处理,之后分别进行0 ℃冷浴静置、25 ℃室温0.6 MPa抽真空和冰浴250 W超声波处理,处理时间分别为0,5,10和15 min;然后按照4种不同的冷冻方式投入液氮中冷冻保存,保存结束后分别采用37 ℃水浴快速、20 ℃流动自来水、5 ℃慢速和25 ℃室温静置进行解冻,最后探讨了在较优的3种冷冻保护剂条件下保存时间对红豆杉种子活力的影响。以氯化三苯基四氮唑（TTC）还原法测定冷冻保存后种子的活力。【结果】冷冻保护剂、保护剂处理方式和处理时间、冷冻方式、解冻方式、保存时间均对超低温冷冻保存后的红豆杉种子活力具有明显影响。9种冷冻保护剂中较优的是体积分数8%二甲基亚砜（DMSO）、体积分数5%乙二醇和PVS-4,冻存后中国红豆杉种子TTC还原量分别为（2.679 7±0.255 6）、（2.290 4±0.040 7）和（2.055 5±0.009 9） mg/g;冰浴250 W超声波处理10 min的效果最好,TTC还原量为（2.143 1±0.098 6） mg/g;4种冷冻方式中－20 ℃预冻1 h后投入液氮保存红豆杉细胞活性相对较高,TTC还原量为（2.454 4±0.069 5） mg/g。37 ℃水浴快速解冻后细胞活力更高,TTC还原量为（2.469 7±0.022 1） mg/g。【结论】红豆杉种子的最佳超低温保存技术条件为：采收后的新鲜种子干燥后于5 ℃条件下放置9个月打破其休眠,然后机械去掉种子硬壳,用蒸馏水浸泡12 h,脱去种子内皮,在无菌条件下用体积分数75%酒精消毒30 s,无菌水冲洗2～3次,沥干,移入冷冻管中,加入体积分数8% DMSO冷冻保护剂,封口,于冰浴250 W超声波条件下浸泡处理10 min,于-20 ℃预冻1 h后置于液氮中冷冻保存72 h,然后在37 ℃水浴中快速解冻。在此条件下,中国红豆杉种子活力最高,TTC还原量可达（2.469 7±0.022 1） mg/g,而且同等条件下,选用PVS-4冷冻保护剂更有利于红豆杉种子的超低温长期（1个月以上）保存。     

乙烯对春石斛类原球茎玻璃化超低温保存存活率的影响

  目的  为探究乙烯对PLBs超低温保存存活率的影响,以期为提高其存活率开拓思路。  方法  以春石斛‘红梦幻’类原球茎（PLBs）为材料,分别在其玻璃化超低温保存的预培养和装载阶段添加外源乙烯供体乙烯利和乙烯合成抑制剂硝酸钴,测定PLBs超低温保存过程中内源乙烯前体1-氨基环丙烷羧酸（ACC）含量、ACC氧化酶（ACO）活性及PLBs液氮保存后细胞存活率。  结果  结果显示:无论在预培养还是装载阶段,外源乙烯供体乙烯利处理后,超低温保存过程中PLBs内源ACC含量和ACO活性均显著提高,同时液氮保存后存活率也显著提高;在这两个阶段添加外源乙烯合成抑制剂硝酸钴后,超低温保存过程中PLBs内源ACC含量、ACO活性显著降低,液氮保存后存活率也显著降低。相关分析显示,PLBs液氮冻后存活率与其内源ACC含量和ACO活性呈极显著正相关。  结论  本研究表明,外源乙烯调节剂乙烯利和硝酸钴通过调节内源乙烯含量而对玻璃化超低温保存的春石斛类原球茎存活率产生显著影响。      

栓皮栎胚性组织低温保存技术研究

采用玻璃化法超低温保存栓皮栎胚性组织,不同因子对细胞存活的影响。研究结果表明,冻前保护剂浓度、预冷天数对解冻后材料的存活有很大影响,冷冻防护剂的处理时间及解冻方式对材料冻存后能否成活起到关键作用。材料在继代培养10d时转至含6%二甲亚砜(DMSO)的MS增殖培养基上,5℃下预培养3d,用60%PVS2处理20min,100%PVS2于0℃处理30min,换新鲜PVS2溶液,迅速投入液氮保存,于40℃水浴中迅速化冻,冻后再培养时,细胞能恢复生长。     

樟树成熟种子超低温保存研究

[目的]研究樟树成熟种子保存的最佳方法。[方法]利用正交试验对樟树种子进行超低温保存,探讨樟树成熟种子保存的最佳方法。[结果]樟树种子超低温保存过程中种子最佳含水量为26%;在樟树种子超低温保存过程中,15%二甲基亚砜是最好的冷冻保护剂之一;最利于樟树种子超低温保存的解冻方式是慢冻和慢解冻。[结论]该研究为研究樟树种子低温保存提供理论依据。     

植物种质资源的超低温保存

超低温保存是目前植物种质资源长期稳定保存的理想方法。超低温保存成功的关键在于避免降温及化冻过程中的细胞内结冰,材料特性、冷冻前的预培养、冷冻保护剂、降温冰冻方法和化冻及再培养等因素共同决定了超低温保存的效果。近年来随着科学研究的不断深入,超低温保存取得了一些令人鼓舞的进展,如被成功保存的植物材料日益增多,发现了新型冷冻保护剂抗冻蛋白,玻璃化、包埋玻璃化等新的冰冻保存方法相继建立,生活力测定、恢复培养活力测定以及保存后遗传性状的分析和检测等技术得到了更新与发展。但作为低温生物学中比较新的领域,超低温保存还有许多问题需要进一步研究探讨。     

百子莲胚性愈伤组织在超低温过程中的 蛋白质组学研究

【目的】从蛋白质组学层面揭示植物胚性细胞对超低温保存复合逆境的响应调控机制,筛选出百子莲胚性愈伤组织在超低温保存中的差异表达蛋白,进一步丰富观赏植物超低温保存的分子生物学理论。【方法】利用iTRAQ技术鉴定百子莲胚性愈伤组织在超低温保存四个关键步骤(预培养、玻璃化脱水处理、洗涤和恢复培养)中的差异表达蛋白,应用生物信息学分析方法构建细胞响应超低温保存复合逆境的蛋白调控网络,筛选出植物超低温逆境保护类蛋白。【结果】共鉴定到2730种蛋白,筛选出821个差异表达蛋白。GO功能注释分析结果表明差异表达蛋白主要参与代谢、细胞过程和刺激应答等生物学过程,而催化活性和分子结合是最主要的分子功能类别。KEGG通路分析结果表明差异表达蛋白主要富集于能量代谢、蛋白的合成与降解、信号转导及细胞质膜修复等通路。通过STRING软件构建差异表达蛋白互作调控网络,发现上调表达蛋白主要参与糖代谢、氧化还原过程和核糖体翻译过程,下调表达蛋白主要参与ROS代谢、DNA修复、抑制细胞程序性死亡过程和细胞骨架。此外,筛选到96个与逆境保护相关的差异表达蛋白,分别参与能量代谢、氧化还原平衡、蛋白质合成与降解和信号转导。【结论】在超低温保存过程中,百子莲胚性愈伤组织的能量代谢、氧化应激与蛋白降解及PCD有所加剧,而细胞的ROS清除和胁迫防御过程明显下降,即百子莲胚性愈伤组织在超低温复合逆境下形成以糖代谢和抗氧化系统为主的抗逆保护机制。     

奶牛胚胎冷冻保存技术的研究

<正> 自从Whittngham发现经超低温冷冻保存的小鼠胚胎可以成活后,超低温冷冻保存哺乳动物胚胎的方法取得很大进展。目前许多国家都在对不同的胚胎冷冻保护技术进行探讨,如加入冷冻保护剂的种类和浓度、冷冻程序的选择、脱除保护剂的方法等,试图寻找一个胚胎冷冻和解冻的最佳方案。我们从87年开始从事这方面的研究,其目的是探索胚胎冷冻的方法和步骤、寻找适宜于基层生产单位应用的解冻和脱除冷冻保护剂的简易方法。为今后胚胎移植的推广应用打下基础。     

LN2保存处理后苦槠种子的膜透性

研究了苦槠种子和离体胚在超低温保存过程中含水量，冷冻方式，解冻方式，以及离体胚冰冻保护剂对电导率的影响，结果表明：含水量是超低温保存成功的关键，适度脱水可大幅度降低苦槠种子和离体胚超低温保存过程中的质膜伤害；随着含水量的降低，其电导率的变化呈先降后升，15%含水量的电解质外渗率最低，而在冰冻保护剂作用下，离体胚保存最佳含水量为10%，其质膜所受的伤害比较轻，电解质外渗量较小，膜修复能力强。     

百子莲胚性愈伤组织玻璃化法超低温保存体系建立及遗传稳定性分析

采用单因素随机区组试验及多因素、多水平正交试验方案建立了百子莲胚性愈伤组织(embryogenic callus,ECs)玻璃化法超低温保存体系。将由花梗诱导的胚性愈伤组织接种至预培养基(MS+0.5mol/L蔗糖+1%琼脂)上,在4℃下预培养2d后,在室温下加入装载液(MS+0.4mol/L蔗糖+2mol/L丙三醇+10mmol/L KNO3)处理60min;利用改良后的PVS 2玻璃化溶液(MS+0.4mol/L蔗糖+30%丙三醇+15%乙二醇+15%DMSO)在0℃下处理40min,将含有ECs的冻存管投入液氮中冻存1h;在40℃水浴中快速解冻90s;用洗涤液(MS+1.2mol/L蔗糖+10mmol/L KNO3)处理30min,每10min换1次新鲜的洗涤液;洗涤后,接种到胚性愈伤组织增殖培养基上恢复培养24h后,相对成活率分别达56.9%(TTC法)和43.3%(Evans blue法)。恢复培养55d的百子莲胚性愈伤组织经过AFLP多态性检测后未发现基因组变异,证明该方法可用于百子莲种质资源的超低温保存。     

落叶松胚性愈伤组织诱导与未成熟胚形态的关系

以13落叶松未成熟胚为材料进行胚性愈伤组织的诱导,其中,长73-44、日5*、日5、日5×长77-1、日5×兴9、日12×兴9等6个家系诱导出胚性愈伤组织,7月1日采集的日5×长77-1未成熟胚的胚性愈伤诱导率最高,达13.93%。研究结果表明,不同采集时间的落叶松合子胚形态存在一定区别,诱导出的愈伤组织形态也有所不同,其胚性愈伤组织诱导明显受到取材时间及家系的影响。落叶松胚胎发育存在多胚现象,胚性愈伤组织的诱导率与散粉后时间及胚胎长度呈负相关,而与多胚发生率呈显著正相关(p=0.028)。     

大兴安岭北部不同类型兴安落叶松林土壤呼吸及其组分特征

目的研究大兴安岭地区兴安落叶松林土壤呼吸及其组分的特征以及与土壤温度、湿度两个影响因子之间的关系,为进一步阐明我国寒温带地区碳释放及其对地区气候的影响提供科学依据。方法使用LI-6400对大兴安岭北部5种主要类型兴安落叶松林(落叶松纯林、兴安杜鹃-落叶松林、杜香-落叶松林、白桦-落叶松林和樟子松-落叶松林)的土壤呼吸、呼吸组分及其影响因子进行测定分析。结果5种类型兴安落叶松林土壤总呼吸(R_S)、异养呼吸(R_h)和根呼吸(R_r)都具有明显的单峰曲线季节动态,且峰值均出现在8月;平均R_S波动在4.71~7.41 μmol/(m2·s)之间,大小依次为樟子松-落叶松林>杜香-落叶松林>白桦-落叶松林>落叶松纯林>兴安杜鹃-落叶松林,且不同类型兴安落叶松林土壤呼吸存在显著差异(P＜0.05);不同类型兴安落叶松林R_h和R_r也存在显著差异(P＜0.05),平均R_h表现为樟子松-落叶松林(5.56 μmol/(m2·s))>落叶松纯林(4.64 μmol/(m2·s))>白桦-落叶松林(4.55 μmol/(m2·s))>杜香-落叶松林(4.27 μmol/(m2·s))>兴安杜鹃-落叶松林(3.80 μmol/(m2·s));平均R_r表现为杜香-落叶松林(3.15 μmol/(m2·s))>樟子松-落叶松林(2.98 μmol/(m2·s))>白桦-落叶松林(2.76 μmol/(m2·s))>兴安杜鹃-落叶松林(2.30 μmol/(m2·s))>落叶松纯林(1.97 μmol/(m2·s))。异氧呼吸对土壤呼吸的贡献最大,占61.84%~71.76%,在异养呼吸中,以矿质土壤呼吸(R_m)为主,占土壤总呼吸的46.28%~58.18%,凋落物呼吸(R_l)的贡献只有8.34%~15.57%;R_r的土壤呼吸的贡献率为28.24%~38.16%。R_S与土壤10 cm温度(T₁₀)呈显著正相关指数关系,T₁₀可以解释土壤季节性变化的43.6%~57.0%;但R_S与土壤10 cm湿度(W₁₀)的相关性因林型而异。结论不同类型兴安落叶松林土壤呼吸及其组分之间差异显著;温度是土壤呼吸的主要影响因子,而湿度对土壤呼吸的影响较小。      

落叶松种子超干贮藏含水量和引发条件的选择

采用硅胶干燥法处理华北落叶松(Larix gmelinii var.principis-rupprechtii)种子,获得含水量分别为9.11％、7.00％、5.09％、4.18％、3.21％、2.11％的种子.超干种子在室温下贮藏3个月后,进行回湿处理或PEG 6000引发处理后进行发茅试验,测定种子发芽率、发芽指数和活力指数.结果表明,超干处理的种子采用质量分数20％的PEG 6000引发有较高的种子活力.含水量为4.18％的种子发芽率、发芽指数以及活力指数均比其他含水量的超干种子高.     

大麦胚性悬浮细胞系的快速建立及其超低温保存

 禾谷类作物胚性悬浮细胞系的建立及其超低温保存是现代植物生物技术中的基础工作。本文分析了从大麦成熟胚培养快速建立胚性悬浮细胞系的两个关键步骤。愈伤组织的精心选择直接关系到建立细胞系的难易程度。悬浮培养过程中的细胞学观察可以用来判定2，4-D浓度和继代周期等因子是否需要调整。经过预培养和保护剂处理，用两步法冻存的大麦悬浮细胞能够高频率地恢复生长。在合适的条件下用玻璃化法冻存，TTC相对存活率可达51%，从恢复生长的细胞获得了再生植株。     

小鼠扩张囊胚细胞膜对不同抗冻保护剂通透性的测定

胚胎玻璃化冷冻保存最重要的条件是胚胎细胞膜对抗冻保护的通透速度,即细胞内外液保护剂达到平衡和时间。温度及抗冻剂的种类不同,其通透性速度各异。本试验将玻璃化抗冻液中常用的几种抗冻保护剂,如乙二醇,丙三醇,二甲基亚砜,乙酰胺及丙二醇的通透性进行比较。     

华北落叶松、樟子松生长与气候因子的关联度分析

运用灰色关联度方法分析了塞罕坝地区华北落叶松、樟子松生长与气候因子的相关关系,结果表明:水分因子是影响华北落叶松、樟子松直径、树高连年生长的主导气候因子,主要包括年平均相对湿度、年降水量、上年11月-当年1月平均蒸发量、上年6~8月份降水量。     

玉米自交系幼胚培养与基因枪转化研究

玉米自交系幼胚在添加 1～ 2mg/L 2 ,4-D的N6培养基上能够诱导形成不同类型的胚性愈伤组织。愈伤组织的诱导率与基因型和 2 ,4-D浓度有关 ,6个自交系的诱导率在 5 2 %～ 89%。将淡黄色颗粒状结构致密型愈伤组织在N6诱导培养基上继代培养 2 0个月 ,仍具有较强的分化能力。在附加 2mg/L 6 -BA和0 .2mg/LNAA的N6分化培养基上 ,有 2 7%～ 41%的愈伤组织分化成苗。通过基因枪轰击成功地将 pbarGUS基因转入玉米细胞 ,获得了大量的转化胚性愈伤组织。用 0 .4mol/L的甘露醇高渗处理幼胚 ,能显著提高pbarGUS基因在细胞中的表达 ,高渗处理转化率较对照提高了 3倍