不同转染试剂转染绵羊成纤维细胞效果比较

为了确定GDF-8基因干扰质粒转染绵羊成纤维细胞的最佳转染条件,采用LipofectamineTM2000与FuGene HD这2种转染试剂介导质粒转染绵羊成纤维细胞。结果表明,LipofectamineTM 2000介导转染时,当DNA用量为0.4μg,LipofectamineTM 2000用量为1.0μL,转染时间为6 h时,能达到最佳转染效果;FuGeneHD介导转染时,当每100μL转染液内含有质粒DNA 2μg,FuGene HD 10μL,每孔加入转染液5μL时,可获得最佳转染效果。FuGene HD的转染效率显著高于LipofectamineTM2000转染效率。     

猪胎儿成纤维细胞的分离与基因转染

为利用核移植法获取转基因克隆猪提供供体细胞,体外分离培养猪胎儿成纤维细胞并进行了绿色荧光蛋白基因转染。首先采用组织块贴壁法分离培养猪胎儿成纤维细胞,绿色荧光蛋白表达载体以脂质法介导转染猪胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合,利用荧光显微镜检测荧光蛋白的表达。结果表明,组织块贴壁后9 d可获取原代成纤维细胞,基因转染后利用G418筛选9 d即可获得转基因细胞,对转基因细胞进行传代,PCR检测显示荧光蛋白基因整合到细胞基因组中,荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,为下一步通过核移植方法获得转基因猪提供了基础。     

电穿孔法转染猪胎儿成纤维细胞条件优化

以增强型绿色荧光蛋白为报告基因,采用L9(33)正交试验设计,对质粒浓度、电压、脉冲时间等3个因素进行优化,并比较了不同温度处理对转染效率的影响,以及电压对细胞存活率的影响.结果表明,3个因素中质粒浓度对转染效率的影响最大,质粒浓度和电压对转染效率均有显著影响,脉冲时间对转染效率的影响不显著.不同温度处理下的转染效率无显著差异,电压显著影响细胞存活率.质粒浓度40 g/mL、电压280 V、脉冲时间800 s条件下,转染效率最高,为89.8％.     

电转液L对绵羊成纤维细胞电转染条件优化

[目的]采用实验室配制的电转液L,优化绵羊成纤维细胞的转染效率.[方法]利用Lonza 4D-Nucleofector设备,针对实验室配制的电转液L,将P max绿色荧光蛋白表达质粒导入绵羊成纤维细胞中,通过流式细胞仪测定和荧光显微镜观测细胞转染效率.[结果]通过测定细胞转染效率,得到较佳电转方案:L电转液100μL悬浮绵羊成纤维细胞,采用CZ-167电转程序,质粒浓度4 g,2×106个细胞,电击一次,电转后37℃放置10 min可获得理想的转染效率.     

猪白介素18基因在BHK细胞中的表达

将猪白介素18(Porcine interleukin18,PIL-18)基因亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,构建了重组表达质粒pEGFP-PIL-18,利用脂质体法转染BHK细胞,采用荧光显微镜实时观察和RT-PCR检测技术确定目的蛋白的表达情况.结果在转染重组质粒24 h4、8 h后的BHK细胞中均观察到绿色荧光,转染的BHK细胞经G418筛选14 d后,用RT-PCR法检测目的基因,并扩增到长576 bpd的目的cDNA片段。表明在BHK细胞中成功地表达了PIL-18与EGFP的融合蛋白,这为下一步建立稳定表达PIL-18的细胞系奠定了基础.     

人凝血因子Ⅸ乳腺特异表达载体的构建及细胞转染

【目的】人凝血因子Ⅸ（human coagulation factor Ⅸ,hFIX）是凝血过程中的关键因子,对临床治疗血友病有着极其重要的意义。研究旨在构建人凝血因子Ⅸ乳腺表达载体,在猪乳腺上皮细胞中验证其乳腺特异表达能力,获得hFIX转基因雌性乳腺上皮细胞和猪胎儿成纤维细胞,为克隆乳腺特异表达人凝血因子Ⅸ的转基因猪做准备。【方法】按照TaKaRa公司RNAiso Reagent和Prime Script RT-PCR试剂盒的说明书,从人胎儿肝脏中提取RNA并扩增出人凝血因子Ⅸ（human coagulation factor Ⅸ,hFIX）cDNA序列,利用PCR方法扩增牛生长激素(BGH) polyA序列,将hFIX的cDNA序列与BGH polyA序列分别连接到表达载体pbCSN2-RC的牛酪蛋白（CSN2）启动子之后,构建带有新霉素抗性和红色荧光蛋白双筛选标记的乳腺特异性表达载体pbCSN2-hFIX-pA-RC。取本地屠宰的泌乳期猪乳房组织,利用组织块种植法培养猪乳腺细胞,并通过控时消化分离纯化猪乳腺上皮细胞,进行染色体分析后,挑选含有正常染色体数目的细胞,通过脂质体法将表达载体导入,经过G418筛选获得稳定表达红色荧光蛋白的转基因细胞,反转录、实时定量PCR验证乳腺表达载体构建的合理性和有效性。为了只对雌性胎儿成纤维细胞进行转基因操作,首先对培养的猪胎儿成纤维细胞进行SRY基因PCR扩增,确定其性别。之后,利用脂质体将证明有效的表达载体导入细胞,并进行G418和红色荧光蛋白表达筛选,对经过鉴定的阳性细胞进行扩大培养和冷冻保存,为下一步的体细胞克隆做准备。【结果】经PCR和酶切鉴定,人凝血因子ⅨcDNA和BGH PolyA成功克隆到载体pbCSN2-RC中,获得具有双筛选标记的pbCSN2-hFIX-pA-RC。转染后G418和红色荧光蛋白表达阳性的猪乳腺上皮细胞,经实时定量PCR鉴定,hFIX有高效表达,证明所构建载体具有指导人FIX在乳腺特异表达的能力,可以用于生产乳腺特异表达的动物。将构建的载体转入雌性猪胎儿成纤维细胞,经G418和红色荧光蛋白的表达筛选,成功获得hFIX转基因阳性细胞。【结论】pbCSN2-RC所含的牛β-酪蛋白启动子可以成功特异性诱导hFIX在猪乳腺细胞的特异表达,获得的hFIX转基因阳性猪胎儿成纤维细胞,为下一步通过体细胞克隆培育hFIX乳腺生物反应器奠定了基础。     

人Ⅰ型胶原基因脂质体转染牛耳细胞克隆筛选方法

构建连接有人Ⅰ型胶原基因的质粒(PGCl-collagen).利用脂质体介导的方法转染荷斯坦奶牛耳成纤维细胞,优化一系列转染条件以提高转染效率,再利用G418和GFP荧光的表达来筛选稳定转染的细胞,最后以末转染的成纤维细胞作为阴性对照组,PGCl-collagen作为阳性对照组对转染的细胞进行PCR验证.结果显示:在6孔培养板中细胞融合度达到50%～60%左右介导1～3μg重组质粒转染24 h,转染效率可达25%～30%,筛选单克隆细胞在荧光显微镜观察检测到绿色荧光蛋白的表达.在使用800U的G418筛选效果最好,维持浓度300～600U,获得25个稳定表达的阳性细胞系.从中选取6个克隆进行PCR验证.成功利用脂质体转染方法将人I型胶原基因成功转染到荷斯坦奶牛耳成纤维细胞,PCR验证结果正确.     

脂质体LTX介导高效转染山羊胎儿成纤维细胞(gFFCs)条件的优化

探讨获得外源基因高效转染山羊胎儿成纤维细胞(gFFCs)的方法,为筛选出体细胞核移植的供核细胞,制备转基因山羊提供技术基础。该研究以绿色荧光蛋白基因(GFP)为报告基因,采用脂质体LipofectaminTM LTX+PLUSTMReagent介导,对细胞接种量、质粒DNA用量、脂质体与质粒DNA比例、脂质体-DNA复合物与细胞作用时间进行优化,荧光显微镜下统计转染后24h的转染效率。结果显示：在24孔培养板中,每孔接种细胞6×104个,24h后进行转染,质粒DNA每孔0.6μg,脂质体与质粒DNA比例为4.5：1.0,脂质体-DNA复合物与细胞作用时间为6 h时,转染效率最高,达到81.2％。     

小鼠胚胎干细胞转染条件的优化

【目的】对小鼠胚胎干细胞(mESCs)转染条件进行优化。【方法】分别将0.5×105,1×105,2×105,4×105个细胞接种24孔板(各细胞量均接种2孔),培养48h在其细胞融合度分别为30%,50%,70%,90%左右时,分别设置相同的(0.8μgDNA/2μL脂质体)和不同的DNA/脂质体用量(DNA量(μg)/Lipo量(μL)分别为0.4/1,0.8/2,1.6/4,3.2/8),采用脂质体(LipofectamineTM2000)转染法,将pEGFP-N1报告基因载体转染到mESCs中,48h后通过荧光观察和流式分析检测各组EGFP荧光强度,比较转染效率。【结果】在质粒及脂质体用量相同(0.8μgDNA/2.0μL脂质体)的条件下,随着细胞融合度的增加,EGFP荧光强度逐渐减弱,在细胞融合度为30%,50%,70%,90%左右时转染,各组EGFP阳性细胞率分别为56.4%,51.8%,40.8%和23.3%。提高转染质粒及脂质体量可在一定程度上提高转染效率,但脂质体的细胞毒性也随之增加,不利于细胞生长。【结论】低融合度(30%～50%)条件下,使用0.8μgDNA/2.0μL脂质体对mESCs进行转染,可获得较高的转染效率(50%),同时可维持良好的细胞状态。     

阳离子脂质体基因载体的细胞转染研究

研究阳离子脂质体在不同细胞中的转染效率及毒性。首先采用DNA延滞实验研究Lipofectamine2000、DOTAP转染试剂与DNA的结合能力。然后选用绿色荧光蛋白的质粒pGFP-N2作为报告基因模型和转染试剂制成复合物后转染Hela、7721、HT29细胞,比较多种因素对转染的影响。最后使用MTT比色法分析Lipofectamine2000、DOTAP转染试剂对细胞的毒性。随着复合物中转染试剂比例的增加,Lipofectamine2000、DOTAP与DNA结合能力逐渐增强。Lipofectamine2000在Hela细胞转染最高效率约72％;在7721、HT29细胞转染效率较低。DOTAP在3种细胞的转染效率都很低;在转染效率最高时2种转染试剂的细胞存活率均在90％以上。对商品化的转染试剂研究和讨论以期为阳离子类脂非病毒载体的研究提供参考。     

3种药剂对剑麻新菠萝灰粉蚧的影响

文章根据农业部农药田间试验准则,安排特丁硫磷、生石灰、40.00%氧化乐果3种药剂对剑麻新菠灰萝粉蚧进行药剂防治试验。试验结果表明:在3种药剂防治剑麻新菠萝灰粉蚧试验中,生石灰药剂防治具有防治效果好,防治周期长,防治成本低,是一种生态环保的防治方法。     

不同药剂对叶蝉的防治效果的影响

[目的]筛选叶蝉的防治药剂.[方法]通过小区试验研究了4种药剂对水稻叶蝉的防治效果.[结果]40％噻虫胺可湿性粉剂150 g/hm2和25％噻虫嗪水分散剂180 g/hm2能达到对叶蝉的防治效果;50％吡蚜酮180 g/hm2在防治飞虱的同时,对叶蝉的兼治效果明显;48％毒死蜱1 500 ml/hm2对叶蝉的防治效果较差,其用药量需进一步研究.[结论]试验结果对保障水稻安全生产及增产增收具有重要意义.     

NAG含量测定中常见的3种DNS试剂使用效果比较研究

以乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine,NAG)为还原糖,用常见的3种DNS试剂测定还原糖的含量,比较其准确度和灵敏度。结果表明,虽然它们标准曲线的斜率及R2不同,但3种DNS试剂对NAG测定效果均良好,且以DNS3试剂效果最佳,灵敏度和准确度最好。     

多能性转录因子mRNA转染山羊胎儿成纤维细胞条件优化

【目的】针对转染试剂脂质体2000和转染方法进行研究,用以优化外源多能性转录因子oct4、sox2、klf4、c-myc的mRNA转入山羊胎儿成纤维细胞（goat embryonic fibroblast,GEF）的条件。【方法】采用胰酶消化法,从山羊胎儿腿部肌肉组织中分离并获得了纯化的GEF细胞。根据mMESSAGE mMACHINE® T7 Ultra Kit试剂盒说明书,体外转录步骤主要有：①前期的质粒准备：首先用质粒小提试剂盒对摇菌获得的各体外转录载体质粒进行提取,随后对各体外转录载体目的基因下游进行单酶切,获得线性化质粒,最后用DNA纯化试剂盒对线性化的质粒进行纯化;②mRNA的“加帽”：以线性化DNA为模板,合成带有5′端帽子结构的mRNA,添加TURBO DNase以除去模板DNA;③mRNA的“加尾”：以ATP为原料,利用试剂盒自带的Poly(A)聚合酶,对已经“加帽”的mRNA进行“加尾”,以合成结构完整的mRNA;④完整mRNA的纯化：按照MEGAclear^TM Kit试剂盒对mRNA进行纯化。随后,将体外转录获得各转录因子的mRNA进行浓度和OD值测定。分别比较总mRNA（EGFP和4种多能性转录因子的mRNA的质量分别为0.2μg）和脂质体2000 的比例为1:0.5、1:1.0、1:1.5、1:2.0以及在最佳总mRNA与脂质体2000比例体系下第2、4、6代GEF细胞的mRNA转染效率。对最佳转染体系下转染多能性转录因子mRNA的GEF细胞进行免疫荧光检测,并对转染多能性转录因子mRNA后GEF细胞的形态和数目进行观察。【结果】mRNA和脂质体2000 的比例为1:1.0以及在最佳总mRNA与脂质体2000比例体系下第2代GEF细胞的mRNA转染效率均显著高于其他组（P＜0.05）,且本组细胞在形态和生长方面相对较好;免疫荧光检测表明,4种多能性转录因子的mRNA在GEF细胞中定位于细胞核,并获得稳定表达,在细胞质中不见多能性转录因子oct4、sox2、klf4、c-myc的表达;GEF细胞在转染4种mRNA 24h后,细胞形态由梭状慢慢向圆形靠拢;细胞活力低于对照组（山羊成纤维细胞正常生长组）。【结论】GEF细胞在总mRNA和脂质体2000 的比例为1:1.0以及在最佳总mRNA与脂质体2000比例体系下第2代GEF的条件下更适合mRNA的转染。研究工作为mRNA转染体细胞或干细胞的研究及诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPS）的获得提供参考资料,并对mRNA在成纤维细胞中的去向提供间接证据,有利于更加深入地了解多能性转录因子oct4、sox2、klf4、c-myc的mRNA相关功能。     

低血清培养的BHK21细胞染色体遗传稳定性分析

[目的]对一种商业化的低血清培养基适应BHK21细胞进行传代培养,并分析该细胞染色体的变异稳定性,以判定其质量。[方法]采用直接法制备4个代次BHK21细胞的染色体标本,用常规Giemsa染色,在1 000倍光学显微镜下计数中期分裂相染色体数目,并进行核型分析。[结果]BHK21为亚二倍体或亚四倍体细胞系,亚二倍体总数为42,亚四倍体细胞总数为72~74,该细胞系染色体的畸变率在各代次所占比例为0~2%,均较低。[结论]该细胞系的遗传学特性相对稳定,各代次间无本质差异,可候选为制苗用细胞。     

pIRES2-EGFP-prnd真核表达载体的构建及其在BHK细胞中的表达

为探讨叠朊蛋白(Doppel)在正常生理条件及相关疾病中的临床及生物学意义,构建BALB/c小鼠Doppel基因prnd的重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-prnd,并转染BHK细胞,IFA检测其表达情况。结果表明,Doppel蛋白通过pIRES2-EGFP-prnd在BHK细胞中表达。试验可为进一步研究Doppel蛋白的结构、正常的生理生化功能及其与相关疾病的关系提供重要工具。     

山羊附睾头细胞转染中新霉素和嘌呤霉素的浓度筛选

通过对9月龄黑山羊附睾头细胞进行不同浓度、不同时间新霉素和嘌呤霉素的处理,收集各个时间的细胞并进行计数,旨在研究山羊附睾头细胞对新霉素和嘌呤霉素的耐受浓度。结果显示,山羊附睾头细胞在转染时对新霉素和嘌呤霉素适宜的质量浓度分别为400,2μg/m L;试验细胞计数结果与细胞生长状态相一致,山羊附睾细胞与其他哺乳动物不同组织器官对新霉素和嘌呤霉素的耐受浓度基本一致。研究结果可为后期基因敲除和过表达载体转染进山羊附睾头细胞时抗性基因浓度的确定提供了参考,也为后期基因功能的研究奠定了基础。     

三种涂抹剂防治苹果腐烂病田间药效对比试验

为了有效防治苹果腐烂病,选取噻霉酮、寡雄腐霉、甲基硫菌灵3种作用方式不同的涂抹剂作为苹果腐烂病进行试验药剂对比试验。结果表明:在苹果腐烂病发生严重的果园3种涂抹剂均有一定的防治效果。噻霉酮处理的防效最好,对病疤复发防效和新增病疤防效均明显高于另两种涂抹剂,防效分别为89.78%和87.84%;寡雄腐霉处理基本能够控制苹果腐烂病的发生,对苹果腐烂病病疤重犯的防效为76.84%,略低于甲基硫菌灵防效。寡雄腐霉对苹果腐烂病新增病疤防效为71.36%,明显低于甲基硫菌灵的药效。腐烂病防治适期应在早春苹果发芽前病害发生之前或发生初期,试验期间未发现各供试药剂对果树有不良影响。