核酸技术在禽病诊断中的应用

近年来 ,随着分子生物学发展 ,禽病诊断水平有了很大提高。禽病的实验室诊断技术已从常规的病毒分离鉴定以及抗原、抗体的免疫学检测 ,进入到可对病原微生物的基因序列和结构直接进行测定的分子生物学水平。核酸技术是分子生物学技术的一部分 ,它包括聚合酶链反应 ,核酸探针及限制性内切酶酶切片段分析和核酸序列测定。核酸技术的核心是根据病原体的遗传物质ＲＮＡ或ＤＮＡ进行鉴别定性 ,其目的是检测病原体 ,同时鉴定血清型、亚型或基因型 ,核酸序列分析定性的水平是其他方法不可比拟的。核酸技术具有高灵敏性、高特异性等优点 ,目前该技术…     

禽病研究中的核酸技术

分子生物学的发展导致了自70年代来多种核酸生物技术的相继问世。这些技术的应用范围涉及生命科学的各个领域,正显示出常规技术无可比拟的优越性。核酸技术应用于禽病研究也因之方兴未艾,已成为禽病学研究领域中一个重要发展方向。这些技术主要包括四个方面,即限制性核酸内切酶分析技术、核酸探针制备技术、核酸分子杂交技术和多聚酶链反应技术。较之常规的病毒学和血清学技术,核酸技术具有更高的灵敏性、更强的特异性和更广的用途。本文就这些技术的基本方法和应用于禽病研究的动态作一简单介绍。     

核酸技术在禽病诊断上的常规运用

核酸技术(包括聚合酶链式反应,核酸探针,限制性内切酶酶切片段分析和测序)在禽病研究中一直主要局限于基础分析和回顾性研究。近来,这些方法已更多地用于鸡和火鸡的临床诊断以及实施流行病学调查,它们的核心内容在于通过对病原基因材料—RNA或者DNA的分析,对病原进行识别和鉴定。对病原快速检测的同时,结合血清型、亚型或基因型的鉴定一直是这些方法运用的目标。序列分析同时也提供了一种为其它方法所无可比拟的鉴定指标。本文中,我们描述了核酸技术在传染性支气管炎病毒、火鸡鼻气管炎病毒(禽肺病毒)和新城疫病毒诊断和流行病学调查上的运用。     

禽脑脊髓炎病毒检测技术研究进展

禽脑脊髓炎是一种病毒性传染病,能引起雏鸡、雉、鹌鹑和火鸡感染,其特点是运动失调和快速震颤。文章就其检测技术,如病毒分离,血清学诊断和核酸探针等的研究进展做一阐述。     

一步法RT—PCR检测禽呼肠孤病毒方法的建立与应用（摘要）

禽呼肠孤病毒 (ＡＲＶ)是呼肠孤病毒属的成员 ,在临床上主要引起鸡病毒性关节炎 /腱鞘炎、吸收障碍综合症等多种疾病。禽呼肠孤病毒感染导致鸡群的饲料报酬降低、生产能力下降、屠宰废弃率高和引起免疫抑制而造成其它疾病的并发或继发感染 ,使鸡群死亡率升高 ,其危害相当严重。目前 ,对于禽呼肠孤病毒的检测已建立起了常规的病毒分离鉴定、ＥＬＩＳＡ和荧光抗体检测方法 ,近年来 ,我们也建立了ＲＴ ＰＣＲ、半套式ＰＣＲ和核酸探针等技术。本研究的目的是建立一种更加简便的一步法ＲＴ ＰＣＲ检测禽呼肠孤病毒的技术。禽呼肠孤病毒为双链Ｒ…     

鸡致病性外源性禽白血病病毒特异性核酸探针交叉斑点杂交检测试剂盒的研制

用特定引物通过PCR合成了经地高辛标记的鸡致病性外源性及内源性禽白血病病毒特异性核酸探针,通过交叉斑点分子杂交,这些探针将可用于检测病料样品中致病性外源性禽白血病毒特异性核酸的存在。利用此试剂盒,对从病料组织样品中提取的基因组DNA作交叉斑点分子杂交或对提取的DNA用相应引物扩增后的PCR产物作交叉斑点分子杂交,可在24～36h内完成检测并报告结果。     

禽呼肠孤病毒RT-RPA-LFD快速检测方法的研发

禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)主要感染鸡和火鸡，引起关节炎、腱鞘炎等症状。为满足疾病早期快速诊断的需求，建立一套应用重组聚合酶核酸等温扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)检测ARV的方法，使用侧向流动免疫试纸条(lateral flow dipstick,LFD)观测结果。首先针对ARV较为保守的片段M1基因设计数套引物，使用普通RT-PCR筛选出一套无非特异条带、敏感性优良的引物组建立ARV RT-RPA-LFD反应体系，优化探针浓度和反应温度，使用建立的反应体系进行特异性和敏感性试验，最后以最低检测模板浓度优化反应时间。结果显示，建立的ARV RT-RPA-LFD反应体系在探针工作浓度为0.12 mmol/L,37℃条件下反应20 min，可最低检测到1.5×10¹ copies/反应的ARV RNA，并且不与其他常见禽病原体核酸发生反应。使用建立的方法检测40份临床病料，发现有3份ARV阳性，与之前本实验室建立的二重qRT-PCR检测结果一致。结果表明，本研究建立的ARV RT-R...     

禽传染性喉气管炎病毒TK基因狄高辛探针的研制及应用

应用狄高辛标记禽传染性喉气管炎病毒（ＡＩＬＴＶ）ＴＫ基因制备探针,经斑点杂交显色后,探针同以ＡＩＬＴＶ北京株为模板的ＴＫ基因ＰＣＲ产物及北京株核酸均呈阳性紫色斑点,而与正常尿囊液、新城疫病毒和火鸡疱疹病毒、禽传染性支气管炎病毒无反应,２株确诊为ＡＩＬＴＶ的野外分离毒也呈阳性。本研究结果表明,该ＴＫ基因探针是敏感和特异的,可用于禽传染性喉气管炎和其它呼吸道疾病的鉴别诊断。     

核酸探针在兽医传染性疾病的应用

核酸探针技术作为兽医微生物学基础研究和重要的兽医传染性疾病的诊断的应用已与日俱增。本文作者对核酸探针方法学及其在兽医传染性疾病的应用作了总的评价。核酸探针应用主要包括临床样品病原体的检测，特别是那些需要复杂营养和难以培养的微生物，从野型毒株中区别疫苗毒株，微生物定型，基因定位，特异基因的克隆DNA库的筛选，潜伏感染或带菌动物的检测，发病机理的研究，流行病学的研究和饲料防护。     

核酸探针的制备及其使用技术

由于限制性内切酶的发现以及重组DNA技术的新进展,使得可以合成核酸探针(Nucleic Acid Probe)进行疾病的诊断和病原的检测。因为标记的核酸探针可以通过相应的碱基配对原则和与其具有同源或部分同源性的核酸序列发生杂交反应,特异性相当高,是一种重要的辅助性病毒诊断方法。     

核酸探针检验技术在兽医诊断中的应用

随着核酸探针制备、杂交与标记技术的不断深入发展和探针诊断试剂的商品化、核酸探针诊断技术在兽医诊断领域得到了日益广泛的应用。本文拟就核酸探针在病原体的检测、微生物分型与致病微生物鉴定、细胞培养中污染微生物检验、食品检验及致病机理研究几个方面的应用做了介绍。     

2014世界肉鸡疫病控制研究和技术发展报告

2014年,危害全球肉鸡业的主要传染病有禽流感、新城疫、鸡传染性支气管炎、禽白血病等病毒性疫病,我国鸡群H5亚型禽流感、新城疫等烈性疾病偶有发生,传染性支气管炎、H9N2亚型禽流感较常见,白血病感染仍然很严重。2014年我国研制出针对7.2分支H5亚型禽流感病毒的Re-7株灭活疫苗并广泛应用;此外,家禽的细菌性疾病依然是一个世界难题,以大肠杆菌、出血性败血症巴氏杆菌、沙门菌、空肠弯曲杆菌等引起的细菌性疫病为主。家禽疫病诊断及检测技术的主要发展趋势是以高通量、快速、高特异性为主要方向,检测方法仍然以RT-PCR技术、单克隆抗体、ELISA、核酸探针技术为主。2014年度我国科研人员已研制多种病毒性及细菌性疫病快速和高通量监测试剂盒,包括检测禽白血病抗原和抗体的ELISA、LAMP、胶体金试纸条等监测试剂盒。目前我国已初步形成禽类疫病监测和诊断体系以及禽免疫抑制病如禽白血病等的净化体系和综合防控措施。     

PCR和核酸探针技术诊断MD和RE的比较研究

分别应用聚合酶链反应(PCR)技术和核酸探针的点杂交技术，对临床鸡肿瘤／可疑肿瘤病料分别进行马立克氏病(MD)和禽网状内皮增生症(RE)的检测。结果MD和RE的PCR检测阳性率分别为81．9％和53．3％，探针点杂交检测的阳性率则分别为77．1％和27．1％。研究的结果表明，两种检测技术都有很高的特异性，相比而言PCR技术检测的敏感性更高，而且更快速、操作更简便、成本更低。     

LAMP技术应用于禽病诊断的研究进展

环介导等温扩增技术（LAMP）是一种新的核酸扩增技术,具有简单、快速、特异性强的特点.由于采用4个引物,与传统的核酸扩增技术相比,它具有敏感、特异的特点.为此,对近几年应用LAMP技术诊断禽流感、禽腺病毒感染、鸭疫、鹅细小病毒病等7种禽病的研究进行了综述.     

PCR结合变性高效液相色谱法与荧光定量PCR法在检测禽白血病中的比较与应用

本研究旨在比较PCR结合变性高效液相色谱技术(PCR-DHPLC)与荧光定量PCR(Real-time PCR)两种方法在检测禽白血病中的应用。根据禽白血病pol基因序列,设计1对引物和1条探针,利用引物进行禽白血病模板的RT-PCR扩增,产物经变性高效液相色谱上样处理;利用引物及探针进行荧光定量PCR扩增,结果与PCR-DHPLC进行比对。两种方法同时用正常鸡胚尿囊液、鸭瘟病毒、传染性支气管炎病毒、鹅细小病毒、H5N1亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、减蛋综合症病毒做特异性检测;以稀释成不同梯度的AV228毒株核酸做敏感性检测。试验结果表明PCR-DHPLC方法只对禽白血病病原有阳性扩增的吸收峰,Real-time PCR也只对禽白血病病原有阳性扩增,两法均对其他禽源病毒核酸无特异性扩增;PCR-DHPLC与Real-time PCR法相比,灵敏度虽低于Real-time PCR 1个数量级,但检测限仍可达到3 pg核酸模板。两种方法均能检测到感染鸡的泄殖腔拭子所采集的病毒量。采集120份蛋鸡棉拭子同时进行临床检测,两种方法检测ALV的符合率为100%(15/120)。研究表明两种方法均可用于诊断禽白血病病毒。     

弓形虫病核酸诊断技术研究进展

弓形虫病是一种危害严重的人兽共患病,临床快速诊断是成功控制该病的关键。本文就探针、PCR等核酸诊断技术在弓形病诊断中的应用情况进行了综述。     

荧光定量PCR技术及其在动物传染病定量检测中的应用

荧光定量PCR是近年发展起来的一 种新的实时定量检测特定核酸技术,它是核 酸探针技术、荧光共振能量传递技术和PCR 技术的有机结合,而荧光探针是荧光定量 PCR的核心。目前报道的荧光探针主要有 TaqMan、Amplisensor、分子信标、Lightcycler 以及在这4种探针基础上发展起来的其他荧 光探针。各种荧光探针在定量PCR中的作 用是识别和报告特定核酸。这些荧光探针与 相应的靶分子杂交时经历一个自发荧光形成 或消失的构象变化,只有与完全互补的靶核 酸杂交时才会出现这种变化,当靶核酸存在 碱基错配或缺失时,荧光探针就不会与之杂 交,也不会出现荧光的变化。在检测时根据 这种荧光变化来确定检测中特定核酸的存在 和量的多少。荧光探针用于定量PCR不但 提高了PCR的检测灵敏度,还能在同一封闭 管中对模板进行准确定量检测,特别适合特 定核酸扩增的实时监测。荧光定量PCR用 于动物传染病的诊断,不但能定量检测病原 体感染的强弱和在机体内的分布,还具有灵 敏、快速、省力的特点。     

PCR结合斑点杂交技术检测鹦鹉喙羽病病毒方法的建立及应用

鹦鹉喙羽病(PBFD)是鹦鹉目前最常见的疾病,对鹦鹉养殖业危害极其严重。根据鹦鹉喙羽病毒(PBFDV)基因片段的克隆和序列分析,设计合成1对特异性引物,以CP基因为模板,经PCR扩增获得830 bp的核苷酸DNA,并用DIG标记DNA,制备用于检测PBFDV的特异性核酸探针。用该核酸探针对疑似感染PBFDV的鹦鹉病料进行斑点杂交检测,并对鉴定为阳性的PBFDV进行全基因组扩增和测序分析。结果显示,利用PCR结合斑点杂交技术检测PBFDV,特异性强、敏感度高,具有可重复性。鉴定为阳性的2株PBFDV全基因组序列之间同源性为100%,与已报道序列的同源性为81.5%～98.9%。本研究为我国开展PBFDV感染的分子流行病学调查和临床诊断提供了一种敏感、特异的检测方法。     

应用~(32)P标记核酸探针检测牛传染性鼻气管炎病毒的研究初报

本文在我国首次报道应用核酸探针检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)。经培养、纯化IBRV,抽提IBRV全基因组DNA,用缺口翻译法标记上~(32)P,在硝酸纤维膜上进行打点杂交。试验结果表明,采用~(32)P标记的核酸探针,可检测出10Pg的IBRV—DNA,能明显区别IBRV感染细胞和未感染的正常细胞,具有相当高的灵敏度和特异性,同Dorman报道的结果相似。 应用核酸探针检测病毒核酸的技术,近年来有了突破性的进展,有的国外学者称之为第四代检测技术。其基本原理是利用放射性同位素标记的DNA或RNA(即核酸探针)与固定在硝基纤维素膜上或玻片上的单链核酸进行杂交,经过放射自显影,在X光片或感光乳胶中可看到特定的核酸片段的踪迹。由于这一技术具有灵敏度高,特异性强的优点,在医学临床诊断中已显示出它的优越性,文献报道日趋见多。在动物病毒研究方面已见到了用核酸探针检测蓝舌病,牛传染性鼻气管炎鸡马立克病,猪伪狂犬病、犬瘟热、传染性喉气管炎等病毒感染的报道。 Dorman,M,A在1985年首先报道了利用生物素标记的IBRV—DNA的HindⅢ酶切片段可检测出10pg(10~(-11)g)IBRV—DNA。随后,Dunn,D.C和Pacciarini,L以及Brunner,D也相继作了报道。我们用~(32)P标记的IBRV—DNA全基因组做为核酸探针,进行了一系列的研究,初步结果表明,我们